肖彭瑩，黃國(guó)紅，王麗君，孫衛(wèi)國(guó)，張靈霞，侯江厚△

1.昆明市婦幼保健院婦女保健部，云南昆明 650013;2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核病研究所，北京 100091

丙型肝炎病毒(HCV)的抗體檢測(cè)目前仍是診斷HCV慢性感染和進(jìn)行獻(xiàn)血員篩查的主要方法。隨著技術(shù)方法的進(jìn)步，HCV抗體檢測(cè)試劑已發(fā)展到第三代，抗原主要組成為結(jié)構(gòu)區(qū)C蛋白、非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3及NS5區(qū)重組抗原，雖然檢測(cè)的靈敏度得到很大提高，但由于抗原序列包含有較多非保守性序列，導(dǎo)致特異度不強(qiáng)[1]，需要通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選特異度強(qiáng)優(yōu)勢(shì)保守抗原序列。同時(shí)HCV感染具有異質(zhì)性特點(diǎn)，存在不同的基因型和亞型，同一型各片段抗原性存在差異，其相應(yīng)的抗體在體內(nèi)出現(xiàn)的時(shí)間、持續(xù)狀態(tài)及意義有一定的差別[2]，在進(jìn)行抗原篩選時(shí)，從我國(guó)的主要基因型1b、2a 和 6a 出發(fā)，從不同HCV 基因序列不同片段中挑選優(yōu)勢(shì)的編碼抗原，是進(jìn)行抗體檢測(cè)成功的關(guān)鍵。原核系統(tǒng)因?yàn)樽陨淼娜毕?，在重組外源蛋白時(shí)，存在表達(dá)量低和容易形成包涵體的缺點(diǎn)，二硫化物異構(gòu)酶 DsbC 作為伴侶分子，不但可以提高重組蛋白的正確折疊，促使外源蛋白可溶性形式存在，還能提高目的蛋白的表達(dá)水平和生物活性[3]。在本研究中，從HCV的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白中，通過(guò)生物信息學(xué)的方法，篩選出盡可能多并且特異度強(qiáng)的抗原表位，進(jìn)行串聯(lián)形成抗原肽，在原核系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行重組表達(dá)，同時(shí)以DsbC 作為融合分子進(jìn)行融合表達(dá)，純化兩組蛋白，評(píng)價(jià)兩組抗原融合肽在HCV 感染者血清診斷中的靈敏度和特異度，評(píng)價(jià) DsbC 蛋白作為伴侶分子在重組抗原血清學(xué)診斷上提高其靈敏度、特異度和生物活性中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 原核表達(dá)載體pET-DsbC、pET-28a 和宿主感受態(tài)BL21(DE3)由解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心(下稱八中心)實(shí)驗(yàn)室制作保存；限制性內(nèi)切酶 NdeⅠ、HindⅢ和XhoⅠ及T4 DNA 連接酶均購(gòu)自美國(guó) NEB 公司。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 凝膠回收和PCR產(chǎn)物回收試劑盒為國(guó)產(chǎn)天根生物科技公司產(chǎn)品；His標(biāo)簽親和樹脂購(gòu)為GE公司產(chǎn)品，自行灌裝純化柱；山羊抗人IgG(HRP標(biāo)記)為索萊寶生物公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京飛凱生物技術(shù)公司。100份HCV陽(yáng)性血清來(lái)源于昆明市婦幼保健院和八中心血液科血清庫(kù)。100份HCV陰性血清(血液抗-HCV陰性；血液HCV RNA陰性)來(lái)源于八中心體檢中心。ELISA法嚴(yán)格按照生物安全有關(guān)規(guī)定操作，遵循實(shí)驗(yàn)室操作的常規(guī)規(guī)定。

1.2方法

1.2.1HCV 優(yōu)勢(shì)抗原表位信息學(xué)篩選策略 HCV 病毒核心蛋白C、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS4和NS5區(qū)擁有保守的免疫顯性區(qū)域[4]，其中HCV核衣殼蛋C與NS3蛋白在HCV多種基因型中最為保守[5]。以我國(guó)HCV主要基因型1b(GenBank:ACJ37239.1)、2a(GenBank:AGZ91309.1)、 6a(GenBank:BBH 48831.1) 型為分析對(duì)象，綜合考慮親水性、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)，采用 Emini Surface Accessibility Prediction、Karplus & Schulz Flexibility Prediction、Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity和 Parker Hydrophilicity Prediction 等算法篩選優(yōu)勢(shì)表位，通過(guò)在線 Blast 分析序列的保守性，剔除特異度低的部分，結(jié)合文獻(xiàn)[6-8]，選取HCV的C蛋白和NS3蛋白的部分序列為主要骨架，加入NS4和NS5優(yōu)勢(shì)抗原肽段組成待檢測(cè)的抗原肽，在短肽之間加入GSG或者AAY進(jìn)行串聯(lián)，命名為P367。序列提交北京華大基因進(jìn)行合成，對(duì)應(yīng)的核酸N端加入限制性酶切位點(diǎn)HindⅢ-NdeⅠ，C端加入終止密碼子TAA和限制性酶切位點(diǎn)XhoⅠ序列，合成編號(hào)為WHC2112223。

1.2.2pET-P367、pET-DsbC-P367表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將合成的克隆載體pUC-P367菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取克隆載體，然后分別以限制性內(nèi)切酶HindⅢ與XhoⅠ、NdeⅠ與Xhol進(jìn)行雙酶切，用DNA電泳凝膠回收試劑盒回收融合基因片段P367，將回收的雙酶切片段分別與對(duì)應(yīng)雙酶切的表達(dá)載體pET-DsbC、pET-28a進(jìn)行連接，熱激法轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，涂含有卡納抗性固體平板37 ℃隔夜培養(yǎng)，挑選灰白色光滑菌落轉(zhuǎn)接到含有50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中激活，選取陽(yáng)性克隆送華大基因進(jìn)行測(cè)序以確保閱讀框的正確。

1.2.3HCV P367抗原肽原核重組表達(dá)與純化 將篩選到的陽(yáng)性克隆菌株pET-P367、pET-DsbC-P367接種于LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。然后按照1∶50的比例接種到100 mL LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)3～4 h；再按照1∶20的比例接種到1 000 mL LB培養(yǎng)基中(含卡納霉素50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)到吸光度(A600)值為0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，終濃度為0.5 mmol，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩誘導(dǎo)7 h，收集1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min。沉淀重懸于400 μL的1×SDS上樣緩沖液中，沸水浴5 min，取20 μL進(jìn)行12% SDS-PAGE膠電泳。

4 ℃ 條件下以 6 000 r/min 離心收集表達(dá)菌體，1×PBS懸浮混勻冰育，置于冰水狀態(tài)下進(jìn)行超聲碎菌。高速離心分離上清和沉淀，由于P367以包涵體形式存在，采用柱上復(fù)性復(fù)性的方法對(duì)P367進(jìn)行純化，取包涵體以1% triton-100洗滌兩次，以7 mol尿素+PBS 充分溶解包涵體，高速離心后取上清以2 mL/min 緩慢結(jié)合鎳離子螯合的親和層析柱，緩慢柱流速PBS溶液進(jìn)行柱上復(fù)性，以50 mmol咪唑+PBS洗脫除去雜蛋白、以120 mmol咪唑+PBS 洗脫收集復(fù)性后的融合肽 P367；取 DsbC-P367 融合蛋白表達(dá)后超聲上清，同樣以鎳離子螯合的親和層析柱進(jìn)行親和純化，以80 mmol咪唑+PBS洗脫除去雜蛋白、以150 mmol咪唑+PBS洗脫收集復(fù)性后的融合肽DsbC-P367。兩組純化的樣品分別取20 μL 變性后進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳分析融合蛋白的純度，終產(chǎn)品以水透析除去咪唑和鹽離子，冰干保存。

1.2.4DsbC-P367、P367多表位抗原融合肽抗原性Western blot分析 純化后的DsbC-P367、P367蛋白以PBS 配制成1 mg/mL的母液，各取5 μL煮沸變性，12% SDS-PAGE電泳后半干法轉(zhuǎn)移(恒壓20 V，30 min)至硝酸纖維系膜(NC膜)上。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，37 ℃條件下與1∶50稀釋HCV陰陽(yáng)性血清后孵育1 h，以PBS震蕩洗膜5次，再以HRP標(biāo)記的羊抗人IgG孵育1 h，同樣震蕩洗滌5次，ECL暗室自動(dòng)曝光顯影分析DsbC-P367、P367蛋白的抗原性及其特異度。

1.2.5HCV兩組融合肽DsbC-P367、P367最佳包被濃度 為了驗(yàn)證兩組不同融合肽在血清HCV-IgG抗體檢測(cè)的最佳包被濃度，采用濃度等比梯度對(duì)兩組重組融合肽進(jìn)行稀釋，以用碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白DsbC-P367、P367稀釋為1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 μg/mL，分別取100 μL包被酶標(biāo)板，37 ℃包被2 h，除去包被液，加入150 μL封閉液37 ℃封閉2 h，甩干封閉液，洗滌5次；每孔加PBS和待測(cè)稀釋血清各50 μL，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行孔，空白孔不加液體，37 ℃溫育30 min，洗滌5次，拍干；加入HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(1∶5 000)，37 ℃ 孵育20 min后洗滌；每孔加入底物液A和B各50 μL，輕拍混勻，37 ℃ 避光顯色10 min；加入2 mol/L H2SO4終止液50 μL進(jìn)行終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔A值，選用P/N 值最大 (P為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清A450;N為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清A450)時(shí)的條件為最佳反應(yīng)條件。

1.2.6HCV兩組融合肽DsbC-P367、P367血清抗體間接ELISA差異分析 為了驗(yàn)證兩組不同融合肽在血清HCV-IgG抗體檢測(cè)的差異性和可行性，采用間接ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。血清樣本為經(jīng)過(guò)“金標(biāo)準(zhǔn)”篩選的陰陽(yáng)性血清，同時(shí)以成熟的商品化試劑盒進(jìn)行比較。將DsbC-P367、P367兩種融合肽以包被緩沖液均稀釋成10 μg/mL，ELISA每孔包被100 μL。ELISA實(shí)驗(yàn)步驟同方法1.2.5。

1.2.7DsbC-P367、P367間接ELISA特異度、靈敏度和符合率分析 將100份明確HCV陽(yáng)性血清和100份明確HCV陰性血清以商品化HCV-IgGELISA法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行復(fù)檢，操作方法嚴(yán)格遵照說(shuō)明書進(jìn)行，同上述實(shí)驗(yàn)同批同時(shí)操作，檢測(cè)A值，分析獲得的兩組重組蛋白用于ELISA血清抗體檢測(cè)中體現(xiàn)出的靈敏度、特異度和相對(duì)試劑盒的符合率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；散點(diǎn)圖用GraphPad Prism 5.00軟件繪制；ELISA測(cè)定的A值分布進(jìn)行Wilcox檢驗(yàn)；cut off值以陰性結(jié)果A值均值2.1倍作為臨界值。用McNemer檢驗(yàn)及Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同檢測(cè)方法的一致性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HCV優(yōu)勢(shì)抗原表位生物信息學(xué)分析與篩選、串聯(lián) 以我國(guó)HCV的1b、2a和6a型為分析對(duì)象，通過(guò)對(duì)其抗原優(yōu)勢(shì)表位的預(yù)測(cè)，結(jié)合BLAST保守性分析，選擇的抗原序列為：HCVC(1b) aa1～60、NS3(1b) aa1201～1301、NS4A(1b)aa1～30、NS4A(2a) aa1～30、NS5A(2a) aa2272～2331等5個(gè)抗原區(qū)域作為優(yōu)勢(shì)抗原表位組合框架，并在合成的C端補(bǔ)充加入NS3(1b) VDFIPVEGDPTTMR、Core(6a)PALSTGLIH、NS4A(2a)SIIGRLHINQRTVVAP、NS4B(1b)SRGNHVSPTHYVPESDA、E2(1b)YEVRNVSGVYH 5種抗原短肽，短肽之間以AAY或GSG相連。合成的序列命名為P367，核酸兩端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和終止密碼子序列。

2.2DsbC-P367、P367融合肽表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 全序列合成的克隆載體pUC-P367分別以限制性內(nèi)切酶HindⅢ與XhoⅠ、NdeⅠ與XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，UV燈下觀察片段大小，融合肽P367含有367個(gè)aa，對(duì)應(yīng)核酸大小為1 100 bp(圖1)，兩組雙酶切產(chǎn)生的核酸片段大小均在1 100 bp，符合預(yù)期。將雙酶切的核酸片段P367進(jìn)行膠回收后，克隆到原核表達(dá)載體pET-DsbC、pET-28上。

注：M為標(biāo)志物；1為雙酶切載體pUC-P367(HindⅢ與XhoⅠ)；2為雙酶切載體pUC-P367(NdeⅠ與XhoⅠ)。

2.3HCV優(yōu)勢(shì)表位融合肽DsbC-P367、P367原核重組表達(dá)與純化 對(duì)DsbC-P367、P367兩組融合蛋白進(jìn)行小樣表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組蛋白在原核系統(tǒng)均獲得高效表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量分別為43.0×103與65.0×103(圖2、3)，與預(yù)期一致。超聲破碎后發(fā)現(xiàn)，P367融合肽主要以包涵體形式存在，而DsbC-P367融合肽大部分以可溶形式存在超聲上清中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期，對(duì)兩組重組蛋白分別采用包涵體柱上復(fù)性和上清親和純化，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，經(jīng)親和純化后，P367融合肽純度分別為92%；DsbC-P367融合肽純度為90%(圖4、5)，符合后續(xù)血清學(xué)抗體 ELISA 實(shí)驗(yàn)要求。

注:M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)的全菌體；2為誘導(dǎo)P367全菌體蛋白；3為超聲破碎后上清；4為超聲破碎后沉淀。

注:M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)的全菌體；2為誘導(dǎo) DsbC-P367 全菌體蛋白；3為超聲破碎后上清；4為超聲破碎后沉淀。

注:M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為復(fù)性后P367融合肽。

注:M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為親和純化后DsbC-P367融合肽。

2.4DsbC-P367、P367 融合肽抗原性 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 純化后 DsbC-P367、P367 兩組融合肽均可與 HCV-IgG陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)初步鑒定了兩組蛋白的抗原性。實(shí)驗(yàn)中以 HCV 陽(yáng)性血清作為一抗，HRP 標(biāo)記的山羊抗人 IgG 為二抗，暗室曝光后在 NC 膜出現(xiàn)單一的條帶，分子量同預(yù)期一致(圖 6)，陰性對(duì)照無(wú)條帶顯現(xiàn)。

注:1為P367；2、3為DsbC-P367；4為無(wú)關(guān)蛋白陰性對(duì)照。

2.5HCV 兩組融合肽DsbC-P367、P367最佳包被濃度確定 通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組不同融合肽在血清 HCV-IgG抗體檢測(cè)的最佳包被濃度，對(duì)抗原濃度進(jìn)行等比梯度稀釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定DsbC-P367、P367最佳包被濃度均為10 μg /m L，P/N 值最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DsbC-P367、P367蛋白最佳包被濃度的確定

2.6DsbC-P367、P367血清抗體間接ELISA實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果 以獲得的兩組融合肽作為包被抗原建立間接法ELISA試劑，分別對(duì)明確HCV陽(yáng)性樣本和陰性樣本各100份進(jìn)行檢測(cè)。參照文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中cut off值設(shè)為陰性血清的A值均值2.1倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsbC-P367陽(yáng)性樣本A值分布為(1.680±0.068)；P367陽(yáng)性樣本A值分布為(1.574±0.047)；陰性血清樣本A值分布為(0.094±0.009)；cut off值為0.197。采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析，McNemer檢驗(yàn)顯示：DsbC-P367融合肽與確定陽(yáng)性樣本比較，P=1.00，Kappa=0.950；P367融合肽與確定陽(yáng)性樣本比較，P=1.00，Kappa=0.910。采用商品化試劑盒檢測(cè)對(duì)樣本血清進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果檢出陽(yáng)性92份，假陽(yáng)性7份，其McNemer檢驗(yàn)P=1.00，Kappa=0.910。所得數(shù)據(jù)分析見(jiàn)圖7。

圖7 DsbC-P367與P367融合肽在HCV陽(yáng)性

2.7DsbC-P367、P367間接ELISA特異度、靈敏度與符合率 間接ELISA測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DsbC-P367與P367針對(duì)明確陽(yáng)性血清檢出樣本數(shù)分別為96、90，其靈敏度分別為96.0%與90.0%；相對(duì)于陰性對(duì)照血清檢出的假陽(yáng)性均為0，其特異度均為100.0%，提示DsbC-P367與P367兩種融合肽均可作為診斷抗原用于血清學(xué)抗體診斷。采用商品化試劑盒檢測(cè)對(duì)樣本血清進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果檢出陽(yáng)性92份，假陽(yáng)性7份，所得數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表2。結(jié)果表明，HCV DsbC-P367抗原融合肽在血清學(xué)檢測(cè)中靈敏度和特異度均優(yōu)于商品試劑盒，而P367抗原融合肽的檢測(cè)效果于目前市場(chǎng)上檢測(cè)試劑盒檢出率和靈敏度大致相當(dāng)。

表2 DsbC-P367、P367特異度、靈敏度與符合率比較

3 討 論

目前直接抗病毒(DAAs)治療方法對(duì)抗HCV感染非常有效，精確診斷和實(shí)驗(yàn)室快速鑒別是實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2030年消除病毒性肝炎目標(biāo)的關(guān)鍵。HCV-RNA檢測(cè)作為HCV感染臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)已得到了廣泛地認(rèn)可，但由于其價(jià)格昂貴，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且不適用于HCV感染的初篩實(shí)驗(yàn)，血清學(xué)檢測(cè)任然具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[9]。由于HCV是一種高度異質(zhì)性的RNA病毒，不同地區(qū)不同基因型的HCV毒株，在核苷酸序列和氨基酸序列上都有很大的不同，從而會(huì)影響到相應(yīng)蛋白的性質(zhì)和功能。我國(guó)HCV主要流行亞型為1b、2a和6a[10]。需要綜合考慮三種主要流行亞型的優(yōu)勢(shì)抗原表位去提高抗體檢測(cè)的敏感性，目前常用的抗體檢測(cè)試劑都使用3～6種重組抗原或合成肽，缺點(diǎn)是增加了非特異性而出現(xiàn)較多假陽(yáng)性，這就需要通過(guò)多表位HCV診斷抗原的篩選加上除去非保守氨基酸序列來(lái)完成。

HCV核心多肽(C)抗原性較強(qiáng)，在HCV感染早期即可產(chǎn)生抗核心抗體[11]在各種基因型HCV中最為保守，其核心區(qū)的優(yōu)勢(shì)表位主要集中在氨基端[12]，選擇1b型N端1～60位氨基酸，基本包含了核心蛋白大部分疏水區(qū)和幾乎所有的重要表位；HCV感染者體內(nèi)抗-NS3出現(xiàn)較早并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，NS3蛋白具有強(qiáng)抗原性，在能產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體[13]，選擇1b型NS3蛋白的1 201～1 301位氨基酸；早期研究發(fā)現(xiàn)，1型的NS4抗原對(duì)于2、3型抗-HCV抗體檢測(cè)缺乏敏感性[14]，在選擇抗原時(shí)加入了2a型的NS4A、NS4B；NS5a區(qū)的高免疫原區(qū)位于氨基酸殘基2182～2343的位置(162aa)[2]，通過(guò)在線Blast剔除非保守序列后選擇2 272～2 331表位氨基酸抗原。為了提高抗體檢測(cè)的靈敏度，在抗原選擇時(shí)，通過(guò)軟件結(jié)合多種篩選算法，篩選出5組優(yōu)勢(shì)抗原短肽，放置在合成序列的C端，極大提高了檢測(cè)的靈敏度。實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)也已經(jīng)驗(yàn)證，在重組抗原中含有這5種優(yōu)勢(shì)短肽時(shí)，檢測(cè)的靈敏度從86.0%提高到92.0%。

在原核重組時(shí)，蛋白質(zhì)折疊是生物功能和重組蛋白生產(chǎn)的核心，空間結(jié)構(gòu)正確的形成是重組蛋白生物活性的保證，DsbC蛋白作為二硫鍵異構(gòu)酶，在原核重組的過(guò)程中扮演重要角色，不僅可以促進(jìn)二硫鍵正確的配對(duì)，還可以讓錯(cuò)誤折疊的蛋白重新異構(gòu)化形成正確的空間構(gòu)象[15]。PALENZUELA等[16]推論NS3蛋白所表現(xiàn)出的高免疫原性很可能是由構(gòu)象型表位引起。為了促使NS3區(qū)構(gòu)象型空間表位的形成和保持，在融合表達(dá)HCV抗原時(shí)，融合肽大都選擇GST或者Trx蛋白[7,17]，它們?cè)谔岣呖乖扇苄陨峡赡芷鸬揭恍┳饔茫鄬?duì)于目的蛋白生物活性的提高和保持，明顯DsbC蛋白作用更為優(yōu)勢(shì)。其不僅提高了目的蛋白P367的表達(dá)量和可溶性，同時(shí)，DsbC-P367的檢測(cè)靈敏度從融合前的90.0%提高到96.0%。

研究已證實(shí)，單一結(jié)構(gòu)抗原在血清學(xué)抗體診斷上明顯靈敏度不足，檢測(cè)抗原來(lái)源于同一基因型的片段也會(huì)制約到其他基因型及不同序列HCV感染患者血清標(biāo)本的檢測(cè)；不同基因型、同一基因型的不同基因亞型，甚至不同分離株之間由于基因序列的差異都存在有不同的免疫反應(yīng)性，本課題通過(guò)信息學(xué)預(yù)測(cè)與篩選獲得的多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域結(jié)合優(yōu)勢(shì)抗原表位短肽，彌補(bǔ)了目前存在的靈敏度不高的問(wèn)題，在特異度上相對(duì)于現(xiàn)有的試劑盒也明顯改善了很多，對(duì)100份陰性血清檢測(cè)，特異度達(dá)到100.0%。利用DsbC蛋白的伴侶分子功能，使得檢測(cè)的靈敏度從90.0%提高到96.0%，并且純化簡(jiǎn)單，重復(fù)好，優(yōu)于商品試劑盒。