尚嬌嬌，胡 玲，方 健，葉守東，孫 敏

(安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，簡稱DN)是糖尿病患者的常見微血管并發(fā)癥之一，其主要病理變化為細胞外基質(zhì)增加、腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚等，最終導致腎小球硬化伴有腎間質(zhì)纖維化[1].Ras-related C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，簡稱Rac1)是Rho家族小GTPases的一員，被證明參與DN腎小球系膜細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，簡稱ECM)聚集[2]，高血糖、糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycated end products，簡稱AGEs)、血管緊張素II(Angiotensin II，簡稱ANG II)、生長因子等水平升高都能引起Rac1過度激活[3-5].Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription，簡稱JAK/STAT)通路是一條由細胞因子激活的信號通路，在DN中被激活，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子[6].轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，簡稱TGF-β)是一種多功能細胞因子，與增殖、凋亡、分化和纖維化有關，TGF-β作為腎小球硬化進展的中心介質(zhì)，導致腎臟中異常ECM蛋白的積累和平滑肌α-肌動蛋白的不恰當表達[7-9].由于Rac1和JAK/STAT信號均涉及ECM的形成，因此，Rac1與JAK/STAT信號通路的關系，及在系膜細胞損傷中的作用有待于深入研究，筆者通過構(gòu)建持續(xù)激活型Rac1(G12V)腎小球系膜細胞，研究Rac1激活對JAK/STAT信號通路的影響，及在系膜細胞損傷中的作用.

1 材 料

1.1 試 劑

PiggyBac(PB-FLAG)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體由安徽大學生命科學學院葉守東老師實驗室提供；Trizol，Transgene公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，白鯊生物公司；PCR反應體系，南京諾維贊公司；限制性內(nèi)切酶BgI II，Xho I，NEB公司；T4 DNA連接酶、DH5α大腸桿菌，TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，杭州倍沃醫(yī)學科技公司；DNA純化回收試劑盒，北京天根公司；瓊脂糖、DCFH-DA，美國Sigma公司；LB培養(yǎng)基，上海生工公司；引物設計，NCBI數(shù)據(jù)庫；引物合成和測序，安徽通用公司；DNA-Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試和嘌呤霉素，上海翌圣公司；小鼠腎小球系膜細胞株(mouse mesangial cell, 簡稱MES)，中國科學院典型培養(yǎng)物集存庫；DMEM，北京索萊寶公司；FBS，杭州四季青公司；NADPH氧化酶活性試劑盒，北京百奧萊博公司；小鼠TGF-β Elisa試劑盒，武漢亞科因公司；FLAG抗體、JAK2抗體、FN抗體、GAPDH抗體，武漢Proteintech公司；p-JAK2抗體，武漢ABclonal公司；STAT3抗體、p-STAT3抗體，美國Cell Signaling Technology公司；HRP二抗，上海薩博公司；羊抗兔FITC熒光二抗，武漢博士德生物公司；硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)，美國GE公司；ECL顯影液，上海天能科技有限公司.

1.2 儀 器

PCR儀、NanoDrop超微量分光光度計，美國賽默飛公司；瓊脂糖水平電泳儀，北京六一公司；超凈工作臺，新加坡ESCO；二氧化碳培養(yǎng)箱，日本松下公司；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；多功能酶標儀，美國BioTek公司；JS-1070P型化學發(fā)光成像系統(tǒng)，上海培清科技有限公司；DYY-4C型電轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀裝置，上海天能科技有限公司；徠卡TCS SP8 MP多光子共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司.

2 方 法

2.1 Rac1過表達突變體轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的構(gòu)建

Trizol法抽提系膜細胞全基因組，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，由Rac1序列合成引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG(上游引物)，

CCGCTCGAGTTACAACAGCAGGCATTTTCTCTTC(下游引物)

擴增Rac1目的基因，再以Rac1目的基因為模板，用上游引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTG，

下游引物

GAAGATCTATGCAGGCCATCAAGTGTGTGGTGGTGGGAGACGTAGCTGTTGGT

擴增出含有上游酶切位點Bgl II及下游酶切位點Xho I的突變體Rac1(G12V)目的基因.將突變體Rac1(G12V)目的基因及帶有FLAG標記的PiggyBac(PB-FLAG)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶Bgl II和Xho I雙酶切，再經(jīng)膠回收試劑盒回收大小片段，連接酶試劑盒連接大小片段，構(gòu)建突變重組載體PB-Rac1(G12V).重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組質(zhì)粒的陽性克隆，擴增后抽提質(zhì)粒，雙酶切PCR鑒定及質(zhì)粒測序鑒定.

2.2 轉(zhuǎn)染MES細胞

將含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的MES細胞，以3×105mL-1密度接種于6孔板中，放置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達到60%匯合時開始轉(zhuǎn)染.設置空白對照組、PB空載組、PB-Rac1(G12V)組.DNA-Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑復合物的配置：先取250 μL DMEM稀釋質(zhì)粒DNA并混勻；再取250 μL DMEM稀釋脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育3 min；再將稀釋好的DNA和稀釋的脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻成共500 μL的混合液，并在室溫下避光孵育20 min；最后，再加入700 μL的無血清DMEM，使其成為總體積1 200 μL的轉(zhuǎn)染試劑復合物.棄掉MES細胞的培養(yǎng)液，加入轉(zhuǎn)染試劑復合物進行轉(zhuǎn)染，6 h后棄去培養(yǎng)基每孔加入2 mL新鮮的培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染48 h后更換為含終濃度2 μg·mL-1嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)基進行篩選.篩選完成后收集細胞樣品，Western blot法對細胞進行FLAG標記驗證.

2.3 活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)及NADPH氧化酶活性測定

正常MES細胞、Rac1(G12V)組MES細胞用DMEM完全培養(yǎng)基混懸后，以3×104mL-1密度分別接種于96孔板和24孔板，每組設置3個復孔，分別用于檢測ROS、NADPH氧化酶.將細胞培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，48 h后棄去96孔板培養(yǎng)基，預冷PBS清洗2遍，每孔加10 μmol·L-1DCFH-DA 100 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗3遍，酶標儀激發(fā)光485 nm，發(fā)射光530 nm檢測熒光值.

48 h后棄去24孔板培養(yǎng)基，按照NADPH氧化酶試劑盒說明書檢測NADPH氧化酶活性.

2.4 Elisa檢測TGF-β水平

正常MES細胞、Rac1(G12V)組MES細胞以3×104mL-1密度接種于24孔板，每孔1 mL，每組設置3個復孔.48 h后收集正常組、Rac1過表達突變組的MES細胞上清于4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，取上清,按照試劑盒說明書檢測TGF-β的表達含量.

2.5 Western blot檢測

正常組、Rac1(G12V)組MES細胞以3×105mL-1密度接種于T25細胞瓶中，48 h后收集細胞于離心管中，離心棄上清，每管加入適量預冷的RIPA裂解液，超聲裂解2次，冰上靜置1 h后，于4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min.離心結(jié)束后取上清進行BCA蛋白定量測定，調(diào)蛋白濃度一致后加入上樣緩沖液混勻并在沸水浴中煮5 min，制成的樣品于-20 ℃冰箱保存.樣品進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h，TBST清洗后ECL曝光，并使用ImageJ進行灰度值分析.

2.6 免疫熒光

正常MES細胞、Rac1(G12V)組MES細胞以3×104mL-1密度接種于激光共聚焦專用細胞培養(yǎng)皿中，每孔2 mL，48 h后取出培養(yǎng)皿，棄上清，預冷PBS 清洗2遍，冰乙醇室溫固定20 min，PBS洗3遍，加入5% BSA 37 ℃封閉1 h，棄BSA，一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3遍，加入FITC標記二抗，37 ℃避光孵育1 h，DAPI孵育15 min，PBS洗3遍.每個培養(yǎng)皿中加入1 mL PBS覆蓋細胞，置于徠卡TCS SP8 MP多光子共聚焦顯微鏡下觀察并拍照.

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結(jié) 果

3.1 成功構(gòu)建Rac1(G12V)持續(xù)磷酸化突變體并在MES細胞中表達

該實驗構(gòu)建了Rac1點突變體(G12V)，圖1(a)表示PB-Rac1(G12V)質(zhì)粒中Rac1(G12V)的瓊脂糖電泳圖，圖中Rac1(G12V)的條帶在正確位置，重組構(gòu)建成功.序列比對結(jié)果顯示，全自動測序的結(jié)果中，Rac1(G12V)與GeneBank中Rac1序列僅在CDS區(qū)第35位堿基處存在差異(A-T)，其余序列完全一致.證明所構(gòu)建的Rac1持續(xù)磷酸化突變體G12V序列均完全正確.轉(zhuǎn)染成功后收集細胞，制備樣品以抗FLAG的抗體進行免疫印跡檢測Rac1突變體的蛋白表達,結(jié)果顯示(圖1(b)～(c))，Rac1突變體在轉(zhuǎn)染的MES細胞中得到很好的表達，細胞形態(tài)正常.因此，筆者成功構(gòu)建的Rac1持續(xù)磷酸化突變體可用于Rac1功能調(diào)節(jié)的進一步研究.

(a)Rac1(G12V)的瓊脂糖電泳圖；(b)轉(zhuǎn)染的MES細胞中Rac1突變體蛋白表達的免疫印跡檢測；(c)～(d)轉(zhuǎn)染的MES細胞.

3.2 Rac1(G12V)對MES中NADPH氧化酶和活性氧ROS的影響

NADPH氧化酶是一種多亞基復合體，是細胞中產(chǎn)生ROS的主要來源，Rac1是其組成亞基之一.Rac1活化可導致NADPH氧化酶活性增加，因此觀察Rac1持續(xù)激活對NADPH氧化酶活性和產(chǎn)生ROS的影響，結(jié)果如圖2所示.

與對照組相比，

圖2顯示，Rac1(G12V)組的NADPH氧化酶活性明顯高于對照組，其ROS的表達水平也明顯高于對照組.提示Rac1活化導致NADPH氧化酶活性增加并產(chǎn)生大量ROS.

3.3 Rac1(G12V)對MES中JAK2/STAT3信號通路的作用

3.3.1 Rac1(G12V)激活JAK2/STAT3信號通路

JAK2/STAT3信號通路在DN狀態(tài)下被各種因素，如高糖、AGE、氧化應激等激活，進一步探究Rac1激活對JA2/STAT3信號通路的影響，結(jié)果如圖3所示.

(a)p-JAK2/JAK2的表達,(b)p-STAT3/STAT3的表達; 與對照組相比，

由圖 3可知，Rac1(G12V)組p-JAK2/JAK2以及p-STAT3/STAT3的表達比對照組顯著增加，提示Rac1能激活JAK2/STAT3信號通路.

3.3.2 Rac1(G12V)對MES產(chǎn)生TGF-β的作用

為進一步驗證Rac1對JAK2/STAT3信號通路的激活作用，檢測其下游信號分子TGF-β的表達，結(jié)果如圖4所示.

與對照組相比，

圖4顯示，Rac1(G12V)組的TGF-β表達水平明顯高于對照組，提示Rac1活化可以激活JAK2/STAT3信號通路.

3.3.3 Rac1(G12V)對MES纖連蛋白(FN)的影響

TGF-β被認為可以促進系膜細胞肥大，促使ECM 積聚，從而在DN腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中起著重要作用，而纖連蛋白(fibronectin，簡稱FN)是ECM的主要成分，因此通過檢測FN水平來反應ECM積聚情況，結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知，Rac1(G12V)組的FN表達水平明顯高于對照組，免疫熒光實驗顯示Rac1(G12V)的FN表達增強，提示突變過表達的Rac1能增加系膜細胞ECM的積聚.

4 討 論

Rho(小G蛋白)是Ras蛋白超家族的一個亞群，具有GTP酶活性，又稱為Rho GTP酶(GTPase)，在該家族中，Rac1是研究最廣泛的成員之一，于1989年被發(fā)現(xiàn)為Ras相關的C3肉毒毒素底物1，分子量為21 kDa，由192個氨基酸編碼組成[10].隨后，它被證明在多種細胞中發(fā)揮基本作用，包括肌動蛋白細胞骨架重組、細胞轉(zhuǎn)化、誘導DNA合成、超氧化物產(chǎn)生和細胞遷移[11].Rac和Rho GTPase是GTP結(jié)合蛋白，起分子開關的作用.當與GTP結(jié)合時，GTPase可以與效應分子或靶標分子相互作用并啟動信號轉(zhuǎn)導，當它們與GDP結(jié)合在一起時，這種信號傳導就被抑制[12].Rac1的異常表達或激活可引起異常的細胞信號傳導，從而導致病理損傷，Rac1蛋白作為NADPH氧化酶的一個活性亞基，其活性變化將會直接影響其所依賴的Rac1/NADPH 信號通路的激活和抑制，而來源于NADPH氧化酶的ROS被認為是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病的始作俑者[13].此外，GTPases的Rac/Rho家族是肌動蛋白細胞骨架的關鍵調(diào)控因子[14]，在DN腎纖維化中形成的作用已被證實，Hubchak等[15]認為Rac1通過一種不直接改變經(jīng)典Smad3信號事件的機制來增強TGF-β1誘導的I型膠原表達.

JAK/STAT信號通路是一條具有信號轉(zhuǎn)導和基因轉(zhuǎn)錄雙重功能的信號通路，可介導炎癥、細胞增殖和纖維化信號的傳遞[16].在DN中，JAK2/STAT3信號通路被高血糖、氧化應激、AGE等激活，引起TGF-β過表達，導致ECM擴張、腎小球基底膜以及纖連蛋白FN、層粘連蛋白和I膠原蛋白的積累，最終加速DN的發(fā)生和發(fā)展[17].此外，研究表明Rac1突變體顯著提高了JAK2的活性，突變激活的Rac1增加JAKs的磷酸化和STATs的轉(zhuǎn)錄活性[18].Rac1可以通過激活 IL-6/JAK2通路或直接與STAT3結(jié)合來激活STAT3和信號轉(zhuǎn)導[19].

為了研究Rac1激活在系膜細胞損傷中的作用，筆者構(gòu)建了持續(xù)激活的Rac1(G12V)重組載體，導入MES細胞后穩(wěn)定表達.G蛋白偶聯(lián)受體不僅能在激動劑刺激后傳遞信號，還能自發(fā)偶聯(lián)到信號轉(zhuǎn)導通路，即在沒有激動劑存在的情況下本身可以轉(zhuǎn)變成活性構(gòu)象，傳遞信號[20].筆者所設計的 Rac1 組成型激活突變體 Rac1(G12V)是對照 Rac1的組成型突變體將P-loop上12位的G/甘氨酸突變?yōu)閂/纈氨酸，能夠模擬野生型G蛋白的激活狀態(tài)，人為構(gòu)建組成型激活突變體[21].研究結(jié)果表明，由持續(xù)性Rac1激活可激活JAK2/STAT3信號通路，使TGF-β過度表達及細胞外基質(zhì)積累.但是Rac1激活是通過ROS還是直接激活STAT3有待于進一步研究證實.