康慎敏 武瑞赟 穆文強(qiáng) 尚慶茂 李平蘭*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所，北京 100081)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量化肥的施用使得環(huán)境污染，害蟲抗藥性以及作物品質(zhì)下降等問題日趨嚴(yán)重[1-2]?；蕿E用會使土壤中氮磷元素過度累積，造成土壤酸化，地表水富營養(yǎng)化和農(nóng)產(chǎn)品硝酸鹽含量超標(biāo)等現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅著食品安全和公眾健康[3-6]。因此，生產(chǎn)高效、安全、環(huán)保的新型功能性生物肥料具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物根際促生菌是指生活在植物根部周圍或與植物根部共生的，能通過多種不同機(jī)制促進(jìn)植物生長的一類細(xì)菌[7-8]。常見的植物根際促生菌有固氮菌屬、芽孢桿菌屬、農(nóng)桿菌屬等，其中芽孢桿菌是一類在自然環(huán)境中分布極其廣泛的革蘭氏陽性棒狀桿菌，它對人畜無毒無害，且不會對環(huán)境帶來污染，因其可產(chǎn)生內(nèi)生孢子，故對復(fù)雜環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在促進(jìn)植物生長的領(lǐng)域有較大的應(yīng)用空間[8]。研究表明芽孢桿菌可產(chǎn)抗生素、細(xì)菌素等物質(zhì)拮抗植物病原真菌，降低植物苗期發(fā)病率，也能分泌促生長的物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)幼苗的生長發(fā)育。如Pane等[9]從植物葉面篩選得到能降低番茄鏈霉病發(fā)病率的芽孢桿菌4株，并發(fā)現(xiàn)這些菌株均影響番茄早疫病病原真菌的菌絲形態(tài)與孢子萌發(fā)；Padgham等[10]發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌能夠使水稻根系的線蟲侵染和根瘤形成減少40%以上，其代謝產(chǎn)物能夠抑制禾谷縊管蚜卵的孵化。但是目前，國內(nèi)外關(guān)于促生抗病芽孢桿菌的研究主要集中在菌株的分離、抑菌活性分析等水平上，沒有從基因組層面解析菌株的促生效應(yīng)，限制了菌株的應(yīng)用。

本研究旨在篩選出優(yōu)良的植物根際促生芽孢桿菌，從基因組學(xué)的角度上解析菌株促生抗病相關(guān)功能及代謝產(chǎn)物合成機(jī)制，研究菌株基本特性及促生抗病相關(guān)特性，將其促生抗病基因與實(shí)際特性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域提供新的生物資源與基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)提供，編號分別為36124和37383。青霉菌(Penicilliumglaucum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)營養(yǎng)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

LB肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏瓊脂等購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、鉻天青、十六烷基三甲基溴化銨、酪蛋白氨基酸等試劑均為分析純，購于北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；DNA提取及PCR所用試劑均購于北京天根生化科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

阿須貝氏(Ashby)無氮培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，K2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaCO35 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0；有機(jī)磷培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。將配制的培養(yǎng)基分裝滅菌，冷卻至50 ℃每50 mL加入過濾除菌新鮮蛋黃液3 mL。解鉀培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏0.5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，Na2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO31 g/L，鉀長石粉1 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0～7.5；CAS檢測液：鉻天青(chrome azurol sulphonate，CAS)60.5 mg，十六烷基三甲基溴化銨(hexadecy- ltrimethyl-ammonium bromi，HDTMA)72.9 mg，1 mmol/L FeCl3·6H2O 10 mL，去離子水90 mL，充分混勻后滅菌；酪蛋白氨基酸母液：稱取10 g酪蛋白氨基酸溶解于100 mL的去離子水中，0.22 μm的濾膜過濾除菌，4 ℃貯存；MKB培養(yǎng)基：甘油15 mL，K2HPO42.5 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，去離子水定容900 mL，pH 7.0～7.5，滅菌后冷卻，加入100 mL酪蛋白氨基酸母液。

垂直流潔凈工作臺(SCL-1300)，北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；恒溫振蕩器(TH2-C)，太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；海爾立式冷柜(BCD-539)，青島海爾股份有限公司；微型漩渦混合儀(WH-3)，Barloworld Scientific US Ltd；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-SⅡ)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL20M，長沙平凡儀器儀表有限公司；微量高速離心機(jī)(TG16 W)，長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1植物根際促生菌的初篩

稱取10 g土壤，加入含有玻璃珠的90 mL的NaCl溶液(w(NaCl)=0.85%)中，置于37 ℃搖床180 r/min振蕩20 min，將懸浮液涂布于無氮固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d，挑取不同類型的單個典型菌落，經(jīng)平板多次純化后，4 ℃保存在LB平板待用。

1.2.2供試細(xì)菌菌懸液的制備

將待培養(yǎng)菌株以體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(180 r/min，37 ℃)20 h，離心(3 000 r/min，5 min)，無菌水洗滌2次，調(diào)整菌懸液OD600 nm=0.5(菌濃度約為1×108CFU/mL)。

1.2.3植物根際促生菌的復(fù)篩

1)溶磷。將1.2.2中的供試菌株菌液接種于有機(jī)磷培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察有無透明圈，并根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值初步確定菌株解有機(jī)磷的能力。

2)解鉀。將1.2.2中的供試菌株菌液接種于解鉀培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察有無透明圈，并根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值初步確定菌株解鉀的能力。

1.2.4優(yōu)良植物根際促生菌的鑒定

1)全基因組測序。菌株的全基因組測序及分析參考Wu等[11]。按照1.2.2的方法制備菌懸液，離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，檢測合格后進(jìn)行基因組測序、組裝和注釋菌株的基因組信息。基因組測序采用Illumina Hiseq 2 000平臺(GATC Biotech)進(jìn)行。測序后分別進(jìn)行組分、通用功能和特殊功能鑒定。利用基因和基因組百科(KEGG)數(shù)據(jù)庫、同源組簇(Clusters of orthologous groups, COG)和Pfam(https:∥pfam.xfam.org/)預(yù)測功能基因。

2)生理生化及16S rDNA鑒定。挑取少量的LPL-410.7菌體，于LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)20 h。觀察菌株菌落形態(tài)，并革蘭氏染色記錄菌體形態(tài)。采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對糖醇利用、卵磷脂降解、明膠液化、酪素水解等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。

16S rDNA鑒定。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取LPL-410.7菌株基因組DNA，選用細(xì)菌的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACC TTGTTACGACTT-3′)，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后，連接T載體后測序。測序結(jié)果在NCBI上使用BLAST比對，利用MEGA軟件建立菌株LPL-410.7的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5優(yōu)良植物促生菌的特性

1)生長曲線。將活化后的菌株LPL-410.7以體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(37 ℃，180 r/min)，每隔2 h測定菌液的OD600 nm，至OD600 nm無顯著變化為止。

2)耐酸堿和耐鹽特性。用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的初始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；配置不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液(0、1、3、5、7、10和15 g/L)。將菌株LPL-410.7以體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入不同pH和NaCl質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后涂布，測定細(xì)菌數(shù)量。

3)自凝集性。菌株的表面凝集性測定方法參考李文等[12]。按照1.2.2的方法制備菌懸液，離心(5 000 r/min，10 min，25 ℃)，用PBS清洗菌體2次，倒去上清液，用PBS重懸浮菌體，調(diào)節(jié)菌液OD600 nm=0.5±0.05。吸取5 mL菌懸液于離心管中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別于1、2、4、12和24 h時，輕輕吸取200 mL上層懸浮液，測定OD600 nm。菌體表面凝集性計(jì)算公式為：

式中：A0為菌懸液初始吸光度；At為菌懸液靜置后的吸光度。

4)表面疏水性。參考微生物黏著碳?xì)浠衔锓z測菌株的表面疏水性[12]。按照1.2.2的方法制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌液OD600 nm=0.5±0.05，吸取4 mL菌懸液于離心管中，再加入1 mL碳?xì)浠衔?正己烷、乙酸乙酯、二甲苯)，不加碳?xì)浠衔锏淖鳛閷φ战M。將離心管充分渦旋振蕩1 min，混勻后在室溫下靜置，1 h后使用無菌注射器吸取下層水相，以PBS緩沖液作為空白對照，測定OD600 nm。表面疏水性計(jì)算公式為：

式中：A0為對照組吸光度；At為試驗(yàn)組的吸光度。

5)DPPH清除率。參考Tang等[13]的方法測定菌株的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)清除率。將菌株LPL-410.7搖床培養(yǎng)(180 r/min，37 ℃)20 h后離心(5 000 r/min，10 min，25 ℃)，使用0.22 μm的無菌濾膜過濾上清液得到無細(xì)胞上清液(Cell-free supernatants，CFS)。PBS清洗2次菌體，調(diào)整細(xì)菌濃度使得OD600 nm=0.5±0.05，得到完整細(xì)胞懸液(Intact cell，IC)。將上述菌懸液在冰浴中使用超聲破碎儀(超聲3 s，間隔5 s)破碎細(xì)菌15 min，離心(5 000 r/min，10 min，4 ℃)后取上清液，得細(xì)胞破碎物(Cell-free extracts，CFE)。將待測樣品溶液與0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液等體積混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，離心(5 000 r/min，10 min，25 ℃)，測定上清液在517 nm處的吸光度(A1)。DPPH清除率計(jì)算公式為：

式中：A0為DPPH乙醇溶液與PBS混合后的吸光度；A2為乙醇溶液與待測樣品溶液混合后的吸光度。

6)對植物病原菌的抑制效果。將28 ℃培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌菌餅、尖孢鐮刀菌菌餅、青霉菌菌餅、灰霉菌菌餅(直徑5 mm)置于PDA培養(yǎng)基中央，將LPL-410.7菌懸液5 μL接種于距真菌菌餅相等距離的十字交叉線的四端，以單獨(dú)接種病原菌為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

7)分泌水解酶的能力。按照1.2.2的方法制備菌懸液，將5 μL的LPL-410.7菌懸液點(diǎn)接到蛋白酶和纖維素酶鑒定培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察蛋白酶鑒定培養(yǎng)基透明圈有無；在已有菌斑的纖維素酶鑒定培養(yǎng)基中倒入1 mg/mL的剛果紅染料，染色10 min后倒出染料，加入1 mol/L的NaCl溶液脫色15 min，重復(fù)脫色3次后觀察菌落周圍有無透明圈。

8)分泌鐵載體能力檢測。定性檢測：向100 mL的1%瓊脂中加入5 mL CAS檢測液，倒板。待下層瓊脂完全凝固后在其上倒入LB固體培養(yǎng)基。按照1.2.2的方法制備菌懸液，將菌液點(diǎn)接于雙層平板，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察培養(yǎng)基顏色變化。定量檢測：按照1.2.2的方法制備菌懸液，將菌液按照體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接入MKB液體培養(yǎng)基，180 r/min 搖床30 ℃培養(yǎng)48 h，離心(3 500 r/min，15 min，25 ℃)，將上清液與CAS檢測液混合，室溫下反應(yīng)1 h后測定OD630 nm，記為AS；以未接菌的MKB液體培養(yǎng)基上清液同法測定吸光值，記為Ar。細(xì)菌鐵載體能力強(qiáng)弱的計(jì)算公式為：

9)分泌植物激素含量測定。參考張瑩等[14]的方法采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定菌株分泌植物激素(吲哚乙酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素)的能力。將待培養(yǎng)菌株以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)(180 r/min，37 ℃)12、24、36、48和60 h，離心(10 000 r/min，20 min，25 ℃)，取上清液作為待測樣品備用。在酶標(biāo)包被板上加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL作為標(biāo)準(zhǔn)品孔，而樣品孔加入樣品溶液。隨后加入辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)60 min后將板徹底洗滌。隨后，每孔加入底物3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺顯色，反應(yīng)終止后立即測量各孔OD450 nm的值。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均做3組平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS Statistx version 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Ducan’s ANOVA對結(jié)果間的顯著性進(jìn)行比較，P<0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良植物根際促生菌的篩選

氮、磷、鉀是限制植物生長發(fā)育的三大營養(yǎng)元素，本試驗(yàn)從不同的樣品中分離得到20株具有固氮能力的菌株，并對初篩得到的菌株的溶解磷和溶解鉀能力進(jìn)行測定，結(jié)果見表1和表2。僅有6株菌株具有較弱的解鉀能力，分別為LPL-410.7、XZ80、KK3、KK4、ZNLK-1。而供試菌株均具有一定的溶有機(jī)磷能力，其中菌株LPL-410.7的溶有機(jī)磷能力最強(qiáng)，溶磷圈直徑為2.683 cm，可溶性指數(shù)為3.132，顯著高于其他菌株，這與趙龍飛等[15]從地黃中分離出的溶有機(jī)磷能力最強(qiáng)的枯草芽孢桿菌DH71能力基本一致，溶磷圈直徑為2.52～2.82 cm，祁娟等[16]從紫花苜蓿種子中分離的對溶解有機(jī)磷最佳的內(nèi)生菌根瘤菌菌株SL01，可溶性指數(shù)為2.567，可見菌株LPL-410.7在解有機(jī)磷方面具有一定的優(yōu)勢。綜合上述因素，本試驗(yàn)選取LPL-410.7進(jìn)行后續(xù)的分析研究。

表1 菌株溶解鉀能力測試結(jié)果Table 1 Determination results of potassium solubilization of strains

表2 菌株溶解有機(jī)磷能力測試結(jié)果Table 2 Determination results of organophosphorus dissolution of strains

2.2 優(yōu)良植物根際促生菌的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

菌株LPL-410.7在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1(a)，菌株菌落呈乳白色，較光滑，不透明，邊緣較為規(guī)則，呈圓形凸起，菌落直徑2.0～3.0 mm。革蘭氏染色見圖1(b)，經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌，光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察后可發(fā)現(xiàn)菌株為短桿狀形態(tài)。

N為放大倍數(shù)。N is the magnification.

2.2.2生理生化鑒定

表3示出菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株LPL-410.7能夠利用海藻糖、七葉苷、甘露醇、木糖進(jìn)行發(fā)酵，但不能利用麥芽糖。能夠水解淀粉和酪素，降解卵磷脂，使明膠液化。而甲基紅反應(yīng)呈陰性，表明該菌發(fā)酵產(chǎn)酸量少。

表3 LPL-410.7菌株的生理生化試驗(yàn)Table 3 Biophysical and biochemical characteristics of strain LPL-410.7

2.2.316S rDNA序列同源性鑒定

LPL-410.7菌染色體DNA用PCR擴(kuò)增出單一條帶，PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)DNA測序，序列長度為1430 bp。使用NCBI的BLAST功能，將測序獲得的DNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，使用MEGE軟件計(jì)算序列同源性并構(gòu)建基礎(chǔ)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，最終確定菌株為芽孢桿菌屬的貝萊斯芽孢桿菌，與形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定結(jié)果符合。

圖2 基于菌株LPL-410.7和相關(guān)菌株的16SrDNA序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LPL-410.7 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株LPL-410.7基因組序列分析

2.3.1基因組的基本特征

菌株LPL-410.7的染色體全長為3 907 842 bp，沒有質(zhì)粒，GC含量46.66%。LPL-410.7的染色體中共發(fā)現(xiàn)蛋白編碼序列3 743條，RNA中包含27個rRNAs和86個tRNAs(表4)?；蚪M測序深度、GC分布、GC-skew以及基因組結(jié)構(gòu)注釋的整合信息見圖3?；蚪M的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株LPL-410.7與貝萊斯芽孢桿菌的同源性為82.24%。根據(jù)蛋白質(zhì)指定的聚類同源組，所有被鑒定的基因被劃分為23個功能類別(表5)。此外，LPL-410.7(Q類)的2.07%的基因組參與了次級代謝產(chǎn)物的合成、運(yùn)輸、分解。

表4 貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7的基因組特征Table 4 Features of B. velezensis LPL-410.7 genome

圖3 貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7的環(huán)形全基因組圖Fig.3 Circos genome map of B. velezensis LPL-410.7

表5 貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7的COG類Table 5 COG categories of B. velezensis LPL-410

2.3.2植物促生相關(guān)基因分析

堿性磷酸酶、堿性磷酸二酯酶可以將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷酸鹽，是用來評價解有機(jī)磷能力的常用指標(biāo)?；蜃⑨尳Y(jié)果表明，菌株LPL-410.7能夠在phoA、phoB、phoD編碼的堿性磷酸酶和glpQ、gdpP編碼的磷酸二酯酶的作用下，發(fā)揮解有機(jī)磷的重要功能，促進(jìn)植物的對磷元素的吸收。

表6 LPL-410.7解有機(jī)磷相關(guān)基因Table 6 Genes related to degradation of organophosphorus in LPL-410.7 genome

細(xì)菌合成吲哚乙酸主要通過吲哚-3-丙酮酸途徑(Indole-3-pyruvicacid，IPA)、吲哚-3-乙酰胺(Indole-3-acetamide，IAM)途徑和吲哚-3-乙腈(Indole-3-acetonitrile，IAN)3種途徑[17]，由LPL-410.7的IAA(Indole-3-acetic acid，IAA)合成相關(guān)基因(表7)可知，LPL-410.7菌株含有編碼吲哚-3-丙酮酸途徑(IPA)關(guān)鍵酶的基因。該菌株具有能夠編碼吲哚乙酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因(trpABC、patB和aldH)，推測菌株可以色氨酸為前體物質(zhì)，在patB編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)化為吲哚3-丙酮酸，吲哚3-丙酮酸脫羧后變?yōu)檫胚?3-乙醛，隨后在aldH編碼的醛脫氫酶(NAD+)作用下，產(chǎn)生吲哚乙酸。類似地，地衣芽孢桿菌LCDD6含有IPA途徑相關(guān)的patB、aldH，以及IAM途徑合成吲哚乙酸必需的酰胺酶的編碼基因amiE[18]，枯草芽孢桿菌ZJB-603和ATCC21697菌株具有IAN途徑中的關(guān)鍵酶[19]，可見不同菌種之間產(chǎn)生吲哚乙酸的方式存在差異。

表7 LPL-410.7產(chǎn)IAA相關(guān)基因Table 7 Production of IAA related genes in LPL-410.7 genome

細(xì)菌可以通過依賴于非核糖體肽(NRPS)途徑合成鐵載體，通過對LPL-410.7基因組的功能注釋發(fā)現(xiàn)，菌株具有兒茶酚鹽型鐵載體合成相關(guān)的基因(表8)，由基因entB、dhbB、entC、entA編碼的產(chǎn)物參與兒茶酚鹽型鐵載體相關(guān)的前體物2，3-二羥基苯甲酸(2,3-dihydroxybenzoic acid，DHB)的合成，dhbF、dhbE參與DHB和氨基酸連接形成單體物后轉(zhuǎn)化為鐵載體的過程。

表8 LPL-410.7產(chǎn)鐵載體相關(guān)基因Table 8 Genes related to siderophore-producing in LPL-410.7 genome

2.3.3植物抗病相關(guān)基因分析

基因功能注釋結(jié)果(表9)顯示，貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7基因組中含有屬于非核糖體多肽合成酶(Nonribosomal peptide synthetase，NRPS)途徑的表面活性素(Surfactin)、豐原素(Fengycin)、溶桿菌素(Bacilysin)和嗜鐵素(Bacillibactin)4類抑菌物質(zhì)合成相關(guān)基因，以及由含有聚酮合酶體系的非核糖體肽合成酶體系(Polyketides-nonribosomal peptidesynthetase，PKS-NRPS)途徑催化合成伊枯草素(Iturin)和聚酮類化合物(Bacillaene)的相關(guān)基因。此外，菌株含有編碼纖維素酶合成基因engA、engB、engC，在基因組的水平上預(yù)測LPL-410.7能產(chǎn)生內(nèi)切纖維素酶(Endo-1,4-β-D-glucanohydrolase)。

表9 LPL-410.7抑菌代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因Table 9 Genes related to the synthesis of antimicrobial metabolites in LPL-410.7 genome

2.4 菌株LPL-410.7的特性探究

2.4.1生長曲線

菌株LPL-410.7在0～6 h內(nèi)為生長延滯期，6 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，OD600 nm值迅速增加，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖4)。培養(yǎng)24 h，OD600 nm值為1.56，達(dá)到最大菌落數(shù)8.9×108CFU/mL。該菌在生長前期會產(chǎn)生少量的酸，使培養(yǎng)基pH降低0.3左右，培養(yǎng)12 h后pH逐漸升高。

圖4 菌株LPL-410.7的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain LPL-410.7

2.4.2耐酸堿和耐鹽特性

生物菌肥的效果易受土壤類型、鹽堿等非生物因素的影響，因此優(yōu)良植物根際促生菌的廣泛生態(tài)適應(yīng)性是其在田間發(fā)揮效果的前提條件[29]。LPL-410.7具有較好的酸堿耐受性((圖5(a))，當(dāng)pH為5～7時，菌株的生長未受影響。pH為8～9時，菌株的生長情況受的影響較小。當(dāng)pH繼續(xù)減小至5以下或上升至10時，LPL-410.7的細(xì)菌數(shù)量顯著降低。圖5(b)示出鹽耐受試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)ρ(NaCl)為0～5 g/L時，菌株的生長情況未受明顯影響，當(dāng)ρ(NaCl)為7 g/L時，細(xì)菌數(shù)量下降了約3.5個數(shù)量級，當(dāng)ρ(NaCl)為10和15 g/L時，細(xì)菌數(shù)量分別降為3.19和3.05 lg(CFU/mL)。說明就菌株的耐受性而言，LPL-410.7菌株對酸堿和鹽有很強(qiáng)的耐受性，這與陳臘等[30]從的玉米根際土壤中篩選出3株高效解鉀促生芽孢桿菌對酸堿和鹽濃度的穩(wěn)定性基本一致，且LPL-410.7菌株在ρ(NaCl)為7～15 g/L的NaCl仍能存活，可見菌株LPL-410.7在鹽耐受方面具有一定的優(yōu)勢。

柱子上方不同字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)，豎線表示標(biāo)準(zhǔn)差，圖6和圖7同。Different letters above the column show significant difference at P<0.05 level, the vertical bar above the column shows the standard deviation, the same in Figs 6 and 7.

2.4.3表面特性

在菌株靜置培養(yǎng)的前1 h內(nèi)，LPL-410.7的自凝集率為18.23%，隨著時間的增加，凝集率也逐漸增加，24 h后達(dá)到88.77%((圖6(a))，說明該菌株具有較好的定植于植物根際及周圍土壤的潛力。菌株LPL-410.7對乙酸乙酯和二甲苯的疏水性中等，分別為33.16%和27.29%，而對正己烷疏水性較弱((圖6(b))。

圖6 菌株LPL-410.7的表面特性Fig.6 Surface characteristics of strain LPL-410.7

2.4.4DPPH自由基清除率

圖7示出菌株LPL-410.7不同組分(無細(xì)胞發(fā)酵上清液、完整細(xì)胞菌懸液和細(xì)胞破碎物)對DPPH自由基的清除率。菌株的細(xì)胞破碎物對DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)不如發(fā)酵上清液和完整細(xì)胞菌懸液，僅為6.63%，而發(fā)酵上清液表現(xiàn)出較好的DPPH清除能力(51.51%)，比完整細(xì)胞菌懸液的DPPH清除率高約13.94%。

圖7 菌株LPL-410.7不同組分對DPPH自由基的清除能力Fig.7 The DPPH free radical scavenging capacity of different components of strain LPL-410.7

2.4.5對多種植物病原菌的抑制效果

采用平板對峙法測定菌株LPL-410.7對不同植物病原真菌的抑菌能力，抑菌效果見圖8：菌株對4種病原真菌均具有一定的抑制作用，其中對灰孢菌的抑菌帶寬為(29.28±0.18) mm，顯著高于對其他3種病原菌的抑菌帶寬。菌株對立枯絲核菌、青霉菌和尖孢鐮刀菌的抑菌帶寬分別為(22.86±0.08)、(23.02±0.14)和(22.14±0.12) mm。

圖8 菌株LPL-410.7對不同病原菌的抑制作用Fig.8 Inhibition of strain LPL-410.7 against different pathogens

2.4.6分泌水解酶的能力

蛋白酶和纖維素酶是一類能抑制病原菌的抑菌相關(guān)蛋白。LPL-410.7在蛋白酶鑒定培養(yǎng)基、纖維素酶鑒定培養(yǎng)基中均產(chǎn)生了透明水解圈(圖9)，說明LPL-410.7可以產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶。類似地，王卉等[31]研究發(fā)現(xiàn)具有促生抗病功效的芽孢桿菌L-S60能產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，Trinh等[32]從黑胡椒根際中分離的貝萊斯芽孢桿菌RB.DS29產(chǎn)生的蛋白酶能夠破壞疫霉菌的細(xì)胞壁。因此，我們推測菌株LPL-410.7能夠通過產(chǎn)生蛋白酶和纖維素酶，破壞真菌的細(xì)胞壁，從而對立枯絲核菌、灰孢菌、尖孢鐮刀菌和青霉菌產(chǎn)生抑制作用。

圖9 菌株LPL-410.7分泌水解酶的能力Fig.9 Ability of strain LPL-410.7 to secrete hydrolase

2.4.7分泌鐵載體的能力

鐵載體是微生物分泌的一種小分子鐵離子螯合物，具有幫助植物吸收利用土壤中的鐵元素的作用[33]。將貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7接種于CAS雙層平板上，菌株的菌落周圍出現(xiàn)明顯黃色暈圈(圖10)，說明該菌株具有分泌鐵載體的能力。采用CAS檢測法定量測定菌株分泌鐵載體的能力，結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7鐵載體的相對表達(dá)量為(51.78±0.82)%，具有較好的分泌鐵載體的能力。類似地，李雪艷等[34]從棉株體內(nèi)及根系土壤中篩選得到的4株產(chǎn)鐵載體的細(xì)菌，其中產(chǎn)鐵載體能力最好的菌株萎縮芽孢桿菌SHZ-24產(chǎn)量可達(dá)(31.80±2.06)%，可見LPL-410.7菌株在產(chǎn)鐵載體能力方面具有較好的能力。

圖10 菌株LPL-410.7分泌鐵載體的能力Fig.10 Ability of strain LPL-410.7 to secrete siderophores

2.4.8分泌植物激素的能力

吲哚乙酸IAA能促進(jìn)植物種子萌發(fā)、細(xì)胞分化和根系發(fā)育[35]，赤霉素(Gibberellins，GA)能解除種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)和莖的伸長[36]。采用ELISA試劑盒測定貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素(Cytokinin，CTK)的能力結(jié)果見圖11。該菌株能夠具備分泌吲哚乙酸的能力，培養(yǎng)12 h后已能產(chǎn)生21.69 μg/L的吲哚乙酸，且隨著時間的增長，菌株分泌吲哚乙酸的能力呈先上升后下降的趨勢。類似地，菌株分泌細(xì)胞分裂素的能力也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在培養(yǎng)48 h時產(chǎn)細(xì)胞分裂素的能力達(dá)到最大(30.44 μg/L)，60 h后細(xì)胞分裂素產(chǎn)量迅速下降至16.05 μg/L。菌株產(chǎn)赤霉素的能力在24 h時達(dá)到最大(266.74 ng/L)，36 h時赤霉素產(chǎn)量下降至209.13 ng/L，之后赤霉素產(chǎn)量趨于平穩(wěn)，48和60 h時產(chǎn)量與36 h時相比無顯著差異(P>0.05)。目前研究報道的能分泌植物激素的促生菌主要為固氮螺菌屬、黃桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌、假單胞菌等菌屬[37]，對于貝萊斯芽孢桿菌的研究甚少。在本試驗(yàn)的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌LPL-410.7具有分泌吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素和赤霉素多種激素的能力，說明其作為根際促生菌具有較大的潛力。

圖11 菌株LPL-410.7分泌植物激素的能力Fig.11 Ability of strain LPL-410.7 to secrete plant hormones

3 結(jié) 論

本研究從植物根際土壤中篩選獲得1株具有很強(qiáng)的促生抗病潛力的微生物菌株LPL-410.7，并將該菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。全基因組分析結(jié)果顯示，LPL-410.7中含有與菌株產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸、堿性磷脂酶、纖維素酶和脂肽合成酶等促進(jìn)植物生長相關(guān)的功能基因59個。進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPL-410.7能夠分泌蛋白酶及纖維素酶，能產(chǎn)生相對表達(dá)量為51.78%的鐵載體，亦能產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素。這與菌株解有機(jī)磷、產(chǎn)生促生抗病相關(guān)物質(zhì)(鐵載體、吲哚乙酸、纖維素酶和蛋白酶)的實(shí)際功能相符合。此外，菌株特性分析表明LPL-410.7在pH為3～10和ρ(NaCl)為0～15 g/L時均能存活；菌株自凝集性達(dá)到88.77%，且具有較強(qiáng)的DPPH自由基的清除能力。本研究還發(fā)現(xiàn)LPL-410.7有編碼與抑菌相關(guān)的脂肽類化合物合成基因，但菌株LPL-410.7是否能分泌有活性的脂肽類代謝產(chǎn)物仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。