夏啟玉，賀萍萍，張麗麗，張雨良，肖蘇生，趙 輝,3*

高粱高效啟動(dòng)子的克隆及活性鑒定

夏啟玉1,2，賀萍萍1,2，張麗麗1,2，張雨良1,2，肖蘇生1,2，趙 輝1,2,3*

1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南三亞 572024；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101；3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南海口 571101

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因啟動(dòng)子以啟動(dòng)效率高、甲基化程度相對(duì)較低、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)成為單子葉植物中應(yīng)用較為廣泛的啟動(dòng)子。其中，玉米的是最常使用的啟動(dòng)子之一。本研究旨在克隆高粱高效啟動(dòng)子，為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供新的組成型啟動(dòng)子選擇。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到多個(gè)基因，下載其起始密碼子上游3000 bp的序列。根據(jù)啟動(dòng)子的特點(diǎn)，選擇含有5′ UTR內(nèi)含子且大小合適的序列，并通過(guò)在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子分析，最后選擇2個(gè)基因（LOC8076096、LOC8063786）進(jìn)行啟動(dòng)子克隆，將其啟動(dòng)子序列分別命名為和。將這2個(gè)啟動(dòng)子片段PCR擴(kuò)增后，連入含有GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體Ubi-GUS，得到重組表達(dá)載體U1-GUS和U5-GUS。重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行GUS染色分析，鑒定和的啟動(dòng)子活性。GUS染色觀察發(fā)現(xiàn)，所有以和為啟動(dòng)子的水稻和狗尾草陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉均呈現(xiàn)較深的藍(lán)色，比以玉米為啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的藍(lán)色略深，且以為啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗比以為啟動(dòng)子的藍(lán)色更深，而非轉(zhuǎn)基因的水稻和狗尾草小苗則完全染不上藍(lán)色。因此，啟動(dòng)子和在水稻和狗尾草中均具有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，可作為新的組成型啟動(dòng)子應(yīng)用于高粱、水稻、狗尾草及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

高粱；泛素基因；啟動(dòng)子；克?。换钚澡b定

高粱[(L.) Moench]是中國(guó)主要雜糧作物之一，是糧食、飼料和釀酒業(yè)原料的重要來(lái)源。現(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，為高粱新品種的獲得提供了一種快速有效的途徑。與水稻、玉米、大豆等其他作物相比，高粱的遺傳轉(zhuǎn)化研究發(fā)展比較緩慢。高粱是禾本科中最難進(jìn)行組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的物種之一，其遺傳轉(zhuǎn)化效率受基因型的影響較大，成功獲得的轉(zhuǎn)基因高粱品種不多，且轉(zhuǎn)化率仍較低[1-3]。

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，因此選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)程度，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類(lèi)：組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的調(diào)控不受外界條件的影響，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性。目前廣泛應(yīng)用的植物組成型啟動(dòng)子有來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子、泛素（ubiquitin）基因啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白（actin）基因啟動(dòng)子等。35S啟動(dòng)子常應(yīng)用于雙子葉植物中，啟動(dòng)子和啟動(dòng)子常應(yīng)用于單子葉植物中。目前，在單子葉植物中應(yīng)用較廣的啟動(dòng)子為玉米啟動(dòng)子和水稻啟動(dòng)子。大部分基因的起始轉(zhuǎn)錄區(qū)上游都有一段5′ UTR內(nèi)含子，研究表明啟動(dòng)子在植物中的高效表達(dá)與其5′ UTR的內(nèi)含子調(diào)控有一定關(guān)系。啟動(dòng)子以啟動(dòng)效率高、甲基化程度相對(duì)較低、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)成為目前研究較多的啟動(dòng)子之一[4]。

為獲得來(lái)源于高粱的高效啟動(dòng)子，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索高粱的基因，選擇2個(gè)高粱基因進(jìn)行啟動(dòng)子克隆，構(gòu)建了這2個(gè)啟動(dòng)子分別表達(dá)GUS報(bào)告基因的重組表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物中的C3模式植物水稻和C4模式植物狗尾草，對(duì)獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行GUS染色分析，鑒定它們的啟動(dòng)子活性，為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供新的組成型啟動(dòng)子選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以高粱‘Hiro-1’品種為實(shí)驗(yàn)材料，種植后取葉片提取基因組DNA?！瓾iro-1’品種的種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)才宏偉教授饋贈(zèng)。水稻轉(zhuǎn)化品種為‘日本晴’，由本實(shí)驗(yàn)室保存；狗尾草轉(zhuǎn)化品種為‘ME34’，由美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center的Brutnell實(shí)驗(yàn)室提供，本實(shí)驗(yàn)室繁殖后保存。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株 Ubi-GUS質(zhì)粒由美國(guó)Donald Danforth Plant Science Center的Brutnell實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌DH5α感受態(tài)和農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)分別購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司和上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和通用型DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；酶MIX購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；MS購(gòu)自Duchefa Biochemie公司；Gelzan植物凝膠購(gòu)自Caisson Labs公司；潮霉素購(gòu)自Gold Biotechnology公司；X-Gluc購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest Agarose公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子克隆 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索高粱基因，共找到17個(gè)高粱基因，單體數(shù)量介于1～6個(gè)之間，其中含6個(gè)單體的有3個(gè)，含5個(gè)單體的有2個(gè)，選擇了與玉米啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因同源性較高的基因進(jìn)行下一步分析。找出其起始密碼子ATG上游的3000 bp以內(nèi)的核苷酸序列，利用在線預(yù)測(cè)軟件Softberry中的TSSP對(duì)其進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析，根據(jù)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果及與玉米啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，選擇2個(gè)與玉米啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)相似且預(yù)測(cè)含有啟動(dòng)子元件的基因LOC8076096和LOC8063786進(jìn)行啟動(dòng)子克隆，并將其啟動(dòng)子序列分別命名為和。在和基因起始密碼子上游3000 bp內(nèi)設(shè)計(jì)克隆引物，使啟動(dòng)子核苷酸序列長(zhǎng)度略大于2000 bp。上游引物的5端加上限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和保護(hù)堿基，下游引物的5加限制性內(nèi)切酶I的識(shí)別序列和保護(hù)堿基，引物序列見(jiàn)表1。使用植物基因組DNA提取試劑盒提取高粱Hiro-1葉片的基因組DNA，以其為模板，利用高保真PrimeSTAR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：無(wú)菌水9.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，Primestar Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，52℃退火15 s，72℃延伸15 s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，純化回收后，送測(cè)序公司進(jìn)行全序列測(cè)序。引物合成及測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 啟動(dòng)子U1和U5的引物序列

注：下劃線的序列為限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。

Note: The underlined sequence is the restriction endonuclease recognition sequence.

1.2.2 植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建 選擇植物表達(dá)載體Ubi-GUS為骨架載體進(jìn)行載體改造，該載體的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）報(bào)告基因的啟動(dòng)子為玉米啟動(dòng)子，選擇Ⅰ和Ⅰ2個(gè)酶切位點(diǎn)，雙酶切將該載體GUS基因上游的玉米啟動(dòng)子切除，分別連入啟動(dòng)子和，構(gòu)建由和啟動(dòng)GUS基因的植物重組表達(dá)載體U1-GUS和U5-GUS（圖1），可通過(guò)報(bào)告基因GUS的表達(dá)鑒定目的啟動(dòng)子的活性。具體構(gòu)建過(guò)程為：回收和的PCR產(chǎn)物，用Ⅰ和Ⅰ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；載體Ubi-GUS用相同的酶進(jìn)行雙酶切，膠回收載體大片段。將2個(gè)回收片段用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于37℃在含卡那霉素的LB平板中培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，采用和啟動(dòng)子的引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性克隆。菌液PCR反應(yīng)體系為：無(wú)菌水9.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，Mix 12.5 μL，菌液模板1 μL。的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。根據(jù)菌液PCR檢測(cè)的結(jié)果，分別選擇陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，保存測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。將重組表達(dá)載體用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1，獲得的菌株用甘油保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.3 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草 以水稻品種‘日本晴’和狗尾草品種‘ME34’的成熟種子為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷。將分別攜帶重組載體U1-GUS和U5-GUS的AGL1菌株各自侵染水稻和狗尾草的胚性愈傷，以攜帶對(duì)照載體Ubi-GUS的AGL1菌株為對(duì)照（CK），共培養(yǎng)5～7 d，潮霉素篩選獲得抗性愈傷，抗性愈傷分化成苗，生根后移栽至育苗盆中，水稻轉(zhuǎn)化苗在溫室培養(yǎng)，狗尾草轉(zhuǎn)化苗在植物人工氣候箱培養(yǎng)。水稻的遺傳轉(zhuǎn)化參照TOKI等[5]的方法進(jìn)行，狗尾草的遺傳轉(zhuǎn)化參照趙輝等[6]的方法進(jìn)行。

1.2.4 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的PCR篩選 待轉(zhuǎn)化苗存活后，采集轉(zhuǎn)化苗的葉片，提取基因組DNA，首先進(jìn)行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（）基因和基因的PCR檢測(cè)。水稻以‘日本晴’基因組DNA為陰性對(duì)照（CK?），狗尾草以‘ME34’基因組DNA為陰性對(duì)照（CK?，以U1-GUS和U5-GUS質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照（CK+），以無(wú)菌水為空白對(duì)照（CK）?；虻臋z測(cè)引物來(lái)自農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-2-2012（轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)標(biāo)記基因和定性PCR方法），基因的檢測(cè)引物來(lái)自農(nóng)業(yè)部2122號(hào)公告-3-2014（轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)報(bào)告基因定性PCR方法）。引物序列見(jiàn)表2。PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為：無(wú)菌水9.5 μL，引物（10 μmoL/L）各1 μL，Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。另外，以上述DNA為模板，用啟動(dòng)子和的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化苗中的啟動(dòng)子和。PCR反應(yīng)體系為：無(wú)菌水9.5 μL，引物（10 μmoL/L）各1 μL，Primestar Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 S，52℃退火15 s，72℃延伸15 s，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)基因、基因和啟動(dòng)子和的PCR檢測(cè)結(jié)果篩選出水稻和狗尾草的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗。

表2 HPT和GUS的檢測(cè)引物

1.2.5 U1-GUS和U5-GUS轉(zhuǎn)化苗的GUS活性分析 按常規(guī)方法配制GUS染色液的基液和母液，臨用前按比例混合。取水稻和狗尾草的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗用水洗凈泥土后，裝入50 mL離心管中，加入GUS染色液，37℃暗室下染色24 h。染色完成后，倒掉GUS染色液，先用75%乙醇脫色3～5次，再用95%乙醇脫色1～2次，觀察陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的染色情況。以非轉(zhuǎn)基因‘日本晴’和‘ME34’小苗為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)入U(xiǎn)bi-GUS的‘日本晴’和‘ME34’小苗為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子克隆

啟動(dòng)子和的PCR擴(kuò)增均得到大小約為2300 bp的條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，啟動(dòng)子的實(shí)際大小為2361 bp，啟動(dòng)子的實(shí)際大小為2307 bp，均與預(yù)期的大小有差別。啟動(dòng)子和的核苷酸序列見(jiàn)圖3。

M: DL2000 DNA marker.

2.2 植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建

和的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切回收，與Ubi-GUS的雙酶切回收產(chǎn)物分別進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，從轉(zhuǎn)化板上挑選單克隆，以和啟動(dòng)子的引物進(jìn)行菌液PCR（水為空白對(duì)照，CK），結(jié)果表明，U1-GUS挑選的8個(gè)克隆和U5-GUS的7個(gè)克隆均能擴(kuò)增出大于2000 bp的條帶（圖4），證明目的啟動(dòng)子和片段均已成功連入U(xiǎn)bi-GUS載體中。各挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行全序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，挑選出測(cè)序序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序序列完全一致的陽(yáng)性克隆。分別將攜帶重組表達(dá)載體U1-GUS和U5-GUS的陽(yáng)性克隆命名為U1-GUS/DH5α和U5-GUS/DH5α。提取U1-GUS和U5-GUS質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1，獲得的農(nóng)桿菌菌株命名為U1-GUS/AGL1和U5-GUS/AGL1。

2.3 水稻和狗尾草轉(zhuǎn)化苗的獲得及PCR鑒定

為了驗(yàn)證啟動(dòng)子和啟動(dòng)基因表達(dá)的能力，將攜帶重組載體U1-GUS和U5-GUS的AGL1以及攜帶對(duì)照載體Ubi-GUS的AGL1分別轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草，篩選和分化獲得轉(zhuǎn)化苗。將U1-GUS/ AGL1、U5-GUS/AGL1和對(duì)照菌株Ubi-GUS/ AGL1（陽(yáng)性對(duì)照，CK+）轉(zhuǎn)化‘日本晴’（NIP）獲得的轉(zhuǎn)化苗命名為NIP-U1、NIP-U5和NIP- Ubi；將U1-GUS/AGL1、U5-GUS/AGL1和對(duì)照菌株Ubi-GUS/AGL1（陽(yáng)性對(duì)照，CK+）轉(zhuǎn)化狗尾草‘ME34’獲得的轉(zhuǎn)化苗命名為ME34-U1、ME34-U5和ME34-Ubi。

圖3 啟動(dòng)子U1（A）和U5（B）的核苷酸序列

A: U1-GUS; B: U5-GUS; M: DL2000 DNA marker.

NIP-U1和NIP-U5各挑選5棵轉(zhuǎn)化苗，ME34-U1和ME34-U5各挑選8棵轉(zhuǎn)化苗，利用、和（）引物的PCR來(lái)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗均能擴(kuò)增出和基因，NIP-U1和ME34-U1轉(zhuǎn)化苗均能擴(kuò)增出啟動(dòng)子，NIP-U5和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗均能擴(kuò)增出啟動(dòng)子，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨幮詫?duì)照，CK?）和水對(duì)照（空白對(duì)照，CK）則不能擴(kuò)增出這些基因和啟動(dòng)子片段（圖5和圖6），說(shuō)明挑選的這些轉(zhuǎn)化苗均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗，均已成功地導(dǎo)入了目的載體。

M: DL2000 DNA marker.

M: DL2000 DNA marker.

2.4 U1和U5的啟動(dòng)子活性鑒定

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行GUS染色觀察分析，結(jié)果表明，所有的NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉均呈現(xiàn)較深的藍(lán)色，比陽(yáng)性對(duì)照NIP-Ubi和ME34-Ubi轉(zhuǎn)化苗的藍(lán)色略深，且NIP-U5和ME34-U5的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的藍(lán)色較NIP-U1和ME34-U1更深，而陰性對(duì)照非轉(zhuǎn)基因‘日本晴’小苗和‘ME34’小苗則完全染不上藍(lán)色（圖7）。表明啟動(dòng)子和在水稻和狗尾草中均能組成型啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，且具有強(qiáng)的啟動(dòng)子活性，因此啟動(dòng)子和可作為新的組成型啟動(dòng)子應(yīng)用于高粱、水稻、狗尾草及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

3 討論

植物啟動(dòng)子是目前單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最為廣泛的啟動(dòng)子之一，其中應(yīng)用較多的是玉米啟動(dòng)子和水稻啟動(dòng)子。1992年，CHRISTENSEN等[7]從玉米中分離到2個(gè)泛素基因（和），這2個(gè)基因都在5′非翻譯區(qū)包含1個(gè)內(nèi)含子，并分別構(gòu)建了以玉米的5′側(cè)翼區(qū)及5′內(nèi)含子作為啟動(dòng)子和以35S作為啟動(dòng)子表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因的重組載體pUBI-CAT和p35S-CAT。玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，pUBI-CAT比p35S-CAT表達(dá)的CAT活性高出10倍以上。此后，研究人員在小麥[8]、水稻[9-11]和花生[12]等植物中證實(shí)了玉米的強(qiáng)啟動(dòng)子活性。2000年，WANG等[13]分離了2個(gè)水稻泛素基因和，構(gòu)建了其5′上游區(qū)和GUS編碼區(qū)的表達(dá)框，通過(guò)基因槍法導(dǎo)入水稻懸浮細(xì)胞中，GUS活性測(cè)定結(jié)果表明，和啟動(dòng)子比35S啟動(dòng)子表達(dá)的GUS活性高10～15倍，比玉米啟動(dòng)子表達(dá)的GUS活性也高2～3倍。隨后，的強(qiáng)啟動(dòng)子活性在甘蔗中也得到了驗(yàn)證。LIU等[14]將啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因連接，通過(guò)基因槍法獲得了穩(wěn)定的甘蔗轉(zhuǎn)化植株，以為啟動(dòng)子比以為啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS表達(dá)水平提高了1.6倍，而以35S為啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株中則未檢測(cè)到GUS的表達(dá)。除玉米和水稻的啟動(dòng)子以外，還有多種植物如大豆[15]、煙草[16]、馬鈴薯[17]、向日葵[18]、番茄[19]、柳枝稷[20]的啟動(dòng)子已被成功克隆并應(yīng)用。

圖7 NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗的GUS染色

在植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，除了目的外源基因，通常還需要篩選標(biāo)記等其他外源基因，而每個(gè)基因一般需要獨(dú)立的啟動(dòng)子，因此需要使用多個(gè)啟動(dòng)子，但是重復(fù)使用同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)多個(gè)基因表達(dá)可能導(dǎo)致基于同源性的基因沉默。此外，使用植物自身的或者接近物種的啟動(dòng)子可能會(huì)有更高地啟動(dòng)外源基因表達(dá)的效率。因此，有必要克隆更多的能在植物中高效啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，為轉(zhuǎn)基因植物的生物技術(shù)育種的發(fā)展提供更多的啟動(dòng)子選擇。

本研究中轉(zhuǎn)化苗的GUS染色結(jié)果表明，以和為啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉都能染上深藍(lán)色，比以玉米為啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的藍(lán)色略深，且以為啟動(dòng)子比以為啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的藍(lán)色更深，這說(shuō)明高粱的不同啟動(dòng)子的活性有差異，比的啟動(dòng)子活性強(qiáng)。一般來(lái)說(shuō)，生物的親緣關(guān)系越近，其啟動(dòng)子通用的可能性越大[21]。高粱、水稻和狗尾草同屬禾本科植物，其中高粱和狗尾草還同屬黍亞科，親緣關(guān)系較近，啟動(dòng)子的活性可能也相似。已有研究表明，黍亞科的玉米啟動(dòng)子在水稻[9-11]、高粱[22-23]和狗尾草[24]等禾本科科植物中均具有強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。因此，本研究中在水稻和狗尾草中具有強(qiáng)啟動(dòng)活性的和啟動(dòng)子，在高粱中很可能也具有強(qiáng)的啟動(dòng)活性。

本研究雖然已經(jīng)驗(yàn)證了和啟動(dòng)子的活性，但下一步還需要將和啟動(dòng)子的核苷酸序列進(jìn)行分段截短實(shí)驗(yàn)，找出它們各自的核心啟動(dòng)子序列，進(jìn)一步鑒定它們的啟動(dòng)子活性。本研究克隆的啟動(dòng)子和可以為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供新的組成型啟動(dòng)子選擇。

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Cloning and Activity Identification of High EfficiencyPromoters from Sorghum

XIA Qiyu1,2, HE Pingping1,2, ZHANG Lili1,2, ZHANG Yuliang1,2, XIAO Susheng1,2, ZHAO Hui1,2,3*

1. Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions, Haikou, Hainan 571101, China; 3. Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

In the research of transgenic plants, promoter is one of the important factors affecting the efficiency of transgenic expression. Plant ubiquitin gene promoters have been widely used in monocotyledons because of its high starting efficiency, relatively low methylation degree and stable genetic traits. Among them, thepromoter of maize is one of the most commonly usedpromoters. The purpose of this study is to obtain high-efficiency ubiquitin promoters of sorghum and provide a new constitutive promoter selection for the genetic transformation of sorghum and other monocotyledonous plants. In this study, multiple polyubiquitin genes were found from NCBI database, and the sequence of 3000 bp upstream of its starting codon was downloaded. According to the characteristics ofpromoter, the sequence with 5′ UTR intron and appropriate size was selected, and the promoter was analyzed through the online promoter prediction website. Finally, two genes LOC8076096 and LOC8063786 were selected for promoter cloning, and their promoter sequences were namedandrespectively. After PCR amplification, the two promoter fragments were connected to the plant expression vector Ubi-GUS containing Gus reporter gene to obtain recombinant expression vectors U1-GUS and U5-GUS. The recombinant vector was transformed into rice and green bristlegrass by themediated method. The positive transformed seedlings were screened by PCR. GUS staining analysis was carried out on the positive transformed seedlings to identify the promoter activities ofand. GUS staining showed that the roots, stems and leaves of all positive transformed seedlings of rice and green bristlegrass withandas promoters showed darker blue, which was slightly darker than that of positive transformed seedlings with maizeas promoter, and the blue of positive transformed seedlings withas promoter was deeper than that ofas promoter, while non-transgenic rice and green bristlegrass seedlings could not be stained with blue at all. Therefore, the promotersandhave the activity of constitutive strong promoters in rice and green bristlegrass, and can be used as new constitutive promoters to study the genetic transformation of sorghum, rice, green bristlegrass and other monocotyledonous plants.

sorghum;gene; promoter; clone; activity identification

Q781

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.006

2022-04-23；

2022-05-18

海南省院士創(chuàng)新平臺(tái)科研項(xiàng)目資金（No. YSPTZX202102）；海南省朱健康院士工作站資金資助；海南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No. 322QN388）。

夏啟玉（1983—），女，碩士，助理研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全與南繁育種。*通信作者（Corresponding author）：趙 輝（ZHAO Hui），E-mail：zhaohui@itbb.org.cn。