王森森，周林峰，鮑慧瑋，田 健*

(長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林 長春·130117)

中國是世界上肺癌負(fù)擔(dān)重的國家之一，占全球肺癌病例總數(shù)的23.7%，死亡人數(shù)為30%，在中國肺癌發(fā)病率與死亡率均位于惡性腫瘤的首位[1]。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為肺為華蓋，主氣，司呼吸，與外界空氣相連，容易受到外界六害的攻擊[2]。更容易受到空氣中漂浮物和粉末的攻擊。肺主皮毛是人體抵抗外部邪惡的最大器官，所以它很容易受到風(fēng)、冷的侵襲。熱、濕、燥、火的邪侵，影響肺的宣泄功能，導(dǎo)致肺氣不良，氣血循環(huán)衰竭通常，痰會(huì)積聚并形成腫塊。吸煙也是肺癌的重要致病因素。毒性辛辣、干燥，易耗氣、傷陰、損肺絡(luò)，導(dǎo)致氣血疲乏，并衍生痰淤阻肺絡(luò)。毒物來到體內(nèi)隨之流通。肺癌患者肺、脾、腎虛損，多選用補(bǔ)益肺腎的藥物，佐以健脾益氣。中醫(yī)治療肺癌以“祛邪扶正”為基本原則，并且要權(quán)衡“養(yǎng)正積自除”及“邪祛則正安”的關(guān)系[3]。

百合始載于本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘，平[4]。具有清心安神、養(yǎng)陰潤肺的功效。常用于陰虛燥咳，虛煩驚悸，失眠多夢[5]，是最具代表性“藥食同源”中藥材之一。百合含有甾體皂苷、甾醇、酚酸、黃酮、生物堿、多糖等成分?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)百合具有止咳化痰、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)自身免疫力等作用[6-7]。雖然也有百合治療肺癌的研究報(bào)道，但是目前對(duì)于百合治療肺癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，因而限制了其進(jìn)一步的臨床研究。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)以分析百合治療肺癌的經(jīng)驗(yàn)，并期望通過此研究，提出診治肺癌的核心成分與靶點(diǎn)，對(duì)中醫(yī)藥治療肺癌提供了有利依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 百合的活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選

使用中藥數(shù)據(jù)庫藥理平臺(tái)（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）按口服利用度OB%≥20且類藥性DL≥0.10的標(biāo)準(zhǔn)篩選出百合的有效活性化合物以及對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)。再從Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中智人選項(xiàng)中的化合物數(shù)據(jù)庫找出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的基因名稱。

1.2 肺癌疾病靶點(diǎn)的獲取

以lung cancer為關(guān)鍵詞，分別從Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgnet（https://www.disgenet.org/）找出疾病的靶點(diǎn)，建立肺癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，去除重復(fù)基因。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)的篩選與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將從兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中得到的肺癌靶點(diǎn)與TCMSP中獲得的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，使用Venn2.1.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl）對(duì)百合預(yù)測靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集并百合抗肺癌的基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫；篩選疾病與藥物的共同靶點(diǎn)并將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String(https://string-db.org/，Version 11.0)，物種選擇智人，獲取靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建。

1.4 藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用百合與肺癌交集靶點(diǎn)反向篩選有效成分，利用Ctoscape3.7.0構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)度互作分析，從中分析百合治療肺癌的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將百合抗肺癌的作用靶點(diǎn)上傳到Metascape（metascape.org）數(shù)據(jù)平臺(tái)，進(jìn)行GO分子功能（GO Molecular Functions）、GO生 物 過 程 （GO Biological Processes）、GO細(xì)胞組分（GO Cellular Components）和KEGG通路富集分析。利用微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn/）分別制作GO和KEGG富集氣泡圖及三合一條形圖。

2 結(jié)果

2.1 百合活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)以口服利用度OB≥20%且類藥性DL≥0.10為條件篩選得到百合16個(gè)化合物。其中百合的主要有效成分詳見表1。

表1 百合的活性成分

2.2 百合治療肺癌疾病靶點(diǎn)的收集

以lung cancer為關(guān)鍵詞，分別在Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgnet（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索獲取肺癌的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。兩個(gè)數(shù)據(jù)庫匯總?cè)ブ睾蠊搏@得5702個(gè)疾病靶點(diǎn)，與藥物做交集得到57個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)。利用Draw Venn diagrams （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將肺癌疾病靶點(diǎn)與百合藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入，制作Venn圖（見圖1）。

圖1 藥物和疾病Venn圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建、核心靶點(diǎn)篩選

將57個(gè)靶蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫分析后得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系,利用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)見圖2。將網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的大小按照其網(wǎng)絡(luò)度排列，有效成分的靶點(diǎn)數(shù)越多其網(wǎng)絡(luò)度越大，圖2中黃色靶點(diǎn)在靶點(diǎn)互作分析中網(wǎng)絡(luò)度較高，可能是百合治療肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 百合抗肺癌ppi網(wǎng)絡(luò)圖

表2 ppi網(wǎng)路圖中核心蛋白靶點(diǎn)

2.4 藥物-有效化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用百合與肺癌57交集靶點(diǎn)反向篩選有效成分，利用軟件tool中Network Analyzer功能對(duì)所有有效化合物進(jìn)行degree值排序。其中degree值較大的四個(gè)成分是西多糖苷、大黃素、β-谷甾醇和豆甾醇。這四種化合物可能為百合治療肺癌的關(guān)鍵化合物（圖3）。

圖3 藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)圖

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析

在Metascape基因富集分析網(wǎng)站（metascape.org）中將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入，對(duì)百合抗肺癌的潛在靶點(diǎn)57個(gè)進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG靶點(diǎn)通路注釋分析。在智人數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行KEGG通路富集分析、GO生物過程（GO Biological Processes）、GO細(xì)胞組分（GO Cellular Components）以及GO分子功能（GO Molecular Functions）。其中在GO Molecular Functions富集分析中共得到109條功能條目，在GO Biological Processes富集分析中共得到815條功能條目，KEGG通路富集分析共獲得140條信號(hào)通路，在GO Cellular Components富集分析中共得到40條功能條目。列出顯著性最高的十條（圖4~6）。生物學(xué)過程主要涉及細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分主要富集與線粒體包膜、線粒體膜、枝晶、樹突樹、突觸后等，可能作用于線粒體發(fā)揮作用。分子功能主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，醇基作為受體、激酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG結(jié)果表明百合可能作用于p53信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等來發(fā)揮抗肺癌的作用。

圖4 三合一柱狀

圖5 KEGG富集結(jié)果氣泡圖

圖6 多分類GO，Pathway富集結(jié)果氣泡圖

3 討論

肺癌（Lung cancer）是臨床發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，根據(jù)腫瘤起源的分類，它起源于肺的節(jié)段性支氣管[8]?；熓悄壳爸委煼伟┑闹饕侄沃唬熕幬锒酁榧?xì)胞毒性藥物，患者常因嚴(yán)重的不良反應(yīng)拒絕化療。有一定局限性，且伴隨各種不良反應(yīng)，患者往往不能耐受導(dǎo)致依從性差而減量、停藥甚或中止治療[9]。目前，中醫(yī)藥治療包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的前景已引起全球關(guān)注。中草藥中的許多生物活性成分顯示出較強(qiáng)的抗癌能力和較少的毒副作用[10]。周潔[11]從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)方面證實(shí)，以百合為主的復(fù)方可以抑制肺癌細(xì)胞的活性和增殖，干擾體外克隆的形成，并顯著減少體內(nèi)腫瘤的生長。此外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了以百合為主的復(fù)方通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡來殺死肺癌細(xì)胞。羅林明[12]研究結(jié)果顯示百合總皂苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲具有抑制作用，并且對(duì)細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。百合總皂苷可通過下調(diào)PCNA的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖。百合總皂苷對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用與其對(duì)Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。

在TCMSP共篩選到百合16個(gè)有效化合物和80個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，肺癌相關(guān)基因靶點(diǎn)共5702個(gè)，對(duì)預(yù)測靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，得到57個(gè)共同靶點(diǎn)。通過構(gòu)建藥物-有效成分-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，Degree值排名靠前的是西多糖苷、大黃素、β-谷甾醇，豆甾醇。這四種化合物可能為百合治療肺癌的關(guān)鍵化合物。大黃素對(duì)A549細(xì)胞有良好的殺傷作用，且呈濃度依賴性。大黃素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，大黃素處理A549細(xì)胞后，AKT和Bcl－2的p-表達(dá)顯著降低，Bad、cleaved-caspas-3的表達(dá)水平顯著升高。大黃素通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡[13]。研究[14]表明，豆甾醇能通過上調(diào)促凋亡基因表達(dá)(Bax蛋白、p53基因)、下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)、激活有助細(xì)胞凋亡的caspase-8，9蛋白表達(dá)，并通過損傷細(xì)胞DNA，從而誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞凋亡，可作為抗肺癌的潛在成分。所以藥物-有效成分-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名較高的有效化合物的藥理作用與現(xiàn)有的藥物藥理學(xué)研究觀點(diǎn)基本一致，因此，來自網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)對(duì)這些有效化合物具有一定的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)，可為進(jìn)一步研究百合治療肺癌的藥效物質(zhì)提供新的預(yù)測和研究方向參考。

通過構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用軟件Network-Analyzer功能對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行degree值排序，通過degree值的大小篩選出degree值最高的核心靶點(diǎn)，分別為TNF、TP53、MYC、JUN、ESR1。目前TNF研究較多，查艷梅[15]等在宣威肺癌患者血清及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TNF-α顯著性高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。沉默TNF-α不僅阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖及遷移，并促進(jìn)凋亡(P＜0.05)，也抑制NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路。TP53是細(xì)胞內(nèi)一種重要的腫瘤抑制基因，它是包括肺腺癌、肺鱗癌在內(nèi)的多種不同類型腫瘤中突變頻率最高（＞50%）的基因。作為“基因組的守護(hù)者”，它是細(xì)胞生長周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控，細(xì)胞凋亡、分化，DNA修復(fù)等生物學(xué)功能有關(guān)[16]。

通過GO富集分析以及KEGG通路富集分析，百合治療肺癌涉及到通路有p53信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路。MAPK信號(hào)途徑作為細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移等胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要通路之一，其異常激活也是引發(fā)肺癌化療、靶向、免疫等治療藥物產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵所在，并有望成為逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥新的干預(yù)靶點(diǎn)[17]。綜上所述，本篇文章利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了百合治療肺癌的活性成分，結(jié)果表明百合中西多糖苷、大黃素、β-谷甾醇，豆甾醇等活性成分，這些活性成分可能作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等來抑制炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等，進(jìn)而發(fā)揮抗肺癌作用。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索百合治療肺癌死潛在作用機(jī)制，相關(guān)結(jié)果表示百合可通過多靶點(diǎn)、多通路治療疾病，為新藥開發(fā)提供一定基礎(chǔ)。