李倩 ,陳香茗 ,常鑫鑫 ,崔文華 李陽 ,薛紫鯨 ,鄭玉光 , ,宋軍娜 (.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院/河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心,石家莊 05009;.河北省中藥資源利用與質(zhì)量評價(jià)國際聯(lián)合研究中心,石家莊 05009;.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,石家莊 05006)
膿毒癥是由感染引起的多器官功能障礙和全身炎癥反應(yīng)綜合征[1]。因膿毒癥引起的心肌損傷稱為膿毒癥心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SIC),其病理表現(xiàn)為炎癥免疫反應(yīng)、氧化還原穩(wěn)態(tài)的變化和線粒體功能紊亂等[2]。近年來,雖然通過抗感染手段治療SIC得到了進(jìn)一步發(fā)展,但其病死率仍高達(dá)70%~90%[3]。有研究證實(shí),中醫(yī)藥治療能夠有效逆轉(zhuǎn)膿毒癥引發(fā)的臟器損傷,降低其病死率[4]。從辨證論治和整體觀出發(fā),膿毒癥性心肌損傷屬于中醫(yī)“溫病”及由“溫病”引起的“心悸”“怔忡”“胸痹”等范疇,其病因病機(jī)歸納為溫毒內(nèi)蘊(yùn)、耗氣傷陰,而清熱解毒和益氣養(yǎng)陰為其重要治則[5]。
中藥知母歸屬清熱藥,是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖,具有清熱瀉火、滋陰潤燥之功[6]?!端幮哉摗酚涊d:“知母主治心煩躁悶”;《日華子本草》記載:“知母潤心肺,補(bǔ)虛乏,安心,正驚悸”[7]?,F(xiàn)代藥理研究亦表明,知母具有治療心血管疾病的作用[8]。知母主要含雙苯吡酮類和皂苷類成分,其中雙苯吡酮類成分芒果苷和皂苷類成分知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ均具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)心血管等作用[9—11]。綜合古醫(yī)籍記載及現(xiàn)代藥理研究,筆者推測知母可能對膿毒癥性心肌損傷具有一定改善作用。因此,本研究首先考察知母總雙苯吡酮、知母總皂苷和知母水提物3個(gè)提取部位對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠存活情況的影響,然后再進(jìn)一步考察雙苯吡酮類成分芒果苷和皂苷類成分知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠的藥效作用,為闡明知母改善膿毒癥性心肌損傷的作用及可能的活性物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)參考。
本研究所用主要儀器有D101型大孔吸附樹脂柱(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)(蘇州島津儀器有限公司),SZ61型變焦式體式顯微鏡(日本Olympus公司),VHX-6000型基恩士數(shù)碼成像系統(tǒng)[基恩士(中國)有限公司],4375786型PCR儀、QuantStudio 1型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),LSM800型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)。
知母飲片(批號(hào)200601)購自河北安國振宇藥業(yè)有限公司,經(jīng)河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心鄭玉光教授鑒定為百合科植物知母A.asphodeloidesBge.的干燥根莖。芒果苷對照品(批號(hào)G18J10L93274,純度>95%)購自上海源葉生物科技有限公司;知母皂苷AⅢ對照品(批號(hào)21042003,純度>99%)、知母皂苷BⅡ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)21022614,純度>99%)均購自成都普菲德對照品科技有限公司;脂多糖(批號(hào)0000081275)購自美國Sigma公司;Eastep?Super總RNA提取試劑盒(批號(hào)0000501988)購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)01075502)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix試劑盒(批號(hào)Q711-02)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;其余試劑均為分析純,水為純化水。白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量(20±2) g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2020-0004。購入后,所有動(dòng)物均于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為DWLL202203037)。
2.1.1 知母水提物的制備 稱取知母飲片粗粉500 g,以6倍量水加熱回流提取3次、每次1 h,合并3次提取液,過濾,減壓濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL(以生藥量計(jì))的濃縮液。將其中部分濃縮液冷凍干燥48 h,得知母水提物凍干粉。
2.1.2 知母總雙苯吡酮和知母總皂苷的制備 取“2.1.1”項(xiàng)下剩余濃縮液,采用水提醇沉法除去多糖,過濾,將濾液減壓濃縮至無醇味。依據(jù)本課題組前期優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,將濃縮液于活化的D101大孔樹脂柱上樣,靜置吸附飽和后用4倍柱體積蒸餾水洗脫(流速為2 mL/min),再依次使用4倍柱體積20%、30%、95%乙醇洗脫(流速為1 mL/min),棄蒸餾水和30%乙醇洗脫液,收集20%、95%乙醇洗脫液,分別減壓濃縮并冷凍干燥48 h,得9.15 g知母總雙苯吡酮凍干粉和26.31 g總皂苷凍干粉。經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)測定,知母總雙苯吡酮凍干粉中總雙苯吡酮含量為65.87%,總皂苷凍干粉中總皂苷含量為61.99%。
將50只小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,分別為正常對照組、模型組、知母總雙苯吡酮組、知母總皂苷組和知母水提物組,每組10只。參考文獻(xiàn)[12-13]方法設(shè)置劑量并進(jìn)行實(shí)驗(yàn):正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水,模型組和3個(gè)給藥組小鼠腹腔注射30 mg/kg脂多糖構(gòu)建急性膿毒癥性心肌損傷模型。在脂多糖注射前1 h和注射后24、48 h,各給藥組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物,共給藥3次(劑量均為200 mg/kg,均以提取物計(jì));正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水,灌胃體積均為10 mL/kg。觀察各組小鼠造模后72 h內(nèi)的死亡情況,計(jì)算存活率。結(jié)果見圖1。
圖1 知母不同提取部位對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠存活率的影響(n=10)
結(jié)果顯示,在注射脂多糖/生理鹽水后的72 h內(nèi),正常對照組無小鼠死亡,存活率為100%;模型組小鼠在注射后30 h開始出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率為20%;知母總皂苷組小鼠在注射后40 h開始出現(xiàn)死亡,知母水提物組小鼠在注射后32 h開始出現(xiàn)死亡,兩組在注射后72 h的存活率提高到了40%;知母總雙苯吡酮組小鼠在注射后32 h出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率提高到了70%。由此可知,3種知母提取部位均可提高膿毒癥性心肌損傷模型小鼠的存活率,其中以知母總雙苯吡酮提取部位的效果相對較好。
2.3.1 3種知母單體成分對模型小鼠存活率的影響 將60只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,分別為正常對照組、模型組、芒果苷組、知母皂苷AⅢ組、知母皂苷BⅡ組,每組12只。參考“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)方法及文獻(xiàn)[14]設(shè)置給藥劑量并進(jìn)行實(shí)驗(yàn):正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水;模型組和3個(gè)給藥組小鼠腹腔注射30 mg/kg脂多糖構(gòu)建急性膿毒癥性心肌損傷模型。在脂多糖注射前1 h和注射后24、48 h,各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物,共給藥3次(劑量均為50 mg/kg);正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水,灌胃體積均為10 mL/kg。觀察各組小鼠造模后72 h內(nèi)的死亡情況,計(jì)算存活率。結(jié)果見圖2。
圖2 知母單體成分對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠存活率的影響(n=12)
結(jié)果顯示,在注射脂多糖/生理鹽水后的72 h內(nèi),正常對照組無小鼠死亡,存活率為100%;模型組小鼠在注射后24 h開始出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率為33%;知母皂苷BⅡ組小鼠在注射后42 h開始出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率為33%;芒果苷組小鼠在注射后36 h開始出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率為50%;知母皂苷AⅢ組小鼠在注射后22 h開始出現(xiàn)死亡,注射后72 h的存活率為50%。結(jié)果表明,知母皂苷BⅡ可延緩膿毒癥性心肌損傷模型小鼠的死亡時(shí)間;芒果苷和知母皂苷AⅢ均可提高膿毒癥性心肌損傷模型小鼠的存活率,其中以芒果苷的效果相對較好。
2.3.2 3種知母單體成分對模型小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的影響 采用HE染色法進(jìn)行觀察。將40只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,分別為正常對照組、模型組、芒果苷組、知母皂苷AⅢ組和知母皂苷BⅡ組,每組8只。參考文獻(xiàn)[12]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn):正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水;模型組和3個(gè)給藥組小鼠腹腔注射10 mg/kg脂多糖構(gòu)建膿毒癥性心肌損傷模型。脂多糖注射前1 h和注射后12 h,各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物,共給藥2次(劑量均為50 mg/kg);正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水,灌胃體積均為10 mL/kg。造模24 h后,脫頸處死小鼠,收集其心臟組織,于4%多聚甲醛中固定,經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度5 μm),常規(guī)HE染色后,于顯微鏡下放大500倍拍照,觀察小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果見圖3。
圖3 各組小鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)顯微圖(HE染色,×500)
結(jié)果顯示,正常對照組小鼠心肌組織無明顯的病理形態(tài)改變,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚,肌束排列整齊。模型組小鼠心肌組織病理形態(tài)改變明顯,心肌細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)松散,肌束排列紊亂,裂隙明顯變寬、變多,細(xì)胞核周圍空泡化。各給藥組小鼠心肌細(xì)胞輕微水腫,心肌結(jié)構(gòu)較為清晰,肌束紊亂程度改善;其中芒果苷組小鼠心肌纖維排列緊密,且較為整齊,心肌損傷較其余給藥組相對較輕。結(jié)果表明,芒果苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ均能減輕模型小鼠心肌組織的病理損傷,其中以芒果苷效果相對較好。
2.4.1 分組、給藥及取材 將32只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組,分別為正常對照組、模型組和芒果苷低、高劑量組(20、50 mg/kg),每組8只。參考“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行造模和給藥:正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水;模型組和給藥組小鼠腹腔注射10 mg/kg脂多糖構(gòu)建膿毒癥性心肌損傷模型。脂多糖注射前1 h和注射后12 h,給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物,共給藥2次;正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水,灌胃體積均為10 mL/kg。造模24 h后脫頸處死小鼠,立即取其心臟。取部分小鼠心臟制作組織冰凍切片,剩余組織于-80 ℃保存。
2.4.2 樣本檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。采用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取上述小鼠心肌組織總RNA,采用超微量紫外-可見分光光度計(jì)測定RNA純度和濃度;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照試劑盒說明書方法將cDNA、上下游引物、SYBR Green Master Mix和ddH2O加至八聯(lián)管中,瞬離,上機(jī)(95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火/延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)),采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)因子的mRNA表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。
表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度
2.4.3 檢測及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊者組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),方差不齊者采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果見表2。
表2 芒果苷對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠心肌組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響(±s,n=8)
表2 芒果苷對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠心肌組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響(±s,n=8)
a:與正常對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05
組別正常對照組模型組芒果苷低劑量組芒果苷高劑量組TNF-α mRNA 1.05±0.33 4.09±0.10a 3.59±1.02 3.14±0.53b IL-6 mRNA 1.32±0.90 50.73±18.43a 32.63±11.96 27.92±10.58 IL-1β mRNA 1.22±0.84 11.28±4.60a 6.06±2.01 5.38±1.84b
結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組小鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,芒果苷低、高劑量組小鼠心肌組織中上述指標(biāo)表達(dá)水平均有降低趨勢,且芒果苷高劑量組小鼠心肌組織中IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明,芒果苷可抑制膿毒癥性心肌損傷小鼠心肌組織中炎癥因子的表達(dá)。
取“2.4.1”項(xiàng)下相應(yīng)分組小鼠心肌組織冰凍切片,加200 μL清洗工作液,靜置10 min,滴加100 μL DCFH-DA染色工作液,于37 ℃避光孵育30 min;移除染色液,以PBS洗滌2次,加DAPI染色工作液適量,于37 ℃避光孵育10 min;移除染色液,以PBS洗滌2次后,加蓋玻片,于激光共聚焦顯微鏡下拍照。結(jié)果見圖4。
圖4 芒果苷對膿毒癥性心肌損傷模型小鼠心肌組織中ROS水平影響的顯微圖(×400)
由圖4可知,與正常對照組比較,模型組小鼠心肌組織中ROS水平明顯增加;與模型組比較,芒果苷低、高劑量組小鼠心肌組織中ROS水平明顯減少。結(jié)果表明,芒果苷可有效降低膿毒癥性心肌損傷小鼠心肌組織中ROS水平。
膿毒癥性心肌損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍沒有特效治療方法[15]。因此,尋找安全有效的藥物具有重要的臨床意義。知母總雙苯吡酮類和總皂苷類成分均具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、心血管保護(hù)等作用[16—17],但目前對于知母應(yīng)用于膿毒癥性心肌損傷的研究鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),知母不同活性部位(知母總雙苯吡酮、知母總皂苷、知母水提物)均可明顯提高膿毒癥性心肌損傷模型小鼠的存活率,該結(jié)果初步表明知母不同活性部位對膿毒癥性心肌損傷均具有改善作用,且以知母總雙苯吡酮部位的效果較好。
本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),芒果苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ在知母中含量較高,且2020年版《中國藥典》(一部)以芒果苷和知母皂苷BⅡ作為知母的質(zhì)控成分[6]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),芒果苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ在抗氧化應(yīng)激、抗炎和保護(hù)心腦血管疾病方面的現(xiàn)代藥理研究較多[9—11]。因此本研究緊接著對芒果苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ這3個(gè)單體成分進(jìn)行藥效研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),芒果苷和知母皂苷AⅢ均能提高膿毒癥性心肌損傷模型小鼠存活率,知母皂苷BⅡ能夠延緩小鼠死亡時(shí)間,三者均能夠改善膿毒癥性心肌組織病理形態(tài)學(xué)損傷,其中芒果苷在提高模型小鼠存活率、延緩死亡時(shí)間及減輕心肌病理損傷方面效果更好。同時(shí),芒果苷屬于知母總雙苯吡酮類成分,這也與知母不同提取部位的藥效篩選結(jié)果一致。此外,炎癥是膿毒癥性心肌損傷的潛在誘因,大量炎癥介質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,加重心肌損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn),芒果苷干預(yù)組小鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平和ROS水平均較模型組降低,表明芒果苷可通過下調(diào)小鼠心肌組織中炎癥因子以及ROS水平來改善膿毒癥性心肌損傷。
綜上,知母提取部位能夠改善膿毒癥性心肌損傷,且知母總雙苯吡酮類成分效果較好;雙苯吡酮類成分中的芒果苷可能為知母改善膿毒癥性心肌損傷的核心有效活性成分,其可通過下調(diào)小鼠心肌組織中炎癥因子及ROS水平改善膿毒癥性心肌損傷。本研究進(jìn)一步揭示了知母及其雙苯吡酮類成分芒果苷治療膿毒癥性心肌損傷的可能性,擴(kuò)大了中藥知母及中藥有效活性成分的應(yīng)用范疇。但對于芒果苷改善膿毒癥性心肌損傷的具體作用機(jī)制尚不明確,因此仍需進(jìn)一步研究。并且,本研究目前僅針對研究較多且含量較高的單體成分進(jìn)行了探究,對于知母中其他單體成分改善膿毒癥性心肌損傷的藥效作用也有待進(jìn)一步研究證實(shí)。