吳 慧,劉 芳,張利偉,3,劉 磊,4,宋文成,3*,王宏志,3*

(1.安徽醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院,安徽 合肥 230032；2.中國科學院合肥物質科學研究院 安徽省醫(yī)學物理與技術重點實驗室,健康與醫(yī)學技術研究所，安徽 合肥 230031；3.中國科學院 合肥腫瘤醫(yī)院,安徽 合肥230031；4.安徽職業(yè)技術學院 環(huán)境與生命健康學院，安徽 合肥 230061)

甲狀腺未分化癌是一種罕見的內分泌惡性腫瘤，具有易轉移、發(fā)展迅速等特點，而且致死率高達50%以上[1].目前甲狀腺未分化癌的常規(guī)治療手段主要有手術、放療、化療和靶向治療等，但是無論哪種治療方式，患者預后并不良好[2-4]，因此亟須一種新型有效的甲狀腺未分化癌的治療方式.

CAP是氣體在電離狀態(tài)下產生的物質，其主要成分包括紫外線、活性粒子、電子、離子等[5-6].因其具有可在大氣壓條件下產生、溫度接近于室溫等特點，故在生物醫(yī)學領域具有良好的應用前景.研究表明，CAP在傷口愈合、殺菌、口腔醫(yī)療及癌癥治療等方面都具有重要作用[7-10].自從2007年首次發(fā)現CAP具有促進黑色素瘤細胞凋亡的作用后，等離子體抗癌作用成為研究的熱點，目前已有研究報道CAP對于肺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌、口腔癌等多種類型的癌癥具有良好的抑制作用[11-14].一定劑量的CAP處理除了能誘導細胞凋亡以外，還可通過誘導細胞自噬和細胞壞死發(fā)揮作用.然而CAP抑制癌細胞的具體分子機制尚未明確.

筆者將CAP應用于抑制甲狀腺未分化癌CAL-62細胞生長的研究，并使用生物信息學手段揭示等離子體處理對CAL-62細胞轉錄組變化情況，以探究等離子體抑制CAL-62細胞的分子機制，以期為CAP對甲狀腺未分化癌的治療提供一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 細胞系

人甲狀腺未分化癌細胞株(CAL-62)購自廣州賽庫生物技術有限公司.

1.2 實驗試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液購自澳大利亞Gibco；胎牛血清購自上海雙洳生物科技有限公司；胰蛋白酶細胞消化液、青霉素/鏈霉素(100×)購自生工生物工程股份有限公司；RIPA裂解液、硝酸纖維素膜、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天公司；甲醇購自生工生物工程股份有限公司；Super SignalTMWest Pico PLUS化學發(fā)光底物購自Thermo公司；TRizol試劑盒購自Invitrogen公司；高純氦氣(99.999%)購自南京特種氣體廠股份有限公司.倒置顯微鏡購自明美光電技術公司；化學發(fā)光儀購自Tanon公司.

1.3 方 法

(1)細胞培養(yǎng).取對數生長期的貼壁細胞CAL-62接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng).

(2)CAP處理.使用介質阻擋放電等離子體裝置，裝置示意圖如圖1(a)所示.該裝置的反應腔室內有4對由圓形銅板構成的高壓電極和接地電極(直徑分別為58 mm和62 mm)，電極外有1 mm厚的石英玻璃作為阻擋介質.工作氣體為氦氣(99.999%)，以2.67 L·min-1的流速由進氣口進入，多余的空氣可由出氣口排出，峰值電壓為6 kV.

細胞處理方式如圖1(b)所示，將6×105個細胞接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后棄掉原培養(yǎng)基，加入5 mL新鮮的培養(yǎng)基，將孵育在培養(yǎng)基中的細胞放置到等離子體處理裝置反應腔室中，通氦氣90 s后再接通電源產生等離子體作用于細胞.對照組不進行等離子體處理，處理組等離子體處理30 s.

(a)CAP處理裝置原理示意圖；(b)CAP處理CAL-62細胞方法流程圖.

(3)mRNA提取.細胞經等離子體處理30 s后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，收集到離心管；按照TRizol試劑盒方法提取細胞中的總RNA，每次處理設置3個生物學重復.提取后的mRNA使用安捷倫2100生物分析儀評估m(xù)RNA的完整性.

(4)cDNA制備及測序.使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入陽離子將mRNA隨機打斷；將隨機引物加入片段化的mRNA中進行DNA一鏈的合成，進一步用dUTP代替dTTP合成DNA二鏈；對擴增好的cDNA進行末端修復、加“A”和接頭連接，對連接產物進行PCR反應并檢測文庫質量；將PCR產物變性為單鏈，進行環(huán)化得到最終的cDNA文庫，使用DNBSEQ平臺測序.

(5)RNA-seq分析.使用SOAPnuke軟件對測序所得的原始數據進行質控，去除具有接頭污染、未知堿基含量大于5%、低質量的Reads，獲得Clean Reads.然后將Clean Reads比對到參考序列，合格后進行基因定量分析、基于基因表達水平的各項分析(主成分、相關性、差異基因篩選等).設置|log2FC|≥1,q-value≤0.01(fold change, 簡稱FC，表示實驗組/對照組的基因表達豐度差異倍數)，篩選出的樣品間差異表達基因674個，其中有287個上調基因和387個下調基因，分別對上調基因和下調基因進行KEGG pathway顯著性富集分析.根據KEGG pathway注釋分類，對差異基因進行功能分類，使用R軟件中的phyper函數進行富集分析，計算p-value，然后對p-value進行FDR校正得到q-value.根據GO分類，對差異基因進行功能分類，并使用R軟件中的phyper功能進行富集分析，計算p-value，然后對p-value進行FDR校正得到q-value.

(6)線粒體膜電位檢測.CAP處理4 h后，根據線粒體膜電位試劑盒(JC-1, Solarbio，北京，中國)說明，丟棄原培養(yǎng)基，然后用PBS洗滌細胞2次.隨后在每個培養(yǎng)皿中加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，并在其中加入預先準備好的JC-1染色工作液并充分混合.再將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中孵育20 min后棄去培養(yǎng)皿中液體，用預先準備好的JC-1染色緩沖液洗滌2次，棄去.最后在每個培養(yǎng)皿中再次加入2 mL DMEM培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察并記錄熒光圖像.采用Image J軟件進行熒光定量分析.

(7)細胞遷移實驗.細胞遷移實驗在孔徑為8 μm的24孔Transwell小室(Costar, 華盛頓哥倫比亞特區(qū)，美國)中進行.先將CAP處理后孵育4 h的細胞用胰蛋白酶消化，制備細胞懸液.然后對細胞懸液進行計數，使細胞數量約為1×105mL-1.在Transwell小室上室中加入200 μL不含胎牛血清的DMEM細胞懸液.在下室中添加500 μL含10% 胎牛血清的DMEM作為誘導劑，孵育約24 h后，用PBS洗滌細胞，再用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色.然后用棉簽輕輕擦除未穿過上室膜的細胞，在低倍顯微鏡(100倍)下隨機選擇5個視野，觀察并記錄穿過上室膜的細胞數量.

1.4 數據分析

所有實驗均重復3次，實驗結果由平均值±標準差表示，采用t檢驗檢測組間差異，p<0.05具有顯著性差異.* * *p<0.001, * *p<0.01, *p<0.05.

2 結果與分析

2.1 CAP抑制CAL-62細胞生長

為了探究CAP處理對CAL-62細胞生長的影響，將對照組和CAP處理30 s的細胞于倒置顯微鏡下拍攝圖片，分別記錄CAP處理后0，6，12 h時CAL-62細胞的形態(tài)，結果如圖2所示.圖2顯示，CAP處理12 h后，細胞的形狀發(fā)生皺縮，細胞收縮變圓.而CAP處理后0 h細胞形態(tài)變化并不明顯，處理6 h后細胞略有收縮，這說明CAP對細胞形態(tài)的影響是一個逐漸緩慢的過程，需要一定的作用時間.

圖2 CAP處理后CAL-62細胞形態(tài)變化

2.2 CAP處理后CAL-62細胞轉錄組概況

設對照組和CAP處理組2組細胞，每組3個重復，測得6個轉錄組樣品.每個樣品平均產出6.73 GB數據，共檢測到16 861個基因.通過比對對照組和CAP處理組的CAL-62細胞的轉錄組發(fā)現，共有674個基因差異表達(圖3)，其中287個基因上調表達，387個基因下調表達(|log2FC|≥1,q-value≤0.01).

圖3 CAP處理后細胞差異基因表達火山圖

2.3 CAP處理前后轉錄組差異基因KEGG富集分析

分別將上調的287個差異基因和下調的387個差異基因進行KEGG富集分析，并篩選出20條富集最顯著的通路，結果如圖4所示.

(a)CAP處理后上調基因的KEGG富集；(b)CAP處理后下調基因的KEGG富集.

圖4(a)顯示，上調基因主要富集在MAPK信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、抗原過程及呈遞等相關信號通路和癌癥轉錄失調等中.其中，差異基因富集條目最多的通路是MAPK信號通路，說明CAP處理可以在一定程度上激活MAPK信號通路，從而進一步調節(jié)CAL-62細胞.圖4(b)顯示，下調基因主要集中在肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、Rap1信號通路、癌癥MicroRNAs、ErbB信號通路、FoxO信號通路、Notch信號通路等相關性信號通路中.

2.4 CAP處理前后轉錄組差異基因GO富集分析

同樣的，將上調基因和下調基因分開進行GO富集分析，并展示其中差異最顯著的20個條目，結果如圖5所示.

圖5(a)顯示，上調表達的差異基因的GO富集中差異基因主要富集的條目是免疫反應、細胞凋亡過程、轉錄正調控和固有免疫反應.上調差異基因在細胞凋亡過程的富集說明CAP處理可以促進CAL-62細胞凋亡過程的發(fā)生.圖5(b)顯示，下調表達的差異基因的GO富集中差異基因主要富集的條目是磷酸化(含蛋白質磷酸化)、細胞對DNA損傷刺激的反應和GTPase活性正調控.

(a)CAP處理后上調基因的GO富集；(b)CAP處理后下調基因的GO富集.

2.5 CAP處理后CAL-62細胞基因的差異表達

按照|log2FC|≥1,q-value≤0.01，對差異基因進行篩選，篩選出了674個差異顯著基因.分別對上調和下調的前20個差異基因制作其在對照組和CAP處理組的基因差異表達熱圖，如圖6所示.其中CAP處理后BIK，CDKN1C等基因顯著上調表達，TANC2，ESM1，CBL，DST，PLXNA2等基因顯著下調表達.

(a)差異顯著的前20個上調基因；(b)差異顯著的前20個下調基因.

2.6 部分基因在腫瘤組織和癌旁組織的差異表達情況

接下來，為了探究顯著差異表達的部分基因在腫瘤組織和正常組織中的表達情況,筆者基于TCGA數據庫的數據信息對BIK，CDKN1C，TANC2，ESM1，CBL這5個基因在甲狀腺癌組織和正常組織之間的表達情況進行了分析展示，結果如圖7所示.

圖7 5個基因在甲狀腺癌中的表達水平

圖7顯示，BIK，CDKN1C，TANC2，ESM1，CBL基因在甲狀腺癌組織和正常組織之間的表達存在顯著差異，其中BIK和CDKN1C在甲狀腺癌組織中的表達明顯低于正常組；TANC2，ESM1和CBL在腫瘤中的表達明顯高于正常組.說明低水平的BIK和CDKN1C表達更有利于甲狀腺癌細胞的生存，而CAP處理導致的BIK和CDKN1C基因表達的上調，可以一定程度向正常組靠攏.同樣，CAP處理后TANC2，ESM1和CBL表達下調也能達到這樣的效果.

2.7 CAP處理CAL-62細胞引起基因差異表達驗證

與對照組相比，CAP處理組的基因表達水平發(fā)生了很多變化.轉錄組分析顯示APAF1，JNK等基因顯著上調；AKT1，AKT3，PIK3等基因顯著下調.因此，選擇這些基因進行WB驗證，實驗結果如圖8所示：CAP處理組的JNK，APAF1蛋白表達明顯上調；AKT，PI3K的蛋白表達水平明顯下調，與轉錄組結果一致，證明了轉錄組結果的準確性.

(a)CAP處理組和對照組差異基因表達WB驗證；(b)WB條帶量化統(tǒng)計.

2.8 CAP處理降低CAL-62細胞線粒體膜電位

線粒體膜電位下降是細胞早期凋亡的標志性事件.上述的結果表明CAP處理改變了CAL-62細胞的形態(tài)，進一步探究CAP處理對CAL-62細胞線粒體膜電位的影響.熒光定量分析結果如圖9所示，與對照組相比，CAP處理組的綠色/紅色熒光比值顯著增加.表明CAP處理降低了CAL-62細胞的線粒體膜電位，誘導了細胞的早期凋亡.

(a)細胞線粒體膜電位的熒光圖像；(b)熒光圖量化統(tǒng)計.

2.9 CAP處理對CAL-62細胞遷移的作用

用Transwell實驗探索CAP處理對CAL-62細胞遷移的影響，結果如圖10所示，與對照組相比，CAP處理組的細胞遷移量顯著減少，幾乎沒有細胞穿過上室膜.表明CAP處理明顯抑制了CAL-62細胞的遷移.

(a)用Transwell法分析CAP處理后CAL-62細胞的遷移情況；(b)跨膜細胞數量量化分析.

3 討論與結論

雖然CAP的體外抗腫瘤作用被廣泛證實，但是關于CAP對甲狀腺癌抑制效果的報道較少.一項體外研究表明，CAP可以通過促進p-JNK，p-P38，caspase-3的表達引起甲狀腺未分化癌細胞HTH83，U-HTH 7和SW1763發(fā)生細胞凋亡[14].此外，大氣壓低溫等離子體對甲狀腺乳頭狀癌細胞株(BHP10-3和TPC1)也具有良好的抑制效果，等離子體可以通過調控FAK/Src復合體來抑制MMP-2/-9和uPA的活性，進一步抑制細胞的遷移和侵襲[15].

筆者使用未處理的CAL-62細胞作為對照組，CAP處理的CAL-62細胞作為處理組，進行了一系列實驗分析：

(1)使用未處理的CAL-62細胞作為對照組，CAP處理30 s的CAL-62細胞作為處理組，發(fā)現一定劑量的CAP處理后不久大部分細胞會經歷形態(tài)收縮的變化過程，處理引起的細胞內溶液泄漏可以進一步導致細胞收縮和細胞起泡[16-17].而且CAP處理還會顯著降低細胞的線粒體膜電位，誘導細胞早期凋亡.此外，細胞活力的下降是CAP殺傷癌細胞的重要表現之一，對于體外培養(yǎng)的癌細胞或者3D腫瘤模型，等離子體都具有良好的抑制細胞增殖的效果[18-20].

(2)通過轉錄組分析檢測到的部分基因與癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關.BIK作為Bcl-2家族中的凋亡誘導蛋白，具有促進凋亡的作用，在非小細胞肺癌中抑制BIK的表達可以促進腫瘤的發(fā)生[21].CDKN1C基因是一種腫瘤抑制基因，在G1期起到調節(jié)細胞周期進程的作用，研究報道CDKN1C的表達在雌激素受體陽性/HER 2陰性的乳腺癌以及頭頸部鱗狀細胞癌患者的預后中具有重要作用[22-23].因此BIK，CDKN1C等基因的上調表達可以在一定程度上促進細胞凋亡，抑制細胞周期進程，從而發(fā)揮抑癌作用.ESM1與細胞的遷移密切相關，研究顯示，ESM1可以作為下游分子參與膠質母細胞瘤的轉移[24]，而且沉默ESM1可以顯著降低肝細胞癌的遷移和侵襲[25].筆者的Transwell實驗結果也證明了CAP處理對CAL-62細胞遷移的抑制作用.此外，ESM1基因與腎癌患者的VEGFA表達呈現較強的相關性[26].CBL是一個原癌基因，可以作為許多信號轉導途徑的負調節(jié)器發(fā)揮作用[27].CAP處理引起的CAL-62細胞內ESM1，CBL等基因的表達水平的下調可以在一定程度上發(fā)揮抑制細胞遷移的作用.差異基因在某些信號通路的富集情況也能反應CAP對CAL-62細胞的抑制作用.Rap1信號通路在多種惡性腫瘤中過表達，是多條信號通路的分子開關，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.下調差異基因在Rap1信號通路的顯著富集說明CAP處理可以在一定程度上抑制Rap1信號通路.ErbB受體信號通過AKT，MAPK以及其他多種通路來調節(jié)細胞增殖、遷移、分化、凋亡，ErbB作為惡性腫瘤的治療靶標之一，CAP處理導致的下調可在一定程度上降低CAL-62細胞的惡性程度.

(3)從轉錄組學水平探究了CAP對CAL-62細胞的影響，發(fā)現CAP處理可明顯造成CAL-62細胞基因的差異表達，轉錄組學分析結果表明CAP處理后CAL-62細胞的基因表達發(fā)生明顯改變，共檢測到674個基因差異表達，其中287個基因上調表達，387個基因下調表達.其中BIK，CDKN1C等基因顯著上調，TANC2，ESM1，CBL等基因顯著下調.并且對差異基因進行了KEGG富集和GO分類，從轉錄組學水平探究了CAP抑制甲狀腺未分化癌的分子機制，為CAP應用于甲狀腺未分化癌的治療提供了一定的理論基礎.