葉莉莎，張 挺，廖 聰，李婷婷，田振東，胡 敏*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)是嚴(yán)重威脅反芻動(dòng)物健康的消化道寄生線蟲之一[1-4]。目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的防制主要依賴藥物治療，但耐藥現(xiàn)象頻發(fā)，因此對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗的研發(fā)刻不容緩[5-7]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲氨基肽酶H11是目前從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)分離到的最好的疫苗候選抗原之一，存在大量的抗原表位[8-9]。而體壁蛋白Hc23也能刺激宿主產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用[10]。已有研究表明，應(yīng)用大腸桿菌[11-14]、秀麗隱桿線蟲[15-16]和昆蟲細(xì)胞[17]等多種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗原分子的效果不佳，無(wú)法達(dá)到預(yù)期的免疫保護(hù)作用，甚至沒有免疫效果。

目前，植物表達(dá)寄生蟲抗原的研究報(bào)道日益增多[18-22]。植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源蛋白的折疊和組裝上跟動(dòng)物更為相似，從而具有與動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物相似的生物活性和免疫原性；其糖基化作用也是在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器上進(jìn)行復(fù)雜的糖基化修飾以及額外的果糖、木糖等殘基修飾，從而避免了糖基化修飾缺失而造成的生物學(xué)活性降低[23-24]。植物瞬時(shí)表達(dá)是利用改造的植物病毒載體，將外源基因整合到病毒載體后侵染植物，外源基因在病毒載體啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)[25]。應(yīng)用植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗原可以為其疫苗的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株及主要試劑捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hacon-5蟲株來(lái)自墨爾本大學(xué)Robin B.Gasser實(shí)驗(yàn)室；大腸桿菌菌株DH5α等由本實(shí)驗(yàn)室保存，pH7lic-EGFP質(zhì)粒載體、根癌農(nóng)桿菌菌株(GV3101)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林學(xué)院田振東教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin 2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自Axygen公司；DEPC原液、平衡鹽溶液Earle’s Balanced Salt Solution(10×)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青霉素鏈霉素兩性霉素混合液Antibiotic-Antimycotic(100×)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

本氏煙草(N.benthamiana)種子由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林學(xué)院田振東教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。本氏煙草種植于恒溫生長(zhǎng)室內(nèi)，種子播種于育苗盤中，90%濕度催芽，出苗后2周進(jìn)行移栽，待緩苗后進(jìn)行施肥和灌水等日常管理。幼苗在25℃、16 h光照、8 h黑暗的條件下生長(zhǎng)4～5周。

1.2 構(gòu)建表達(dá)載體pH7dNLSAP10op并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲氨基肽酶基因Hc-ap-10進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將其基因序列(KU710359.1)、氨基酸序列(AML39764.1)及pH7lic-EGFP載體提交擎科生物，針對(duì)煙草偏愛密碼子序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到pH7-EGFP-AP10op。設(shè)計(jì)帶有pH7lic-EGFP載體同源臂和兩端添加核定位信號(hào)NLS的引物NLS-EGFP-NLS-F和NLS-EGFP-NLS-R(表1)，進(jìn)行NLS-EGFP-AP10op-NLS片段的擴(kuò)增，對(duì)載體片段和NLS-EGFP-AP10op-NLS進(jìn)行同源重組，得到pH7dNLSAP10op質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.3 構(gòu)建表達(dá)載體pH7dNLSHc23并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲RNA并合成cDNA，根據(jù)Hc23的序列(CDJ92660.1)設(shè)計(jì)引物Hc23-F和Hc23-R(表1)，PCR擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，將回收得到的DNA片段Hc23與pTOPO-Blunt Simple載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)入DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，-80℃保存。

設(shè)計(jì)帶有EGFP同源臂和核定位信號(hào)NLS的引物NLS-EGFP-NLS-F和EGFP-R(表1)，進(jìn)行NLS-EGFP片段的擴(kuò)增。然后設(shè)計(jì)引物NLS-Hc23-F和NLS-EGFP-NLS-R(表1)對(duì)Hc23序列的膜外區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到Hc23-NLS片段。最后將載體片段、NLS-EGFP片段和Hc23-NLS片段進(jìn)行同源重組得到pH7dNLSHc23質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。

1.4 本氏煙草的瞬時(shí)表達(dá)將pH7dNLSAP10op和pH7dNLSHc23根癌農(nóng)桿菌在LB平板培養(yǎng)基(Spe+和Rif+)上活化，28℃靜置培養(yǎng)2 d。刮取劃線菌接入10 mL LB液體培養(yǎng)基(含Kan+和Rif+)，28℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)至D600 nm約為1.0，4 000 r/min離心10 min，收集根癌農(nóng)桿菌沉淀。配置一定量含有2×10-4mol/L乙酰丁香酮，0.01 mol/L MgCl2，pH 5.6的0.01 mol/L MES溶液，洗菌體并重懸。2 d后測(cè)D600 nm值，調(diào)整pH7dN-LSAP10op和pH7dNLSHc23農(nóng)桿菌懸浮液的D600 nm約為1.5。室溫靜置3 h，用1 mL無(wú)針頭注射器以點(diǎn)注射方式(直徑1 cm左右)在植物葉片上注射，24 h后熒光顯微鏡下觀察葉片綠色熒光。

1.5 煙草葉片蛋白的提取和Western blot驗(yàn)證采用液氮磨樣，取約0.1 g樣品粉末加入800 μL蛋白裂解液(0.05 mol/L Tris,pH7.4,0.15 mol/L NaCl,1 mL/L Triton X-100,1 g/L sodium deoxycholate,0.1 g/L SDS)，同時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)加10 μL蛋白酶抑制混合劑，充分混勻，10 000×g/min，4℃離心5 min。用12.5%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE后，采用三明治式90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h；5%的脫脂奶粉封閉4℃過夜；TBST洗滌5次，5 min/次；用His抗體(1∶3 000)室溫孵育30 min后，TBST洗滌5次；用鼠源二抗(1∶3 000)室溫孵育30 min后，TBST洗滌5次；采用化學(xué)發(fā)光顯色法進(jìn)行檢測(cè)，通過Bio-rad自動(dòng)曝光成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 pH7dNLSAP10op表達(dá)載體的構(gòu)建捻轉(zhuǎn)血矛線蟲氨基肽酶基因Hc-ap-10經(jīng)生物信息學(xué)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，結(jié)果顯示Hc-ap-10無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)?？紤]到目的基因的序列較長(zhǎng)，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大，可能不利于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲抗原在煙草葉片中表達(dá)，所以將Hc-ap-10基因進(jìn)行了針對(duì)煙草偏愛密碼子的基因優(yōu)化，即AP10op，并與pH7lic-EGFP載體連接得到pH7-EGFP-AP10op。在表達(dá)目的基因的兩端添加核定位信號(hào)NLS，擴(kuò)增NLS-EGFP-AP10op-NLS目的片段，預(yù)期大小為3 695 bp，電泳條帶與預(yù)期符合(圖1)，最后成功構(gòu)建了表達(dá)載體pH7dNLSAP10op，試圖將外源表達(dá)的膜蛋白表達(dá)在煙草葉片的細(xì)胞核上。

M.DNA Marker；1～3.NLS-EGFP-AP10op-NLS

2.2 pH7dNLSHc23表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)生物信息學(xué)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，表明Hc23基因編碼的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)序列中1～25 aa為信號(hào)肽跨膜區(qū)，因此決定對(duì)Hc23的膜外區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。分別設(shè)計(jì)引物對(duì)NLS-EGFP片段和Hc23-NLS片段進(jìn)行擴(kuò)增，NLS-EGFP片段為788 bp，Hc23-NLS片段為540 bp，凝膠電泳結(jié)果顯示條帶符合預(yù)期(圖2)。最后連接載體片段，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pH7dNLSHc23。

M.DNA Marker；1,2.NLS-EGFP；3,4.Hc23-NLS

2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pH7dNLSAP10op表達(dá)及Western blot檢測(cè)將pH7dNLSAP10op在侵染煙草葉片24 h后，通過熒光顯微鏡觀察蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示進(jìn)行密碼子優(yōu)化并添加了核定位信號(hào)的AP10op蛋白能夠在煙草葉片的細(xì)胞核中成功表達(dá)(圖3A,B)，證明核定位信號(hào)的確能發(fā)揮將外源膜蛋白表達(dá)在植物細(xì)胞核的作用。稱取一定量的煙草葉片在液氮中研磨成粉末狀并用提取緩沖液處理后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)可以成功檢測(cè)到AP10op蛋白的條帶(圖3C)。

A.pH7dNLSAP10op的表達(dá)(×1 000)；B.pH7dNLSAP10op的表達(dá)(×400)；C.Western blot檢測(cè)pH7dNLSAP10op的表達(dá)

2.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pH7dNLSHc23表達(dá)及Western blot檢測(cè)pH7dNLSHc23構(gòu)建成功后侵染本氏煙草葉片，24 h后采集葉片，于熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Hc23表達(dá)量較高且主要表達(dá)在植物的細(xì)胞核內(nèi)(圖4A,B)。Hc23雖然沒有經(jīng)過密碼子優(yōu)化，但在本氏煙草細(xì)胞核中的表達(dá)量達(dá)到了與AP10op相當(dāng)?shù)乃?。將pH7dNLSHc23侵染24 h 后的煙草葉片處理后進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，成功檢測(cè)到Hc23的目的條帶，證明Hc23蛋白成功表達(dá)在煙草葉片細(xì)胞中(圖4C)。

A.pH7dNLSHc23的表達(dá)(×1 000)；B.pH7dNLSHc23的表達(dá)(×400)；C.Western blot檢測(cè)pH7dNLSHc23的表達(dá)

3 討論

本試驗(yàn)利用植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲保護(hù)性抗原，相比于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)需要幾個(gè)月才能獲得第一代轉(zhuǎn)化植株，瞬時(shí)表達(dá)可以通過向植物細(xì)胞傳遞比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化整合到宿主基因組中的T-DNA拷貝數(shù)量要多得多的T-DNA拷貝數(shù)，來(lái)實(shí)現(xiàn)受感染組織的高水平表達(dá)[26]。因此，植物表達(dá)系統(tǒng)的瞬時(shí)表達(dá)具有簡(jiǎn)單、快速、周期短、效率高等特點(diǎn)[27]，被廣泛用于外源基因的表達(dá)[28]，為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化提供了一種方便的替代方法。本氏煙草是最廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的宿主，不僅可以作為一種研究工具[29-31]，而且還作為大規(guī)模生產(chǎn)商業(yè)藥用蛋白質(zhì)的表達(dá)平臺(tái)[32]。

寄生蟲抗原基因在植物中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，密碼子的優(yōu)化對(duì)蛋白的表達(dá)量一般都能起到積極作用。有研究發(fā)現(xiàn)用煙草表達(dá)瘧原蟲裂殖子表面蛋白時(shí)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后蛋白的表達(dá)水平提高了6倍[33]；利用本氏煙草表達(dá)同種蛋白，其表達(dá)水平較原始基因序列提高40倍[34]；在研究絳蟲疫苗的報(bào)道中，密碼子優(yōu)化也是其重組蛋白表達(dá)的重要條件之一[35-37]；同時(shí)關(guān)于蛔蟲[38]、有鉤絳蟲[39]、剛地弓形蟲[40]及瘧原蟲抗原[41-47]等在植物中表達(dá)的報(bào)道中，密碼子優(yōu)化都是提高重組蛋白表達(dá)量的重要條件之一。

構(gòu)建密碼子優(yōu)化的pH7AP10op侵染煙草葉片之后，熒光檢測(cè)結(jié)果表明目的蛋白表達(dá)在煙草細(xì)胞的細(xì)胞膜上(結(jié)果未顯示)。而目前對(duì)于植物細(xì)胞細(xì)胞膜蛋白的純化有一定難度，而植物細(xì)胞細(xì)胞核蛋白的純化相對(duì)容易，所以在表達(dá)蛋白時(shí)需要將其引導(dǎo)到植物細(xì)胞的細(xì)胞核處進(jìn)行表達(dá)。我們選擇在目的蛋白的N、C兩端添加核定位信號(hào)NLS，成功將目的蛋白pH7dNLSAP10op表達(dá)在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞核上。

本試驗(yàn)中，構(gòu)建捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體壁細(xì)胞蛋白Hc23的pH7dNLSHc23表達(dá)載體，Hc23基因雖然未經(jīng)密碼子優(yōu)化，但是其表達(dá)水平卻相對(duì)較高，分析認(rèn)為可能是由于Hc23蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較小，在煙草細(xì)胞中表達(dá)時(shí)受到的限制較AP10小，所以其表達(dá)水平相對(duì)較高。因此，我們推測(cè)密碼子優(yōu)化雖然有利于蛋白的高效表達(dá)，但是其可能對(duì)某些相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小的蛋白不是必需的。