初雙 ，吳延嬈 ，吳麗敏 ，崔正浩 ，王潘 ，孫意冉 ，謝治深 ，張振強 （.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，鄭州 450046；.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 45005）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是以進行性認知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，腦內(nèi)β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積是AD的主要病理學特征[1—2]。有研究表明，小膠質(zhì)細胞具有吞噬與降解Aβ的功能，可以通過降解Aβ沉積形成的斑塊，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用，從而改善AD[3]。然而，當小膠質(zhì)細胞出現(xiàn)功能障礙時，則可增加Aβ沉積，加重AD[4]。因此，促進小膠質(zhì)細胞攝取和降解異常累積的Aβ是改善AD的有效策略之一[5]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）屬于核激素受體超家族，可與PPAR反應(yīng)元件（PPAR response elements，PPREs）結(jié)合，形成一種有效的轉(zhuǎn)錄因子[6]。PPAR-γ激活后會促進下游基因Abcg1、Sra、Cd36、Lxr、Apoe及Abca1的表達，從而增強小膠質(zhì)細胞對Aβ的攝取及降解[7]。

中醫(yī)將AD歸屬于“癡呆”范疇，認為癡呆病位在腦，多為本虛標實之證，以臟腑精氣虧虛、腦失所養(yǎng)為本，痰氣交阻為標。脾主運化，脾失健運則氣血虧虛，腦髓失養(yǎng)而生癡呆；脾喜燥惡濕，脾氣虧虛則運化水液失常，水濕停聚內(nèi)生痰濕，痰蒙清竅亦生癡呆。脾虛痰濕是早期AD發(fā)生發(fā)展的病機之一，故健脾化痰為治療AD的有效方法之一[8]。中藥白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，被譽為“脾臟補氣健脾”第一要藥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)乙醇提取物（ethanol extract fromAtractylodes macrocephala，EEAM）可延緩AD模型秀麗隱桿線蟲CL4176的癱瘓時間，調(diào)節(jié)溶酶體自噬，降解淀粉樣蛋白前體蛋白，從而改善AD[9—11]。但是白術(shù)乙醇提取物是否可通過PPAR-γ信號通路促進小膠質(zhì)細胞對Aβ的攝取及降解，尚不明確。基于此，本研究以小鼠小膠質(zhì)細胞BV2為研究對象，從PPAR-γ信號通路出發(fā)，探討EEAM促進小膠質(zhì)細胞對Aβ攝取及降解的作用機制，以期為EEAM治療AD的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Airtech型超凈臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），F(xiàn)orma Series Ⅱ Water Jacket型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Axiocam 506 Color型顯微鏡、LSM700型共聚焦熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司），F(xiàn)LUOstar OPTIMA型多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司），Roche LightCycler 96型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白術(shù)飲片購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院付鈺副教授鑒定為菊科植物白術(shù)A.macrocephalaKoidz.的干燥根莖。pCMX-Gal-mPPAR-γ及PPRE-J3-TK-Luc質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。兔源PPAR-γ多克隆抗體（批號00105869）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號GR3401492-2）購自美國Abcam公司；Aβ1-42、FEEAM-Aβ（批號分別為CPC221027110、T2P1000485）均購自蘇州強耀生物科技有限公司；Hoechst 33342、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、TriQuick Reagent總RNA提取試劑（批號分別為20190412、20200716、10013031、229009）均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（批號12A089）購自上海依科賽生物制品有限公司；PolyJet轉(zhuǎn)染試劑（批號61758）購自深圳恩科生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號103118190503）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羅格列酮（批號C10534101，純度98%）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；螢光素酶報告基因檢測試劑盒（批號0000312919）購自美國Promega公司。

1.3 細胞

小鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞BV2購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人胚胎腎細胞HEK293購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 EEAM的制備

參考本課題組前期制備方法[12]操作：稱取白術(shù)飲片2 kg，共加入95%乙醇4 L分別浸漬3次，每次1周；合并濾液，減壓濃縮得到EEAM浸膏359 g，得率為17.95%（以生藥量計），置于4 ℃下保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

將BV2細胞以含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%左右時，進行后續(xù)實驗。將HEK293細胞以含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后同上述條件培養(yǎng)后進行后續(xù)實驗。

2.3 EEAM對BV2細胞活力的影響

采用MTT法對細胞活力進行測定。取對數(shù)生長期的BV2細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為空白對照組和EEAM低、中、高劑量組（0.3、0.4、0.5 mg/mL，劑量參考前期預(yù)實驗設(shè)置），每組設(shè)置6個復(fù)孔。各孔加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，避光加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床振搖10 min，采用酶標儀在490 nm處測定各孔光密度（optical density，OD）值，并計算細胞存活率（細胞存活率＝給藥組OD值/空白對照組OD值×100%）。

2.4 EEAM對BV2細胞攝取及降解Aβ的影響

采用共聚焦皿平行鋪BV2細胞，分為攝取組及降解組，2組細胞再分別設(shè)置空白對照組、陽性對照組（1 μmo/L羅格列酮，劑量參考文獻[13]及預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置，下同）和EEAM低、中、高劑量組（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，次日分別給予相應(yīng)藥物處理24 h，每皿加入500 nmol/L FAM-Aβ（帶有紅色熒光標記的Aβ）避光染色4 h；染色結(jié)束后，攝取組細胞用Hoechst 33342對細胞核進行染色，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后在激光共聚焦熒光顯微鏡下拍照，觀察BV2細胞對Aβ的攝取作用。降解組細胞以500 nmol/L FAM-Aβ避光染色4 h后，更換為MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，用Hoechst 33342和溶酶體綠色熒光探針分別對細胞核及溶酶體進行染色，經(jīng)PBS清洗后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察BV2細胞對Aβ的降解作用。

2.5 EEAM對HEK293細胞中PPAR-γ螢光素酶轉(zhuǎn)錄活性的影響

螢光素酶報告基因是轉(zhuǎn)錄活性測定的常用工具之一，螢光素酶催化底物產(chǎn)生化學發(fā)光，螢光素酶表達量越高，化學發(fā)光度越強，從而表明目的基因轉(zhuǎn)錄活性越強[14]。HEK293細胞是人胚胎腎細胞的細胞系，該細胞具有高度的可轉(zhuǎn)染性，常用作報告基因檢測的工具細胞[15]?；诖耍P者參考相關(guān)文獻[16]，采用HEK293細胞探討EEAM對PPAR-γ轉(zhuǎn)錄活性的影響。取對數(shù)生長的HEK293細胞接種于96孔板中，待細胞密度達到80%左右時，用PolyJet轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染；每孔轉(zhuǎn)染pCMXGal-mPPAR-γ、PPRE-J3-TK-Luc質(zhì)粒各100 ng，并于轉(zhuǎn)染6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)基。次日，將轉(zhuǎn)染后的細胞分為空白對照組、陽性對照組（1 μmol/L羅格列酮）和EEAM低、中、高劑量組（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別給予相應(yīng)藥物培養(yǎng)24 h后，采用多功能酶標儀檢測各孔螢光素酶活性。此外，取對數(shù)生長的HEK293細胞按上述方法接種、轉(zhuǎn)染后，給予高劑量（0.5 mg/mL）EEAM處理后，分別培養(yǎng)6、12、18、24 h時，同上述方法檢測螢光素酶活性。

2.6 EEAM對BV2細胞中PPAR-γ核移位的影響

采用免疫熒光法進行實驗。將BV2細胞接種于提前加入細胞爬片的24孔板中，按照“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)，每組設(shè)3個復(fù)孔。24 h后加入4%多聚甲醛固定細胞1～2 h，經(jīng)PBS清洗后，用0.3% Triton-X室溫孵育30 min，以山羊血清封閉2 h，經(jīng)PBS清洗后，于4 ℃條件下以PPAR-γ一抗（稀釋度為1∶200）孵育過夜，次日加入二抗（稀釋比例為1∶300）室溫避光孵育2 h；加入Hoechst 33342染色30 min，經(jīng)PBS清洗后，取出爬片，采用顯微鏡觀察熒光情況，并用Image J軟件分析各組細胞中PPAR-γ蛋白的熒光強度及核移位情況。細胞中PPAR-γ蛋白熒光強度增強，則表明PPAR-γ表達水平升高；另外，當在細胞核中檢測到PPAR-γ，也表明其被激活[17]。

2.7 EEAM對BV2細胞中PPAR-γ下游靶基因表達的影響

采用qPCR進行實驗。取對數(shù)生長期的BV2細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將細胞分為空白對照組、AD模型組和EEAM低、中、高劑量組（0.3、0.4、0.5 mg/mL），每組設(shè)置3個復(fù)孔。加入相應(yīng)藥物（空白對照組和模型組加入培養(yǎng)基），除空白對照組外，其余組也加入Aβ1-42（終濃度為5 μmol/L）。培養(yǎng)24 h后，用Trizol法提取細胞總RNA，測定其純度及濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進行PCR，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產(chǎn)物長度

2.8 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student'st檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 EEAM對BV2細胞活力的影響結(jié)果

EEAM低、中、高劑量組細胞存活率[分別為（103.76±7.58）%、（111.27±6.05）%、（109.54±7.32）%]與空白對照組[（100.00±10.03）%]比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 EEAM對BV2細胞攝取和降解Aβ的影響結(jié)果

Aβ攝取實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，陽性對照組和EEAM中、高劑量組BV2細胞中Aβ熒光強度均顯著升高（P＜0.05）。Aβ降解實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，陽性對照組和EEAM中、高劑量組BV2細胞中Aβ熒光強度均顯著降低（P＜0.05），陽性對照組及EEAM高劑量組BV2細胞中溶酶體熒光強度顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、圖2、表2。

表2 各組BV2細胞中Aβ攝取和降解熒光強度以及溶酶體熒光強度的檢測結(jié)果（±s，n＝3）

表2 各組BV2細胞中Aβ攝取和降解熒光強度以及溶酶體熒光強度的檢測結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陽性對照組EEAM低劑量組EEAM中劑量組EEAM高劑量組溶酶體熒光強度1.00±0.17 2.10±0.18a 1.08±0.15 1.35±0.18 2.23±0.11a Aβ攝取熒光強度1.00±0.03 1.46±0.27a 1.00±0.02 1.07±0.01a 1.65±0.06a Aβ降解熒光強度1.00±0.06 0.68±0.17a 1.04±0.05 0.96±0.04a 0.72±0.06a

圖1 各組BV2細胞攝取Aβ的熒光顯微圖

圖2 各組BV2細胞降解Aβ的熒光顯微圖

3.3 EEAM對HEK293細胞中PPAR-γ螢光素酶轉(zhuǎn)錄活性的影響

與空白對照組（1.00±0.11）比較，陽性對照組（1.73±0.15）和EEAM各劑量組（分別為1.65±0.21、1.65±0.14、1.77±0.19）HEK293細胞中PPAR-γ螢光素酶轉(zhuǎn)錄活性顯著升高（P＜0.05）。另外，以高劑量EEAM培養(yǎng)6、12、18、24 h后，HEK293細胞中PPAR-γ螢光素酶轉(zhuǎn)錄活性（分別為1.31±0.22、1.44±0.86、1.51±0.16、1.95±0.28）均顯著升高（P＜0.05），且處理24 h后的轉(zhuǎn)錄活性最強。

3.4 EEAM對BV2細胞中PPAR-γ核移位的影響結(jié)果

與空白對照組比較，陽性對照組和EEAM各劑量組BV2細胞中和細胞核中PPAR-γ蛋白的熒光強度（低劑量組除外）均顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3、圖3。

圖3 各組BV2細胞中PPAR-γ核移位的熒光顯微圖

表3 各組BV2細胞中和細胞核中PPAR-γ蛋白熒光強度的測定結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組BV2細胞中和細胞核中PPAR-γ蛋白熒光強度的測定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陽性對照組EEAM低劑量組EEAM中劑量組EEAM高劑量組細胞核中PPAR-γ 1.00±0.05 1.30±0.06a 1.08±0.06 1.21±0.09a 1.41±0.14a細胞中PPAR-γ 1.00±0.04 1.42±0.05a 1.22±0.12a 1.38±0.01a 1.41±0.05a

3.5 EEAM對PPAR-γ下游靶基因mRNA表達的影響結(jié)果

與空白對照組比較，AD模型組BV2細胞中LxramRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），其余基因mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與AD模型組比較，各給藥組BV2細胞中Lxra、Lxrb、Abca1、Abcg1、Cd36、Sra、ApoemRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組BV2細胞中PPAR-γ下游靶基因mRNA的測定結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組BV2細胞中PPAR-γ下游靶基因mRNA的測定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組AD模型組陽性對照組EEAM低劑量組EEAM中劑量組EEAM高劑量組Apoe mRNA 1.00±0.10 0.75±0.03 1.43±0.07b 2.23±0.22b 1.87±0.02b 2.08±0.04b Lxra mRNA 1.00±0.06 0.59±0.04a 1.45±0.10b 1.28±0.14b 1.27±0.07b 1.55±0.23b Lxrb mRNA 1.00±0.13 1.14±0.07 1.77±0.95b 2.71±0.30b 3.52±0.41b 7.44±0.34b Abca1 mRNA 1.00±0.66 1.25±0.76 6.10±0.33b 3.54±0.30b 14.60±0.73b 26.10±0.18b Abcg1 mRNA 1.00±0.22 0.99±0.10 1.28±0.06b 3.91±0.12b 3.79±0.76b 13.20±0.84b Cd36 mRNA 1.00±0.06 0.77±0.01 1.20±0.44b 3.90±0.08b 4.27±0.49b 7.71±0.53b Sra mRNA 1.00±0.09 0.98±0.04 1.70±0.08b 1.79±0.11b 2.09±0.11b 3.01±0.11b

4 討論

隨著全球社會老齡化的加劇，AD發(fā)病率也逐年升高。在AD病理中，Aβ的生成與清除失衡是造成腦內(nèi)斑塊沉積的主要原因之一。白術(shù)為補氣健脾第一要藥，具有神經(jīng)保護等多種藥理作用[18]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其對AD具有改善作用[11]，但具體作用機制不明。Aβ沉積是AD的主要病理學特征[1]。有研究表明，小膠質(zhì)細胞具有攝取與降解Aβ的功能[3]?；诖?，本研究以BV2細胞為研究對象，探討EEAM對Aβ攝取及降解的作用機制。Aβ攝取實驗結(jié)果顯示，經(jīng)EEAM干預(yù)后，BV2細胞中Aβ熒光強度升高。Aβ降解實驗結(jié)果顯示，經(jīng)EEAM干預(yù)后，BV2細胞中Aβ熒光強度降低，且溶酶體熒光強度升高。這提示EEAM可通過促進BV2細胞對Aβ的吞噬和降解作用改善AD，且在促進Aβ降解的同時也增強了溶酶體活性。

PPAR-γ是依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在Aβ穩(wěn)態(tài)、炎癥和能量代謝的各種基因調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[17]。PPAR-γ激動劑可以減輕或逆轉(zhuǎn)AD動物模型中Aβ負荷、炎癥及疾病相關(guān)行為障礙[19]。報告基因是識別及表征功能的有力工具，在研究基因表達及轉(zhuǎn)錄因子等方面具有重要作用[14]，故本研究采用螢光素酶報告基因系統(tǒng)探究EEAM對PPAR-γ通路的作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)EEAM干預(yù)后，HEK293細胞中PPAR-γ螢光素酶轉(zhuǎn)錄活性升高。這提示，EEAM可提高PPAR-γ轉(zhuǎn)錄活性。PPAR-γ作為轉(zhuǎn)錄因子，只有進入細胞核才能發(fā)揮作用，因此核移位也是PPAR-γ激活的標志[17]。進一步研究結(jié)果顯示，經(jīng)EEAM干預(yù)后，BV2細胞核中PPAR-γ的熒光強度也有所升高。這提示EEAM可通過促進PPAR-γ的核移位改善AD。

Abcg1、Cd36、Sra、Lxr、Apoe及Abca1均為PPAR-γ的下游靶基因，Abcg1基因編碼的蛋白質(zhì)是atp結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白家族成員，可通過消除大腦中的有毒肽維持正常的腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)[20]；Cd36是B類清零受體，在腦中小膠質(zhì)細胞進行表達，可介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬作用[21]；Sra是一種多功能受體，具有吞噬作用，研究表明在Sra基因敲除小鼠中，Aβ含量與正常小鼠相比有明顯升高[22]。這說明Cd36、Sra基因?qū)β的攝取作用具有重要意義。Lxr基因?qū)儆诤耸荏w超家族，包括Lxra和Lxrb兩種亞型，其可激活A(yù)poe和Abca1，進而促進小膠質(zhì)細胞對 Aβ 的清除作用[23—25]。這說明Lxra、Lxrb、Apoe、Abca1基因?qū)β的降解作用具有重要意義。本研究結(jié)果表明，經(jīng)EEAM處理后，BV2細胞中Abcg1、Cd36、Sra、Lxr、Apoe、Abca1mRNA的表達水平均升高。這表明EEAM可通過上調(diào)PPAR-γ下游靶基因改善AD。

綜上所述，EEAM可通過激活PPAR-γ信號通路，促進小膠質(zhì)細胞對Aβ的攝取與降解作用，進而改善AD。由于體內(nèi)與體外環(huán)境存在差異，后續(xù)本課題組將進一步開展動物體內(nèi)實驗對上述結(jié)論進行驗證。