賈旭爽，陳宇楊，鮑慧瑋，張亞杰(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林 長(zhǎng)春·130117)

黃芪-甘草藥對(duì)始載于《太平惠民和劑局方·卷五治諸虛》，由黃芪-甘草兩味藥組成[1]，黃芪甘溫，補(bǔ)脾肺、升清陽(yáng)，為補(bǔ)氣要品;甘草甘平，補(bǔ)脾胃，益中氣。兩藥相須配伍，取甘以守中，使補(bǔ)中益氣之力增強(qiáng)[2]。本課題以甘草、黃芪為研究對(duì)象，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)5種酶的mRNA表達(dá)，以此為甘草、黃芪藥對(duì)的臨床合理聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

甘草與黃芪兩種飲片均購(gòu)自吉林省宏檢大藥房有限公司；RNA提取試劑盒(Biomed公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶及QSCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自TransGen公司；2 xTaqPCR Master Mix(北京天根生物科技有限公司);Fast Quant第一鏈合成試劑盒(批號(hào):KRR121221，北京天根生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 儀器設(shè)備

臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海飛鴿儀器廠);實(shí)時(shí)定量PCR儀（賽默飛世爾）；酶標(biāo)儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠，體重180～220g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。這批大鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(吉)2020-0002。大鼠喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心、12h日夜節(jié)律。

2 方法

2.1 藥物的制備與配制

按《醫(yī)林改錯(cuò)》中載黃芪和甘草的規(guī)定的劑量黃芪10g、甘草2.5g進(jìn)行換算，取甘草、黃芪，浸泡1h，8倍水小火煎煮30min，過(guò)濾后濾渣6倍水再煎煮30min，兩次濾液經(jīng)70℃濃縮，最終得黃芪-甘草組濃度為0.14g/mL生藥。甘草、黃芪單煎液的濃度為0.14g/mL生藥、0.028g/mL生藥。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、甘草組、黃芪組、甘草-黃芪組，每組5只，灌胃給藥，14 d后，處死動(dòng)物并提取部分動(dòng)物肝臟-80℃保存，以備RNA檢測(cè)。

2.3 RT-PCR技術(shù)測(cè)定大鼠肝臟mRNA表達(dá)

肝 臟 中CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1酶基因的表達(dá)是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)被量化。使用Trizol試劑盒從肝臟組織中提取總RNA,RNA含量通過(guò)260nm波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)測(cè)量。每只大鼠肝藥酶的RNA樣品純度為A260/A280比值范圍在1.8～2.2。隨后，提取的肝藥酶的RNA在FastQuant第一鏈合成試劑盒的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，加入2 x TaqPCR Master Mix和特異性引物以及ddH2O進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，將5種肝藥酶和內(nèi)參基因CYC用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離辨認(rèn)，在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)各個(gè)條帶亮度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYC基因擴(kuò)增條帶表達(dá)量像素灰度值比值[3]。

2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 甘草-黃芪及單藥對(duì)大鼠肝臟5種肝藥酶mRNA基因表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比，甘草、甘草-黃芪對(duì)CYP1A2 mRNA的表達(dá)具有顯著的上調(diào)作用(P＜0.05)，而黃芪具有上調(diào)趨勢(shì),結(jié)果見圖1;甘草、黃芪、甘草-黃芪CYP2C19 mRNA的表達(dá)都具有顯著的下調(diào)作用(P＜0.01)，結(jié)果見圖2;各組對(duì)CYP2D6 mRNA的表達(dá)無(wú)影響，結(jié)果見圖3；各組對(duì)CYP2E1 mRNA的表達(dá)都具有顯著的上調(diào)作用(P＜0.01)，結(jié)果見圖4；甘草、黃芪、甘草-黃芪對(duì)CYP2C9 mRNA的表達(dá)都具有顯著的下調(diào)作用(P＜0.05)，結(jié)果見圖5。

圖1 甘草-黃芪以及2味單藥對(duì)大鼠肝臟CYP1A2酶mRNA表達(dá)影響（±s，n=5）Fig.1 Effects oflicorice–astragalus and its two componts drugs onmRNA expression of CYP1A2 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖2 甘草-黃芪以及2味單藥對(duì)大鼠肝臟CYP2C19酶mRNA表達(dá)影響（±s，n=5）Fig.2 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2C19 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖3 甘草-黃芪以及2味單藥對(duì)大鼠肝臟CYP2D6酶mRNA表達(dá)影響（±s，n=5）Fig.3 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2D6 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖4 甘草-黃芪以及2味單藥對(duì)大鼠肝臟CYP2E1酶mRNA表達(dá)影響（±s，n=5）Fig.4 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2E1 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖5 甘草-黃芪以及2味單藥對(duì)大鼠肝臟CYP2C9酶mRNA表達(dá)影響（±s，n=5）Fig.5 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2C9 enzyme in rat liver（±s，n=5）

4 討論

藥對(duì)是中醫(yī)用藥的的常見方式，藥對(duì)有的是來(lái)源于古代經(jīng)典名方的配伍，也可以是現(xiàn)代醫(yī)家的臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，藥對(duì)在用藥過(guò)程中可以單用，也是某些復(fù)方的組成單位。甘草和黃芪藥對(duì)既可以單獨(dú)成方“黃芪甘草湯”，也可以和其他藥物配成復(fù)方，不同藥物配伍使用的過(guò)程中會(huì)發(fā)生相互作用，其中一種可能是對(duì)肝藥酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而使藥物的療效和損害作用產(chǎn)生影響，研究藥物對(duì)肝藥酶的影響可以為臨床高效低毒用藥提供參考。

本研究從對(duì)肝藥酶活性、mRNA表達(dá)的層面來(lái)闡述甘草、黃芪配伍對(duì)CYP450酶的影響。結(jié)果顯示，甘草-黃芪能誘導(dǎo)CYP1A2酶和CYP2E1酶，抑制CYP2C19,CYP2C9酶。因此，如果治療過(guò)程中需要合用黃芪甘草湯或含有甘草-黃芪藥對(duì)的復(fù)方時(shí)，要注意藥物的減量或增量，提高藥物的治療效果，降低藥物治療的不良反應(yīng)發(fā)生率。