龐 威，樊 杰，孫繼澤，王艷娟，林禹欣，郭英俠，魯玉嬌，閆勝楠，紀(jì)天一，李 坤，趙理鵬，隋國奇

（吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司·吉林 通化·134000）

消風(fēng)止癢顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十五冊，標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-2975-98，處方中包括防風(fēng)、蟬蛻、地骨皮、蒼術(shù)（炒）、亞麻子、當(dāng)歸、地黃、木通、荊芥、石膏和甘草十一味藥材。防風(fēng)為方中君藥，是傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Furcz.)Schischk的干燥根，辛、甘，微溫。歸膀胱、肝、脾經(jīng)。具有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙的功效。用于感冒頭痛，風(fēng)濕痹痛，風(fēng)疹瘙癢，破傷風(fēng)[1]。主要化學(xué)成分包括色原酮、香豆素、多糖以及揮發(fā)油等[2]。其中，色原酮是其主要活性成分，包括3'-O-當(dāng)歸酰亥茅酚、3'-O-乙酰亥茅酚、亥茅酚、亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷等[3-4]。

原標(biāo)準(zhǔn)中收載了防風(fēng)的薄層色譜鑒別項，但方法中未明確規(guī)定溶媒量、濾液濃縮體積、對照藥材取樣量及點樣量等參數(shù)，而且供試品溶液的制備存在黏度大、點樣困難等問題。優(yōu)化后的方法可靠，易于操作，可作為消風(fēng)止癢顆粒中防風(fēng)薄層鑒別項的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 供試品

消風(fēng)止癢顆粒：吉林省紫鑫藥業(yè)有限公司，批號：E190104、E190110、E190117、E190124、E190130、E190136、E190142、E190148、E190154、E190160。

1.2 對照品及對照藥材

防風(fēng)對照藥材，批號：120947-201409，升麻素苷對照品，批號：111522－201712；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，批號：111523－201610，中國食品藥品檢定研究院。

1.3 試劑與儀器

紫外可見投射反射儀WFH-201BJ，上海精科實業(yè)有限公司；電子天平Y(jié)P1201，1/10，上海良平儀器儀表有限公司；電子天平SQP，1/10000，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；甲醇、正丁醇、氨水、丙酮、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法

取本品5g,加乙醇適量,加熱取5分鐘,放冷,濾過,濾液濃縮至適量作為供試品溶液;另取防風(fēng)對照藥材,同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗,取供試品溶液、對照藥材溶液分別點于同一含羧甲基纖維素鈉粘合劑的硅膠G薄層板上,以氯仿-醋酸乙酯(15∶4)為展開劑展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視。

2.2 消風(fēng)止癢顆粒中防風(fēng)薄層鑒別改進方法試驗

2.2.1 薄層色譜條件以三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，揮干。

2.2.2 供試品溶液制備

取本品10g，研細(xì)，加水30ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨試液50ml洗滌，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液制備

取升麻素苷對照品、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，加乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.4 對照藥材溶液制備

原位雜交結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中，miR-454-3p的表達水平顯著高于正常結(jié)腸組織。我們對原位雜交結(jié)果進行統(tǒng)計分析，分別取了5個高倍視野，計算了miR-454-3p陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中的miR-454-3p表達水平顯著高于正常結(jié)腸組織中的表達水平組間差異顯著（P＜0.05，圖1）。

取防風(fēng)對照藥材0.5g，加丙酮30ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.5 鑒別試驗

按照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液10μl、對照藥材溶液6μl及對照品溶液2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，按照2.2.1項下薄層色譜條件進行，置紫外光燈（365nm）下檢視。

結(jié)果顯示：供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。且陰性對照溶液在相應(yīng)的位置無干擾，詳見圖1。

圖1 優(yōu)化后防風(fēng)TLC圖譜

2.3 薄層色譜條件的確定

2.3.1 供試品溶液制備方法

本次研究共篩選了5個供試品溶液制備方法，包括乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法、丙酮超聲提取法、水溶解后乙醚-乙酸乙酯-水飽和正丁醇分段萃取法、水溶解后水飽和正丁醇萃取法。因本品含糖量較多，采用乙醇和丙酮直接提取法制備的供試品溶液存在粘度大、點樣量少、斑點顯現(xiàn)不清晰等問題，而采用萃取法，可以很大程度的避免上述問題，且隨著溶劑極性的增加，提取的物質(zhì)亦增多，同時考慮到方法的簡便、快捷及可操作性，最終選擇了水溶解后水飽和正丁醇萃取法作為防風(fēng)薄層鑒別的供試品溶液制備方法。

2.3.2 展開劑的篩選

根據(jù)確定的供試品溶液制備方法，篩選了如下展開系統(tǒng)：①三氯甲烷-甲醇（4∶1）；②三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）；③三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液。

結(jié)果：展開劑①和③分離效果不理想，陰性干擾；展開劑②分離效果好，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。與此同時，我們對供試品取樣量（10、15、20g）和點樣量（6、8、10μl）進行了篩選，最終確定供試品的取樣量為10g，點樣量為10μl。詳見圖2、3。

圖2 防風(fēng)鑒別取樣量考察TLC圖譜

圖3 防風(fēng)鑒別點樣量考察TLC圖譜

2.4 專屬性實驗

按照標(biāo)準(zhǔn)正文方法制備供試品溶液 （批號：E190104、E190110、E190117）、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性供試品溶液，并根據(jù)展開劑②的方法進行點樣、展開、顯色、檢視。結(jié)果：3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，詳見圖1。

2.5 耐用性實驗

2.5.1 點樣方式考察

取供試品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)正文項下方法進行試驗，考察條帶狀和圓點狀點樣方式對薄層色譜行為的影響。結(jié)果：按照上述不同點樣方式進行試驗，供試品色譜中目標(biāo)斑點分離效果均較好，無明顯變化，詳見圖1、4。

圖4 耐用性考察試驗（圓形點樣）TLC圖譜

2.5.2 不同廠家薄層板考察

考察了三個不同生產(chǎn)廠家薄層預(yù)制板：①青島海洋化工有限公司（批號：20180312）；②青島海洋化工廠分廠（批號：20171225）；③青島鼎康硅膠有限公司（批號：20160322）。結(jié)果：經(jīng)三種不同廠家生產(chǎn)的薄層預(yù)制板對比試驗，供試品色譜中目標(biāo)斑點分離效果均較好，詳見圖1（青島海洋化工有限公司）、圖5（青島海洋化工廠分廠）、圖6（青島鼎康硅膠有限公司）。

圖5 不同廠家薄層板考察TLC圖譜（青島海洋化工廠分廠）

圖6 不同廠家薄層板考察TLC圖譜（青島鼎康硅膠有限公司）

2.5.3 溫濕度條件考察

取供試品溶液按照標(biāo)準(zhǔn)正文項下方法進行試驗，考察下列不同溫濕度組合條件對薄層色譜行為的影響：①常溫常濕T：25℃RH：54%；②高溫高濕T：40℃RH：75%；③低溫低濕T：4℃RH：18%；④常溫高濕T：25℃RH：75%；⑤常溫低濕T：25℃RH：18%。

結(jié)果：按照上述不同溫濕度條件下進行試驗，溫度在4～40℃、相對濕度在18%～75%范圍內(nèi)，供試品色譜中目標(biāo)斑點分離效果均較好，無明顯變化。詳見圖1、7、8、9、10。

圖7 溫濕度條件考察（高溫高濕）TLC圖譜圖

圖8 溫濕度條件考察（低溫低濕）TLC圖譜

圖9 溫濕度條件考察（常溫高濕）TLC圖譜圖

圖10 溫濕度條件考察（常溫低濕）TLC圖譜

2.6 重復(fù)性實驗

取10批供試品，按照標(biāo)準(zhǔn)正文項下方法進行試驗。結(jié)果：10批供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，詳見圖11。

圖11 防風(fēng)鑒別重復(fù)性考察TLC圖譜

3 討論

以5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷及防風(fēng)對照藥材為對照，共篩選了5種供試品溶液制備方法、多種展開條件，通過專屬性、耐用性及10批樣品重復(fù)性實驗。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。說明本方法具有較好的專屬性、耐用性及重復(fù)性，可作為消風(fēng)止癢顆粒中防風(fēng)的薄層鑒別方法。