喬雪瑩，鄭玉皎，陽江華，曾長英，鄒 智

橡膠樹基因的克隆及蛋白的亞細胞定位與多聚化分析

喬雪瑩1,2,3，鄭玉皎1,2,3，陽江華4，曾長英1*，鄒 智2,3*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南三亞 572024；3. 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室/中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101；4. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南?？?571101

水通道蛋白（aquaporin）是一類廣泛存在生物體中高效轉(zhuǎn)運水分子的膜內(nèi)在蛋白，其在生物膜上以同源或異源四聚體的形式起作用。根據(jù)序列相似性及亞細胞定位，植物水通道蛋白可分為PIP （plasma membrane intrinsic protein）、TIP（tonoplast intrinsic protein）、NIP（NOD26-like intrinsic protein）、SIP（small basic intrinsic protein）和XIP（X intrinsic protein）等5大類，其中，PIP定位在細胞膜，是介導(dǎo)細胞間水分跨膜運輸?shù)闹饕ǖ?。橡膠樹最早起源于南美亞馬遜河流域，是目前天然橡膠的主要商業(yè)來源。與其他植物相比，橡膠樹除蒸騰耗水外，周期性的割膠活動也會造成水分的大量流失，因此，水分平衡對于橡膠樹尤為重要。為揭示橡膠樹水分平衡的分子機制，采用RT-PCR技術(shù)對1個PIP類水通道蛋白基因進行克隆，并在此基礎(chǔ)上對其編碼蛋白的亞細胞定位和多聚化特征進行分析。結(jié)果顯示：該基因的編碼區(qū)長864 bp，預(yù)測編碼287 aa，其理論分子量為30.80 kDa、等電點8.59、不穩(wěn)定系數(shù)49.27、脂肪族指數(shù)22.34、總平均疏水指數(shù)為0.639，屬于不穩(wěn)定的疏水型堿性蛋白；蛋白含有水通道蛋白家族特有的MIP（major intrinsic protein）結(jié)構(gòu)域及6個典型的跨膜螺旋，每個螺旋的殘基數(shù)介于20～23之間。研究構(gòu)建了基因的亞細胞定位分析載體，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草葉片進行了瞬時轉(zhuǎn)化。熒光共聚焦顯微鏡觀察顯示，HbPIP1;1蛋白定位在細胞膜，與用生物信息學(xué)手段預(yù)測的結(jié)果一致。在煙草葉片中的雙分子熒光互補實驗顯示，HbPIP1;1蛋白自身不能互作，這進一步得到了點對點的酵母雙雜交實驗的證實。以上結(jié)果表明HbPIP1;1蛋白可能通過異源互作的方式參與橡膠樹水分的平衡。

橡膠樹；亞細胞定位；多聚化；雙分子熒光互補；酵母雙雜交

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和國防戰(zhàn)略物資，其在航天航空、醫(yī)療器械、海洋設(shè)施及高端制造業(yè)等方面具有不可替代的作用。天然橡膠的主要來源是橡膠樹（Muell. Arg.），一種熱帶雨林喬木，隸屬于大戟科橡膠樹屬[1]。天然橡膠在橡膠樹的乳管細胞中特異合成，并在割膠過程中以膠乳的形式被排出[2]。膠乳的含水量高達70%，是決定膠乳產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[2-3]。由于成熟的乳管與周圍的薄壁細胞間不存在胞間連絲，故乳管的水分平衡主要由水通道蛋白（aquaporin, AQP）介導(dǎo)[3-4]。研究表明，AQP廣泛存在于不同生物體中[3, 5-9]。根據(jù)序列相似性及亞細胞定位，植物AQP可分為PIP（plasma membrane intrinsic protein）、TIP（tonoplast intrinsic protein）、NIP（NOD26-like intrinsic protein）、SIP（small basic intrinsic protein）和XIP（X intrinsic protein）等5大亞家族，其中，PIP定位在細胞膜，是介導(dǎo)細胞間水分跨膜運輸?shù)闹饕ǖ繹8-9]。

通過前期研究，本研究組從橡膠樹的基因組中鑒定出51個AQP基因，其中有15個歸為PIP亞族[3, 7-8]。根據(jù)進化關(guān)系和序列特征，PIP亞族可進一步分為PIP1和PIP2兩組，其分別含有5個和10個成員[3]。表達分析顯示，隸屬于PIP1小組的基因在樹皮和膠乳中均有表達[3, 7, 10]，這表明該基因同時參與了這兩類組織的水分平衡，進而影響膠乳產(chǎn)量。為揭示可能的作用機制，本研究在基因克隆的基礎(chǔ)上，對其編碼蛋白的亞細胞定位和多聚化特征進行分析，以期為利用生物技術(shù)手段提高膠乳產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 橡膠樹品種為‘熱研7-33-97’；本氏煙草由本實驗室保存，種子萌發(fā)后移栽于溫度25℃、濕度55%的光照培養(yǎng)箱中。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌DH5α、植物瞬時表達載體NC-Cam1304-SubN由本實驗室保存；Y2HGold購自天根生化科技（北京）有限公司；GV3101（Soup）購于海南壹田生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 高保真酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；NC試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司；膠回收試劑盒Gel Extraction Kit和質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid DNA Mini Kit I購自O(shè)mega Bio-Tek；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成和常規(guī)DNA測序委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 膠乳RNA的提取及cDNA的合成 膠乳總RNA的提取參照參考文獻[11]，經(jīng)純度、濃度和完整性檢測合格后用TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆與載體構(gòu)建 根據(jù)從基因組中獲得的全長序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計如表1所示的基因特異性引物。以膠乳來源的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為模板cDNA 1 μL、Primer STAR Max premix 2×12.5 μL、HbPIP1;1F/HbPIP1;1R各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL；擴增程序為95℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s、60℃退火25 s、72℃延伸1.5 min（30個循環(huán)），最后72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后回收目的條帶，并利用同源重組的方法將其構(gòu)建到NC- Cam1304-SubN、GADT7、GBKT7、NC- BiFC- Ecn、NC-BiFC-Enn上；重組質(zhì)粒采用凍融法[12]轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR驗證后選取陽性克隆送去測序。

表1 本研究所用引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用Protparam （https:// web.expasy. org/protparam/）在線軟件對蛋白的理化特性進行分析；用Cell-PLoc 2.0（http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測亞細胞定位；用TMHMM （http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM）在線軟件分析跨膜結(jié)螺旋；用CDD（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd）在線軟件預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域；用SOPMA（https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_a-u-tomat.pl?page=/NPSA/ npsa_sopma.html）在線軟件預(yù)測二級結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL（https://swissm odel.expasy.org/ interactive）在線軟件進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 亞細胞定位 將重組質(zhì)粒Cam1304-轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)細胞，然后倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取陽性克隆并用帶有相應(yīng)篩選抗性的LB液體培養(yǎng)基搖菌至600=0.6；室溫下5000 r/min離心10 min收集菌體，參照SPARKES等[13]的方法配置好浸染液重懸2次。選取生長5～6周的煙草，暗處理3 h后，用1 mL微量注射器注射煙草，并做好記號，48 h后制片進行共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 雙分子熒光互補 以Cam1304-為陽性對照，將含NC-BiFC-Ecn-和NC-BiFC-Enn-的農(nóng)桿菌等量混合或單獨轉(zhuǎn)化煙草，然后進行熒光觀察。

1.2.6 酵母雙雜交 自激活檢測按表2所示組合共轉(zhuǎn)至Y2HGold，其中SD-TL、SD-TLH和SD- TLHA分別表示二缺（-Trp/-Leu）、三缺（-Trp/- Leu/-His）和四缺（-Trp/-Leu/-His/-Ade）培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化子數(shù)量并計算其生長率。待確認GBKT7-無自激活活性后，用SD-TL和SD-TLHA進行實驗篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbPIP1;1基因的克隆

以膠乳cDNA為模板、HbPIP1;1F/R為引物的PCR擴增成功獲得1條約900 bp的特異條帶（圖1），將其切膠回收后用于構(gòu)建亞細胞定位、雙分子熒光互補及酵母雙雜交等載體。

表2 本研究所用酵母雙雜交組合

2.2 生物信息學(xué)分析

序列分析表明，編碼區(qū)長度為864 bp，GC含量為48.84%；預(yù)測編碼287 aa，其理論分子量為30.80 kDa、等電點（pI）為8.59、不穩(wěn)定系數(shù)（II）為49.27、脂肪族指數(shù)（AI）為22.34、總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為0.639，表明該蛋白為不穩(wěn)定的疏水型堿性蛋白。Cell-PLoc 2.0分析顯示，蛋白定位在細胞膜上；TMHMM分析顯示，蛋白含有6個跨膜螺旋，分別位于55～77位、92～114位、135～152位、180～197位、210～232位和258～280位，每個螺旋的殘基數(shù)分別為23、23、18、18、23和23；CDD分析顯示蛋白含有AQP家族特有的MIP結(jié)構(gòu)域，位于46～276位，包含231個殘基；二級結(jié)構(gòu)分析顯示，蛋白的α-螺旋占30.66%，延伸鏈結(jié)構(gòu)占18.47%，β-轉(zhuǎn)角占3.14%，無規(guī)則卷曲占47.74%；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測進一步證實該蛋白含有6個保守的跨膜螺旋（圖2）。

M: DL2000 DNA marker; 1: HbPIP1;1.

2.3 亞細胞定位分析

亞細胞定位結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)空載NC- Cam1304-SubN的熒光信號散布于細胞的各個區(qū)域，而轉(zhuǎn)Cam1304-的僅見于細胞膜，這證實HbPIP1;1定位在細胞膜。

2.4 雙分子熒光互補實驗

雙分子熒光互補結(jié)果如圖4所示，與亞細胞定位分析一致，轉(zhuǎn)Cam1304-的陽性對照在細胞膜發(fā)現(xiàn)強烈的熒光信號，而單轉(zhuǎn)NC- BiFC-Enn-或NC-BiFC-Ecn-的陰性對照以及共轉(zhuǎn)的實驗組均未發(fā)現(xiàn)熒光信號，這表明HbPIP1;1自身不能互作。

A：保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B：二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；C：跨膜螺旋預(yù)測；D：三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

圖3 HbPIP1;1的亞細胞定位分析

圖4 基于雙分子熒光互補的HbPIP1;1多聚化分析

2.5 酵母雙雜交實驗

2.5.1 自激活分析 如圖5所示，陽性對照GADT7-LargeT和GBKT7-53m具有強互作，故在培養(yǎng)基SD-TL和SD-TLHA上生長旺盛，其生長率分別為85.13%和88.59%。陰性對照GADT7- LargeT和GBKT7-LaminC之間無互作，故在培養(yǎng)基SD-TLHA上無生長。GADT7和GBKT7-在SD-TLHA上無生長，這表明HbPIP1;1無自激活活性，可用于后續(xù)的酵母雙雜交實驗。

2.5.2 酵母雙雜交實驗 如圖6所示，將GADT7-和GBKT7-配對后，以GADT7-largeT和CBKT7-53m為陽性對照，以GADT7-LargeT和CBKT7-LaminC為陰性對照，進行酵母雙雜交實驗，結(jié)果顯示，實驗組酵母未見生長，這從另一個角度證實HbPIP1;1自身不能互作。

圖5 HbPIP1;1的自激活檢測

圖6 基于酵母雙雜交的HbPIP1;1多聚化分析

3 討論

在植物的生長發(fā)育過程中，水作為各種小分子物質(zhì)的承載物參與了植物的各項生理功能。AQP因其高效的水分轉(zhuǎn)運活性而著稱，是調(diào)控細胞、組織乃至植物整體水分平衡的核心[9, 14-15]。與其他植物相比，橡膠樹的水分平衡顯得尤為重要，因為除蒸騰耗水外，周期性的割膠活動會造成水分的大量流失。因此，分離和鑒定橡膠樹AQP基因一直是該領(lǐng)域研究的熱點[3-4, 7-8, 16-20]。雖然本研究團隊已經(jīng)完成了橡膠樹AQP基因的全基因組鑒定[3]，并系統(tǒng)揭示了其進化特征[7-8]，但對其具體的作用機制仍知之甚少。

本研究對1個在乳管和樹皮中均有表達的AQP基因進行了克隆。該基因隸屬于PIP亞家族PIP1亞組，編碼1個不穩(wěn)定的疏水型堿性蛋白；蛋白含有AQP家族特有的MIP結(jié)構(gòu)域以及6個典型的跨膜螺旋。鑒于AQP在生物膜上以同源或異源四聚體的形式行使水分轉(zhuǎn)運活性[21-22]，研究進一步構(gòu)建了基因的亞細胞定位、雙分子熒光互補以及酵母雙雜交等系列載體。生物信息學(xué)預(yù)測及在煙草葉片中的亞細胞定位分析均顯示，HbPIP1;1定位在細胞膜；同時，雙分子熒光互補和酵母雙雜交實驗均表明HbPIP1;1在體外不能形成同源多聚體，因此推測其在細胞膜上主要通過異源多聚體的形式起作用。此外，作為鑒定AQP水分轉(zhuǎn)運功能的重要手段，PIP1及另一個PIP亞組（PIP2）在蟾蜍卵母細胞中表現(xiàn)出明顯不同的特性，即PIP2具有高效的水分轉(zhuǎn)運活性，而PIP1無活性或活性很低[10, 16, 20-24]。深入研究發(fā)現(xiàn)，PIP1在蟾蜍中無水分轉(zhuǎn)運活性的原因主要在于其不能有效定位到細胞膜[21-22]。當(dāng)和單獨在葉肉原生質(zhì)中表達時，ZmPIP2定位于細胞膜，ZmPIP1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而當(dāng)二者共表達時，ZmPIP1卻定位于細胞膜，這表明ZmPIP2可介導(dǎo)ZmPIP1的細胞膜定位[23-24]。PIP1和PIP2的異源互作在卷柏、草莓、葡萄、小麥、甜菜等中也有報道[22]。在本研究中，HbPIP1;1之所以定位在細胞膜，很有可能是其可與煙草中的PIP2類蛋白互作進而介導(dǎo)其有效定位。同理，HbPIP1;1在橡膠樹中也可能存在與其互作的PIP2類蛋白，并以異源多聚體的形式在水平平衡中起作用。不過，這種假說還有待進一步的實驗證實。

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Gene Cloning, Subcellular Localization and Multimerization Analysis offrom

QIAO Xueying1,2,3, ZHENG Yujiao1,2,3, YANG Jianghua4, ZENG Changying1*, ZOU Zhi2,3*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions / Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China; 4. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

Aquaporins (AQPs),a class of integral membrane proteins facilitating the passive transport of water, are widely present in all living organisms. Evidence shows that AQPs function in homotetramers or hereotetramers in biological membranes. On the basis of the sequence similarity and subcellular localization, plant AQPs could be divided into five main subfamilies, i.e. PIP (plasma membrane intrinsic protein), TIP (tonoplast intrinsic protein), NIP (NOD26-like intrinsic protein), SIP (small basic intrinsic protein), and XIP (X intrinsic protein). Among them, PIPs, which are located in the plasma membrane, represent the main channel mediating water transport between cells. Para or Brazilian rubber tree (Muell. Arg.), a perennial big tree native to the Amazon basin, is the main commercial source of natural rubber currently. Compared with other plants, the water balance is particularly important for rubber tree, because a large amount of water loss could be caused by periodic bark-tapping as well as transpiration. Previous studies showed that the rubber tree genome encodes a high number of 51 AQP genes, which include fiveand ten. To uncover the molecular mechanism of PIP-mediated water balance in rubber tree, a key gene namedwas cloned using the RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) technique, followed by investigation of the subcellular localization and multimerization of its coding peptide. Results showed that the CDS (coding sequence) length ofis 864 bp (base pairs), putatively encoding 287 aa (amino acids), which includes a MIP (major intrinsic protein) domain specific to the AQP family; it was predicted to be an instable, hydrophobic, and basic protein that harbors the theoretical molecular weight (Mw) of 30.80 kDa, the isoelectric point (pI) of 8.59, the instability index (II) of 49.27, the aliphatic index (AI) of 22.34, and the grand average of hydropathicity (GRAVY) value of 0.639; it was also shown to contain six transmembrane regions that harbor 20?23 residues. Moreover, various expression vectors for subcellular localization, bimolecular fluorescence complementation, and yeast two-hybrid were constructed. Consistent with the bioinformatics analysis, transient overexpression ofin tobacco () leaves via the-medicatedtransformation revealed that the protein is located in the plasma membrane. Further bimolecular fluorescence complementation and yeast two-hybrid experiments showed that HbPIP1;1 could not form a homomultimer. The findings presented in this study suggest that HbPIP1;1 may be involved in water balance in the form of heteromultimer, though detailed mechanisms are to be further studied.

; subcellular localization; multimerization; bimolecular fluorescence complementation; yeast two-hybrid

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.002

2022-08-01；

2022-09-15

國家自然科學(xué)基金項目（No. 31971688）；海南省自然科學(xué)基金項目（No. 320RC705）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（No. 1630052022001）。

喬雪瑩（1996—），女，碩士研究生，研究方向：作物遺傳改良。*通信作者（Corresponding author）：曾長英（ZENG Changying），E-mail：zengchangying@hainanu.edu.cn；鄒 智（ZOU Zhi），E-mail：zouzhi2008@126.com。