萬安平 ，張婧 ，周雄 ，馮育林 ，劉駿 ，何瑤 ， ，李翔 （.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 330004）

白頭翁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge） Regel的干燥根[1]。白頭翁皂苷B4（anemoside B4，AB4）是白頭翁中的五環(huán)三萜皂苷成分之一，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2]。然而AB4為水溶性藥物，在血漿中的半衰期短、代謝快，在腫瘤部位的富集量較少，這在一定程度上限制了其應(yīng)用[3]。程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）是一種在腫瘤表面大量表達(dá)的免疫抑制分子，阻斷免疫檢查點PD-L1/程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）可以抑制癌細(xì)胞的激活，進(jìn)而提高腫瘤免疫治療的效應(yīng)[4]。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）是一種長度為21～25 bp的雙鏈RNA，其可通過RNA干擾作用沉默相關(guān)基因來達(dá)到治療疾病的作用[5]。PD-L1 siRNA（簡稱為“siP”）可通過誘導(dǎo)內(nèi)源性mRNA降解來下調(diào)腫瘤細(xì)胞中PD-L1的水平，從而激活T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性[6]。但是游離siP的穩(wěn)定性差，難以穿透生物屏障，且靶向遞送效率低[7]。因此，設(shè)計一種可實現(xiàn)靶向遞送siP的有效載體具有重要意義。

脂質(zhì)體是目前研究最多、應(yīng)用最廣的遞送系統(tǒng)，可改善藥物的穩(wěn)定性[8]。將AB4和siP共同包載于脂質(zhì)體囊泡中，有望延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間，從而提高其在腫瘤組織的分布。環(huán)精氨酰甘氨酸天冬氨酸序列[cyclo（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys），cRGD]是一種可與αβ整合素受體結(jié)合的環(huán)肽[9]，而αvβ3整合素受體在非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織和腫瘤血管細(xì)胞表面高度表達(dá)[10]。因此，本研究首先將AB4和siP共裝載于脂質(zhì)體中，然后利用cRGD可與αvβ3整合素受體結(jié)合的優(yōu)勢，對脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，制備AB4和siP共遞送cRGD修飾靶向脂質(zhì)體（AB4/siP-c-L），以提高脂質(zhì)體的腫瘤主動靶向性，為其后續(xù)抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Gallios型流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司），JEM-2100型高分辨率透射電子顯微鏡（日本Jeol公司），Chemi Doc XRS型凝膠成像儀、Mini-Sub Cell GT Cell小型水平電泳槽（美國Bio-Rad公司），LSM-710型共聚焦激光掃描顯微鏡（德國Zeiss公司），ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司），LC-20AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），Nano ZS型粒度測定儀（英國Malvern公司）。

1.2 主要藥品與試劑

AB4原料藥（批號2018042505，純度＞98.0%）購自江西本草天工科技股份有限公司；熒光染料Alexa Fluor 647標(biāo)記的siP（siP647）、熒光染料FAM標(biāo)記的siP（siPFAM）、陰性對照siRNA均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）均購自德國Lipoid GmbH公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-cRGD（DSPE-PEG 2000-cRGD）購自西安瑞禧生物科技有限公司；（1，2-二油?；?丙基）-三甲基銨-氯鹽（DOTAP）及高純度膽固醇均購自艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰酶均購自德國Gibco公司；瓊脂糖購自北京亞米生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞LLC購自美國菌種保藏中心。

2 方法和結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

（1）采用乙醇注入法制備cRGD修飾的AB4靶向脂質(zhì)體（AB4-c-L）[11]。將AB4溶于乙醇中得到濃度為16 mmol/L的AB4乙醇溶液，將HSPC、DOTAP、膽固醇、DSPE-PEG 2000-cRGD、DSPE-PEG 2000（物質(zhì)的量之比為8.3∶25∶7.2∶0.1∶0.9）溶于上述AB4乙醇溶液中，超聲（60 ℃，50 kHz，5 min）使其完全溶解，然后緩慢注入到2 mL 5%葡萄糖溶液中，60 °C水化1 h，探頭超聲（300 W，10 min）。將所得納米混懸液置于透析管中，在5%葡萄糖溶液中透析4 h，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集濾液，即得AB4-c-L。（2）將DSPE-PEG 2000-cRGD替換為DSPE-PEG 2000，同法操作制備未經(jīng)cRGD修飾的載AB4脂質(zhì)體（AB4-L）。（3）將所得AB4-c-L與20 nmol/L的siP等體積混合，室溫孵育30 min，通過靜電吸附得到AB4/siP-c-L。（4）使用 siP647、siPFAM代替 siP，同法制備AB4/siP647-L、AB4/siP647-c-L和AB4/siPFAM-c-L。

2.2 AB4/siP-c-L的表征

2.2.1 粒徑和Zeta電位測定 分別取AB4-L、AB4-c-L和AB4/siP-c-L混懸液各100 μL，用5%葡萄糖溶液稀釋至2 mL，混勻，采用激光散射粒徑測定儀測定其粒徑及Zeta電位。每個樣品平行測定3次。結(jié)果顯示，AB4-L、AB4-c-L、AB4/siP-c-L的平均粒徑分別為（180.6±0.3）、（190.7±1.2）、（187.4±3.1） nm，Zeta電位分別為（51.4±1.3）、（49.2±1.2）、（33.5±1.4） mV。

2.2.2 形態(tài)觀察 將AB4/siP-c-L混懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取適量滴加于銅網(wǎng)上，靜置5 min，用2%磷鎢酸染色10 min，晾干，置于透射電子顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，AB4/siP-c-L呈類球形，分散良好。結(jié)果見圖1。

圖1 AB4/siP-c-L的透射電鏡圖

2.2.3 AB4包封率和含量測定 采用高效液相色譜法測定AB4含量。色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（8∶17，V/V），柱溫為25 ℃，檢測波長為201 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。經(jīng)方法學(xué)考察，結(jié)果符合2020年版《中國藥典》（四部）通則要求[12]。

通過超濾離心法測定脂質(zhì)體對AB4的包封率[13]。將400 μL AB4/siP-c-L混懸液置于Ultra-4超濾離心管（截留分子量為10 kDa）中，以10 000 r/min離心15 min，收集濾液；取濾液按上述色譜條件進(jìn)樣測定，得到脂質(zhì)體中游離AB4的含量（Mfree）。取400 μL AB4/siP-c-L混懸液V脂質(zhì)體，用甲醇稀釋至2 mL，然后按上述色譜條件進(jìn)樣測定，得到脂質(zhì)體中AB4的總量（Mtotal）。通過下列公式分別計算脂質(zhì)體中AB4的包封率和藥物含量：包封率（%）＝（Mtotal-Mfree）/Mtotal×100%；藥物含量＝（Mtotal-Mfree）/V脂質(zhì)體。結(jié)果顯示，AB4在AB4/siP-c-L中的包封率為（95.2±0.4）%，含量為（1.0±0.2） mg/mL。

2.2.4 siP包裹能力考察 采用瓊脂糖凝膠電泳法考察脂質(zhì)體對siP的包裹能力。將AB4-c-L與20 nmol/L siP混合，使得AB4-c-L混懸液中DOTAP的氮（N）與siP中的磷（P）的物質(zhì)的量之比為10∶1，室溫孵育30 min，作為樣品；以等量的游離siP（20 nmol/L）和AB4-c-L混懸液作為陰性對照樣品，同法操作。將上述樣品分別與上樣緩沖液混合，依次上樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（電壓75 mV，時間60 min），于凝膠成像系統(tǒng)中成像。結(jié)果顯示，當(dāng)AB4-c-L中N和P的物質(zhì)的量之比為10∶1時，電泳條帶消失，提示AB4-c-L可將siP完全包裹。結(jié)果見圖2。

圖2 AB4/siP-c-L對siP的包裹能力考察的電泳圖

2.2.5 血清穩(wěn)定性考察 將AB4/siP-c-L與FBS等體積混合，在37 ℃孵育，分別在0、1、2、4、8、12、24 h時取出24 μL的AB4/siP-c-L于離心管中，向離心管中加入6 μL上樣緩沖液，渦旋混勻，作為待測樣品；以等量的游離siP（20 nmol/L）作為陰性對照樣品，同法操作。將上述樣品分別上樣至1.2%的瓊脂糖凝膠各泳道中，設(shè)置電泳參數(shù)為電壓75 mV、時間60 min，采用凝膠成像系統(tǒng)成像。結(jié)果顯示，游離的siP在FBS中2 h后開始降解（條帶顏色變淺），且時間越長，降解越完全；而AB4/siP-c-L在FBS中8 h后仍存在，表明AB4/siP-c-L能提高siP在血清中的穩(wěn)定性。結(jié)果見圖3。

圖3 AB4/siP-c-L血清穩(wěn)定性考察的電泳圖

2.2.6 體外釋放行為考察 采用透析袋擴(kuò)散法考察AB4/siP-c-L的體外釋放行為。分別取適量的AB4溶液和AB4/siP-c-L混懸液，置于截留分子量為10 kDa的透析袋中，然后將透析袋分別置于100 mL不同pH（pH7.4、6.0、5.0）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，于37 ℃、150 r/min條件下考察AB4/siP-c-L中AB4在PBS中的釋放行為。分別于 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h時取樣，同時補(bǔ)充相同溫度和相同體積的釋放介質(zhì)，按“2.2.3”項下方法測定釋放介質(zhì)中AB4的含量。每個時間點平行測定3次。以釋放時間為橫坐標(biāo)、AB4累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制釋放曲線，結(jié)果見圖4。如圖4所示，與AB4溶液相比，AB4/siP-c-L中AB4在不同pH條件下均未見明顯突釋，說明AB4/siP-c-L具有緩釋作用。同時，AB4/siP-c-L的釋放具有pH敏感性，隨著pH的降低，AB4/siP-c-L中AB4的釋放越快；在pH5.0條件下，AB4/siP-c-L中AB4的48 h累積釋放率分別是pH6.0、pH7.4條件下的1.4、2.4倍。

圖4 AB4/siP-c-L中AB4在不同pH釋放介質(zhì)中的體外釋放曲線（±s，n=3）

2.3 LLC細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取考察

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)考察LLC細(xì)胞對熒光標(biāo)記制劑的攝取量。將LLC細(xì)胞按每孔1×106個接種于24孔板上，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為空白對照組、siP647組、AB4/siP647-L組、AB4/siP647-c-L組，每組設(shè)置3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M細(xì)胞給予常規(guī)培養(yǎng)基，給藥組細(xì)胞分別加入siP647、AB4/siP647-L、AB4/siP647-c-L（siP647的濃度均為 20 nmol/L，AB4的濃度均為1.6 μmol/L）。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中分別常規(guī)培養(yǎng)15、30、60 min后，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入適量胰酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞至流式管中。采用流式細(xì)胞儀檢測孵育不同時間后細(xì)胞對熒光標(biāo)記制劑的攝取量。采用Graphpad Prism 8軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用Tukey's檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnett'sT3檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，在孵育15、30、60 min后，3個給藥組細(xì)胞的熒光攝取量較空白對照組均顯著升高（P＜0.05），其中AB4/siP647-c-L組細(xì)胞的熒光攝取量又顯著高于siP647組和AB4/siP647-L組（P＜0.05），且隨著孵育時間的延長AB4/siP647-L組、AB4/siP647-c-L組細(xì)胞的熒光攝取量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 孵育不同時間后各組細(xì)胞對各制劑的攝取量測定結(jié)果（±s，n=3，%%）

表1 孵育不同時間后各組細(xì)胞對各制劑的攝取量測定結(jié)果（±s，n=3，%%）

a：與孵育相同時間的空白對照組比較，P＜0.05；b：與孵育相同時間的siP647組比較，P＜0.05；c：與相同制劑孵育15 min時比較，P＜0.05；d：與相同制劑孵育30 min時比較，P＜0.05；e：與孵育相同時間的AB4/siP647-L組比較，P＜0.05

60 min 0.6±0.1 9.2±2.1a 96.1±1.7abcd 97.8±1.3abcde組別空白對照組siP647組AB4/siP647-L組AB4/siP647-c-L組15 min 0.3±0.1 1.1±1.1a 42.4±2.8ab 50.9±3.1abe 30 min 0.5±0.1 1.2±2.1a 71.8±2.5abc 90.4±1.8abce

2.3.2 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 采用完全隨機(jī)方案，利用共聚焦激光掃描顯微鏡考察熒光標(biāo)記制劑在LLC細(xì)胞內(nèi)的分布。將LLC細(xì)胞按每孔1×106個接種于Lab-Tek?腔室玻片上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為空白對照組、siPFAM組和AB4/siPFAM-c-L組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。空白對照組細(xì)胞給予常規(guī)培養(yǎng)基，給藥組細(xì)胞分別加入siPFAM、AB4/siPFAM-c-L（siPFAM的濃度均為 20 nmol/L，AB4的濃度均為1.6 μmol/L）。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中分別常規(guī)培養(yǎng)1、4 h后，用PBS清洗細(xì)胞3次，DAPI染色10 min，再次用PBS清洗3次后，封片，于顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光分布。統(tǒng)計學(xué)分析方法同“2.3.1”項下。結(jié)果顯示，孵育1、4 h后，藥物主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，siPFAM組、AB4/siPFAM-c-L組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均顯著高于空白對照組（P＜0.05），AB4/siPFAM-c-L組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著高于siPFAM組（P＜0.05），且隨著孵育時間的延長各給藥組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5、表2。

圖5 孵育不同時間后各組細(xì)胞的共聚焦激光掃描顯微圖（×40）

表2 孵育不同時間后各組細(xì)胞胞漿中的熒光強(qiáng)度測定結(jié)果（±s，n=3）

表2 孵育不同時間后各組細(xì)胞胞漿中的熒光強(qiáng)度測定結(jié)果（±s，n=3）

a：與孵育相同時間的空白對照組比較，P＜0.05；b：與相同制劑孵育1 h時比較，P＜0.05；c：與孵育相同時間的siPFAM組比較，P＜0.05

4 h 0 25.2±8.6ab 35.2±4.9abc組別空白對照組siPFAM組AB4/siPFAM-c-L組1 h 0 8.6±3.9a 18.4±4.4ac

3 討論

本研究采用乙醇注入法制備了cRGD修飾的靶向脂質(zhì)體，用于共遞送水溶性藥物AB4和基因藥物siP。在制備過程中筆者發(fā)現(xiàn)，加入DSPE-PEG 2000-cRGD后可降低AB4-c-L和AB4/siP-c-L的電位。其可能原因在于，囊泡表面包裹的PEG可在一定程度上覆蓋DOTAP的正電基團(tuán)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)體的電位下降[14]。對于基因藥物siP，由于體內(nèi)存在大量的核酸酶，一旦游離siP進(jìn)入體內(nèi)，會迅速降解失效。但是經(jīng)過脂質(zhì)體包裹后，脂質(zhì)體上PEG可保護(hù)siP不被核酸酶代謝，避免負(fù)電荷的蛋白或紅細(xì)胞對siP的吸附，從而延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間[15]。通過細(xì)胞攝取實驗結(jié)果可知，LLC細(xì)胞對AB4/siP-c-L的攝取能力比對游離siP更強(qiáng)，AB4/siP-c-L可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量富集。其具體的作用機(jī)制可能與靶向基團(tuán)cRGD的腫瘤細(xì)胞穿膜作用相關(guān)[16]。

根據(jù)本課題組前期開展的藥動學(xué)及組織分布實驗得知，AB4/siP-c-L給藥12 h后小鼠血液中AB4的濃度已非常低，AB4已基本分布到腫瘤部位。因此，為充分考察AB4/siP-c-L中AB4的釋放行為，本研究選擇48 h作為考察時間，未選擇更長的72 h。在體外釋放行為考察實驗中，與AB4溶液相比，AB4/siP-c-L混懸液中AB4的緩釋效果明顯。其原因可能在于AB4包裹于脂質(zhì)體的內(nèi)水相，磷脂雙分子膜發(fā)揮了延緩藥物透過的作用。AB4/siP-c-L在接近內(nèi)涵體酸性pH條件下（pH5.0～5.5）可更快釋藥，而在中性pH條件下（pH7.4）釋藥速率最慢。其原因可能是所使用的脂質(zhì)材料DOTAP的極性基團(tuán)三甲基銨在酸性條件下的極化程度增加，該極化的極性基團(tuán)聚集使得磷脂雙分子膜混亂程度增加，進(jìn)而導(dǎo)致膜通透性增加，最終提高了AB4/siP-c-L中AB4在pH5.0～5.5環(huán)境中的跨膜釋放速率。

綜上所述，本研究制備的AB4/siP-c-L可有效實現(xiàn)AB4與基因藥物siP的共載，并對LLC細(xì)胞具有一定的體外靶向性，可為后續(xù)AB4/siP-c-L的抗腫瘤研究提供基礎(chǔ)。