廖太陽 ，張力 ，楊楠 ，魏義保 ，呂璟先 ，徐波 ，丁亮 ，王培民 ，張立 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院骨傷科，南京 009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，江蘇 蘇州 5007）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種全關(guān)節(jié)疾病，該病病因復(fù)雜，軟骨退變是其核心病理環(huán)節(jié)[1]。軟骨退變主要是由于軟骨細(xì)胞合成代謝及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分解代謝平衡失調(diào)所致，因此，維持軟骨組織自身的代謝平衡在KOA的治療中具有十分關(guān)鍵的作用，對于延緩KOA發(fā)展進(jìn)程至關(guān)重要[2]。研究顯示，以血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶4（disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，ADAMTS-4）、ADAMTS-5、基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase3，MMP-3）、MMP-13為代表的膠原水解酶，對關(guān)節(jié)軟骨具有破壞作用[3—4]；而聚集蛋白聚糖（Aggrecan）對關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用[5—6]。另外，越來越多的研究表明，調(diào)控腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路對軟骨具有保護(hù)效應(yīng)[7—9]。

基于KOA中醫(yī)學(xué)“寒、瘀、虛”的病機(jī)特點，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科王培民教授研制了中藥復(fù)方——膝痹寧方（XBN），該方由制狗脊、山萸肉、生薏苡仁、川牛膝、制何首烏、生甘草等11味中藥組成，且已獲國家專利（專利號為CN201010514325），在臨床上主要用于治療骨關(guān)節(jié)退行性疾病導(dǎo)致的慢性疼痛，療效顯著[10—11]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，XBN可改善KOA模型大鼠的滑膜炎癥和疼痛[12]，但具體作用機(jī)制尚不明確。基于此，筆者擬基于AMPK/mTOR信號通路探討XBN改善KOA的作用機(jī)制，以期為XBN的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括AB7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）系統(tǒng)（美國ABI公司），HistoCore型組織切片機(jī)、TP1020型組織脫水機(jī)、KD-BMⅢ型組織包埋機(jī)、MI-3000B型倒置顯微鏡（德國Leica公司），BioPhotometer-Plus型多功能核酸蛋白檢測系統(tǒng)（德國Eppendorf公司），170-3930型垂直凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），LAS4000型凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)（美國GE公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

制狗脊、山萸肉、生薏苡仁、川牛膝、制何首烏、生甘草藥材均購自康美藥業(yè)股份有限公司（批號分別為211201171、220101031、220202271、220200041、211003211、211200251），巴戟天、炒白芍（批號分別為220100129、220400529）購自康美（亳州）世紀(jì)國藥有限公司，淡附片（批號22030206）購自康美滕王閣（四川）制藥有限公司，桂枝（批號220101）購自普寧市澤群中藥飲片有限公司，紫河車（批號211001）購自安徽道源堂中藥飲片有限公司。上述藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科王培民教授鑒定為真品。二甲雙胍（AMPK激動劑，批號R000310）購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；番紅O-固綠染色試劑盒（批號YM1011）購自南京伊爾美生物科技有限公司；兔源ADAMTS-4多克隆抗體、兔源ADAMTS-5多克隆抗體（批號分別為A02899、A02802-1）均購自美國Boster公司；兔源Aggrecan多克隆抗體、兔源MMP-3多克隆抗體、兔源MMP-13多克隆抗體、小鼠源GAPDH單克隆抗體（批號分別為13880-1-AP、17873-1-AP、18165-1-AP、60004-1-Ig）均購自美國 Proteintech公司；兔源AMPK單克隆抗體、兔源磷酸化AMPK（p-AMPK）單克隆抗體、mTOR單克隆抗體、兔源磷酸化mTOR（p-mTOR）單克隆抗體（批號分別為2532S、50081S、2983S、5536S）均購自美國CST公司；辣根酶素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號K1223）均購自美國APExBIO公司；BCA試劑盒（批號P0012）購自上海Beyotime公司；青霉素鈉（批號F0112104）購自華北制藥股份有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用實驗動物為SPF級SD雄性大鼠，共36只，體質(zhì)量190～200 g，2月齡，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（浙）2019-0002。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)于光/暗各12 h、室溫（25±2） ℃、相對濕度（60±5）%的動物房內(nèi)，自由攝食、飲水。動物實驗方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為ACU210101。

2 方法

2.1 藥物制備

按照文獻(xiàn)[10]方法將XBN的11味中藥按處方比例稱取適量，將除淡附片、紫河車的其余9味中藥加8倍量（g/mL，下同）水浸泡30 min。用武火將淡附片煎至沸騰，再以文火煎30 min，加入上述浸泡后的中藥，煎至沸騰后繼續(xù)煎煮30 min，濾過；再加6倍量水，煎至沸騰后再煎30 min，濾過；合并2次濾液，最后加入研磨成粉的紫河車，濃縮成質(zhì)量濃度為1.2 g/mL（以生藥量計）的XBN溶液。

2.2 動物分組、給藥與造模

將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、XBN組（12.56 g/kg，劑量為臨床等效劑量）和XBN+二甲雙胍組（12.56 g/kg XBN+100 mg/kg二甲雙胍，二甲雙胍劑量參考文獻(xiàn)[13]設(shè)置），每組9只?？瞻捉M大鼠僅切開皮膚而不開放膝關(guān)節(jié)腔，其余各組大鼠采用離斷前交叉韌帶的方法建立KOA模型[14]，具體方法如下：用2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，備皮、消毒，縱向切口打開膝關(guān)節(jié)腔，髕骨脫位后用手術(shù)刀離斷前交叉韌帶，然后逐層縫合；術(shù)后連續(xù)肌內(nèi)注射青霉素鈉3 d以預(yù)防感染。造模14 d后，大鼠前抽屜試驗陽性，表明造模成功?？瞻捉M與模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠給予相應(yīng)藥物，XBN和生理鹽水每天灌胃1次，二甲雙胍隔天腹腔注射1次，連續(xù)4周。

2.3 大鼠軟骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察

采用番紅O-固綠染色法進(jìn)行檢測。末次給藥24 h后，將各組大鼠處死，剖取軟骨組織。取3只大鼠的軟骨組織（其余大鼠軟骨組織于-80 ℃下保存?zhèn)溆茫┣謇砀蓛艉罅魉疀_洗，置于4%多聚甲醛中固定3～5 d，再以10% EDTA溶液脫鈣4周；經(jīng)梯度濃度的乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋后，切片（厚度為5 μm）；將切片脫蠟至水后，進(jìn)行番紅O-固綠染色，以自來水沖洗后，用1%冰醋酸分色3 s，經(jīng)無水乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片后，觀察各組大鼠軟骨組織的病理學(xué)形態(tài)并拍照，參照Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)評估大鼠軟骨組織的病理形態(tài)學(xué)變化[15]。

2.4 大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平的檢測

采用免疫熒光染色法進(jìn)行測定。每組隨機(jī)取3只大鼠凍存的軟骨組織，按“2.3”項下方法制備石蠟切片，使用二甲苯和梯度濃度的乙醇分別進(jìn)行脫蠟和水合后，滴加適量的EDTA完成抗原修復(fù)，滴加3%BSA溶液封閉30 min；加入Aggrecan一抗（稀釋度為1∶500），于4 ℃孵育過夜；滴加二抗，于室溫孵育1 h；滴加DAPI染色液，于室溫下靜置15 min；用水沖洗后，滴加適量抗熒光淬滅劑，轉(zhuǎn)移組織切片于顯微鏡下進(jìn)行觀察（Aggrecan蛋白的陽性表達(dá)呈紅色熒光），使用Image J v1.53f軟件分析各組蛋白的熒光強(qiáng)度（熒光強(qiáng)度越大，表示蛋白表達(dá)水平越高）。

2.5 大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測

采用qPCR方法進(jìn)行檢測。每組隨機(jī)取3只大鼠凍存的軟骨組織，經(jīng)液氮研磨裂解后，常規(guī)提取軟骨組織總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR（PCR引物序列和產(chǎn)物長度見表1）。PCR反應(yīng)體系為上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA的表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物長度

2.6 大鼠軟骨組織中分解代謝和AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法進(jìn)行測定。每組隨機(jī)取3只大鼠凍存的軟骨組織，經(jīng)液氮研磨裂解后，離心，取上清液15 μL測定蛋白含量，其余上清液煮沸變性，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h；加入GAPDH、ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR一抗（稀釋度分別為1∶50 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜；以TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），室溫孵育1 h；以TBST溶液洗膜10 min×3次，加入ECL顯色，采用凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)顯影曝光。采用Image J v1.53f軟件對各組蛋白條帶進(jìn)行分析，以ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示其表達(dá)水平；以p-AMPK與AMPK、p-mTOR與mTOR的灰度值比值表示AMPK、mTOR的磷酸化水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用GraphPad 7.04軟件繪圖。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 XBN對模型大鼠軟骨組織病理學(xué)形態(tài)的影響

空白組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)完整，層次分明，呈現(xiàn)均勻紅色，軟骨淺表層光滑完整，軟骨細(xì)胞規(guī)律排列，潮線清晰可見，軟骨下骨呈現(xiàn)藍(lán)色，軟骨下骨板厚度正常。模型組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)分層紊亂，軟骨損傷至輻射層，軟骨層明顯變薄且軟骨淺表層不平滑，軟骨層基質(zhì)淡染，軟骨細(xì)胞排列紊亂，潮線出現(xiàn)扭曲或中斷，軟骨下骨與軟骨層難以區(qū)分。XBN組大鼠軟骨退變程度位于空白組與模型組之間，軟骨淺表層較為光滑、缺損減少，軟骨結(jié)構(gòu)分層較為清晰，基質(zhì)染色相對均勻，軟骨細(xì)胞排列較為規(guī)則，潮線尚完整。XBN+二甲雙胍組大鼠軟骨病變程度較XBN組進(jìn)一步減輕。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠軟骨組織病理形態(tài)學(xué)顯微圖（番紅O-固綠染色，×200）

Mankin評分結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠Mankin評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠Mankin評分均顯著降低（P＜0.05）；與XBN組比較，XBN+二甲雙胍組大鼠Mankin評分顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.2 XBN對模型大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。與XBN組比較，XBN+二甲雙胍組大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表2。

表2 各組大鼠Mankin評分和軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

表2 各組大鼠Mankin評分和軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與XBN組比較，P＜0.05

組別空白組模型組XBN組XBN+二甲雙胍組Mankin評分1.16±0.55 8.33±0.82a 3.25±0.61b 2.08±0.66c Aggrecan蛋白表達(dá)水平44.75±0.96 3.80±0.89a 24.19±0.92b 29.92±0.42c

圖2 各組大鼠軟骨組織中Aggrecan蛋白表達(dá)的免疫熒光圖（×200）

3.3 XBN對模型大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨組織中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）；與XBN組比較，XBN+二甲雙胍組大鼠軟骨組織中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

表3 各組大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與XBN組比較，P＜0.05

組別空白組模型組XBN組XBN+二甲雙胍組ADAMTS-4 mRNA 1.00±0.00 1.91±0.08a 1.48±0.07b 1.23±0.04c ADAMTS-5 mRNA 1.00±0.00 1.61±0.08a 1.37±0.06b 1.19±0.08c MMP-3 mRNA 1.00±0.00 2.57±0.06a 1.91±0.04b 1.66±0.11c MMP-13 mRNA 1.00±0.00 2.23±0.07a 1.62±0.07b 1.38±0.05c

3.4 XBN對模型大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨組織中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）；與XBN組比較，XBN+二甲雙胍組上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

圖3 各組大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

表4 各組大鼠軟骨組織中分解代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與XBN組比較，P＜0.05

MMP-13/GAPDH 0.43±0.07 1.66±0.07a 1.37±0.06b 0.89±0.13c組別空白組模型組XBN組XBN+二甲雙胍組ADAMTS-4/GAPDH 0.21±0.09 1.33±0.07a 0.48±0.03b 0.33±0.04c ADAMTS-5/GAPDH 0.28±0.06 1.21±0.16a 0.65±0.07b 0.36±0.06c MMP-3/GAPDH 0.53±0.12 1.83±0.11a 1.25±0.09b 0.81±0.08c

3.5 XBN對模型大鼠軟骨組織中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠軟骨組織中AMPK蛋白的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），mTOR蛋白的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨組織上述指標(biāo)水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）；與XBN組比較，XBN+二甲雙胍組大鼠軟骨組織中AMPK蛋白的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），mTOR蛋白的磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表5。

圖4 各組大鼠軟骨組織中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表5 各組大鼠軟骨組織中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平測定結(jié)果（±s，n=3）

表5 各組大鼠軟骨組織中AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平測定結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與XBN組比較，P＜0.05

p-mTOR/mTOR 0.21±0.03 2.56±0.09a 1.62±0.09b 0.88±0.11c組別空白組模型組XBN組XBN+二甲雙胍組p-AMPK/AMPK 1.98±0.13 0.32±0.05a 0.71±0.07b 1.19±0.06c

4 討論

KOA歸屬于中醫(yī)“痹證”“痿證”“骨痹”“筋痹”等范疇，病機(jī)多為本虛標(biāo)實，肝腎不足為本，風(fēng)寒濕邪氣外侵為標(biāo)[1]。XBN具有補(bǔ)益肝腎、溫經(jīng)散寒、柔肝養(yǎng)血的功效[10]。本課題組前期研究顯示，XBN對KOA具有較好的治療作用[10—12]，但具體作用機(jī)制至今尚未完全闡明。本研究通過對KOA模型大鼠的軟骨組織進(jìn)行番紅O-固綠染色發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)分層紊亂，表面不平整，軟骨細(xì)胞分布不均勻，軟骨層基質(zhì)淡染，潮線出現(xiàn)中斷，且Mankin評分顯著升高；經(jīng)過XBN或XBN+二甲雙胍干預(yù)后，大鼠軟骨上述病理改變均明顯減輕，且Mankin評分明顯降低。這表明XBN能明顯改善大鼠軟骨組織的病理損傷。

KOA最顯著的病理變化是關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)式的降解、退變和破壞，表現(xiàn)為軟骨蛋白合成酶減少而分解酶大量釋放，從而導(dǎo)致軟骨膠原亞型發(fā)生改變，軟骨厚度變薄、破損，進(jìn)而失去正常的生物學(xué)功能[3—6]。本研究通過檢測各組大鼠軟骨合成和分解代謝指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠軟骨組織中合成代謝指標(biāo)Aggrecan蛋白表達(dá)水平顯著降低，分解代謝指標(biāo)ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著升高。經(jīng)過XBN或XBN+二甲雙胍干預(yù)后，大鼠軟骨組織中上述指標(biāo)水平均顯著逆轉(zhuǎn)。這說明XBN可促進(jìn)軟骨合成Aggrecan，減少軟骨降解，從而發(fā)揮改善KOA的作用。

AMPK是一種保守的異質(zhì)三聚體蛋白激酶，能通過影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量供求平衡，被稱為人體代謝的“總開關(guān)”和“能量感受器”[16]。相關(guān)研究顯示，在小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨和衰老的軟骨細(xì)胞中均觀察到AMPK活性的降低[8]。在異常應(yīng)力、氧化應(yīng)激等因素的作用下，軟骨細(xì)胞可激活A(yù)MPK，阻斷mTOR的磷酸化，并通過調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子κB/沉默信息調(diào)節(jié)因子1等信號通路，降低白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α等炎癥因子表達(dá)，保護(hù)軟骨細(xì)胞并抑制炎癥[9]。二甲雙胍是一種AMPK激動劑，被證明可通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路，減輕小鼠內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù)后的關(guān)節(jié)軟骨破壞[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)XBN或XBN+二甲雙胍干預(yù)后，大鼠軟骨組織中AMPK蛋白的磷酸化水平顯著升高，mTOR蛋白的磷酸化水平顯著降低。這表明，XBN可通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路改善KOA。

綜上所述，XBN可改善KOA模型大鼠的軟骨損傷，促進(jìn)軟骨合成，減少軟骨降解，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR信號通路有關(guān)。