彭 輝，姜 鵬, ，李 忍，劉 念，李志江,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319）

魯氏酵母菌（Zygsoaccharomyces rouxii）是嗜高滲透的產香菌株，可將糖類代謝轉化為高級醇、芳香族化合物以及具有焦香氣味呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3（2H） furanone，HDMF）等，這些物質常被作為增香劑，對食品風味具有很大的影響[1-2]。常見代謝合成HDMF菌株有魯氏酵母、畢赤酵母、乳酸菌等[3]。魯氏酵母菌是目前報道中生物合成HDMF最主要的菌株，在添加D-果糖和NaCl的培養(yǎng)基中發(fā)酵5 d，魯氏酵母菌合成HDMF產量可達到6.77 mg/L[4]。畢赤酵母在培養(yǎng)4 d時HDMF產量最高約為2 mg/L，乳酸菌在培養(yǎng)3 d時HDMF產量達到1.17 mg/L[5]。研究表明，魯氏酵母菌在食品加工中具有安全性高、無毒副作用等優(yōu)點。其在醬油、香醋和豆醬中均起到重要的呈味效果[6-7]。魯氏酵母菌也可提高香腸的口感與風味[8]。國內外對于魯氏酵母菌產香的研究多集中在傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵食品中，關于其他食品產業(yè)的應用報道相對較少。利用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術評價了魯氏酵母菌參與的發(fā)酵葡萄酒樣品，檢測了葡萄酒中的高級醇、果香和花香氣味等風味物[9-10]。

本實驗室采用基因工程技術，利用醌氧化還原酶（Quinone oxidoreductase，QOR）構建Z. rouxii QOR過表達工程菌，QOR是酵母菌利用果糖-1,6-二磷酸（Fructose-1,6-bisphosphate, FBP）代謝合成HDMF的重要催化酶[11]。篩選得到的高產HDMF菌株QOR6，QOR基因表達量相比于出發(fā)菌株提高了4.8倍（未發(fā)表結果）。但其代謝合成HDMF發(fā)酵條件及代謝特征未見報道。因此，本文深入研究魯氏酵母菌QOR6發(fā)酵合成HDMF條件，有利于魯氏酵母菌改善食品風味，推動其在食品增香中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯氏酵母菌QOR6 本實驗室構建；YPD液體培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物；YPD固體培養(yǎng)基：20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母提取物，瓊脂；HDMF標品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈和甲酸（色譜級） 百靈威科技有限公司。

MLS-830L立式壓力蒸汽滅菌鍋 普和希健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；Opti-Clean 1300垂直流潔超凈工作臺 立新儀器（上海）有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850R臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司；顯微鏡 上海永科光學儀器有限公司；ZQLY-300V立式雙層振蕩器 上海知楚儀器有限公司；ZXSP-B0270生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；PB-10/C酸度計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；1290 UHPLC型超高效液相色譜儀安捷倫科技有限公司；ITQ 1100型氣相色譜質譜聯用儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng) 參考Liu等[12]方法并稍作改動。取凍存的魯氏酵母菌QOR6，在滅菌后的YPD固體培養(yǎng)基中劃線，于恒溫培養(yǎng)箱中在28 ℃的條件下培養(yǎng)3 d。挑取單菌落移至裝有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于全溫振蕩器中在28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d，當細胞總數達到2.5×108～3.0×108CFU/mL時備用。取5 mL已活化好的菌液接種到100 mL YPD培養(yǎng)基中，在全溫振蕩器中28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)27 h作為種子液用于后續(xù)試驗。

1.2.2 HDMF的測定 根據Li等[13]的研究方法并稍作修改。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8000 r/min離心10 min，移液槍精準吸取2 mL上清液，經0.22 μm濾膜過濾后采用HPLC測定HDMF含量。液相色譜條件：UPLC BEH-Amide（1.7 μm,2.1 mm×100 mm），流動相為0.1%甲酸（A）和乙腈（B），洗脫梯度為：0～10 min，5%B；10～15 min，20%B；15～20 min，100%B。流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長287 nm，使用外標法定量。

1.2.3 魯氏酵母菌QOR6合成HDMF產量的發(fā)酵條件優(yōu)化 將不同濃度的種子液接種到YPD培養(yǎng)基中，采用控制變量法進行單因素實驗，以發(fā)酵溫度28 ℃、pH4.7、轉速180 r/min、接種量20×107CFU/mL、發(fā)酵時間3 d作為基礎培養(yǎng)工藝參數[13]，分別考察溫度（24、28、32和36 ℃）、初始pH（5.7、5.2、4.7、4.2和3.7）、轉速（160、180、200和220 r/min）、接種量（2×107、5×107、20×107和50×107CFU/mL）等因素對QOR6合成HDMF產量的影響。

根據單因素實驗結果，設計4因素3水平的正交試驗，確定QOR6的最佳發(fā)酵參數。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗L9（34）因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.2.4 揮發(fā)性物質測定

1.2.4.1 待測樣品制備 離心后的發(fā)酵液中加入液氮迅速冷凍研磨粉碎，稱取適量粉碎樣品，于頂空瓶中，加入2 g飽和氯化鈉，壓蓋，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再將固相微萃取針扎進頂空中，繼續(xù)放入80 ℃水浴中20 min，上機檢測。

1.2.4.2 GC-MS測定條件 GC條件：TG-5 MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：初始溫度50 °C，保持3 min以后，6 ℃/min的升溫速度升至250 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL。

MS條件：電離方式為EI，電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫為230 ℃，四級桿溫度為200 ℃，無溶劑延遲，全掃描方式，質量掃描范圍40～650 m/z。

揮發(fā)性物質定性定量分析：采集到的質譜圖利用NIST譜庫進行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3 數據處理

實驗每組3個平行樣品，結果用平均值±標準差來表示。利用SPSS 25.0進行數據分析和Prism 8.0制圖。采用單因素方差分析及Duncan檢驗比較各組數據，P＜0.05表示樣品間具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對魯氏酵母菌QOR6合成HDMF產量的影響

隨著發(fā)酵溫度的增加，發(fā)酵液中的HDMF產量呈現出先升高后降低的趨勢（圖1）。當發(fā)酵溫度為36 ℃時，發(fā)酵液中的HDMF含量最低為1.56 mg/L；當發(fā)酵溫度為28 ℃時，HDMF含量達到最高為2.65 mg/L，顯著高于其他樣品（P＜0.05）。因此，當發(fā)酵溫度在28～32 ℃時適宜魯氏酵母菌QOR6生長，這與康遠軍等[14]研究結果相一致。研究表明，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度主要通過影響酵母體內生物酶活性來調控生長和代謝活性[15]，當發(fā)酵溫度過高時，細胞內酶的催化活性受到抑制導致代謝產物降低。因此，魯氏酵母菌QOR6產HDMF的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃，并在此溫度下用于研究后續(xù)實驗。

圖1 不同發(fā)酵溫度條件下QOR6合成HDMF產量Fig.1 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different fermentation temperatures

2.2 初始pH對魯氏酵母菌QOR6合成HDMF產量的影響

初始pH對魯氏酵母菌QOR6產HDMF含量的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵液初始pH的增加，發(fā)酵液中的HDMF含量呈現出先升高后降低的趨勢。在初始pH為4.2時，發(fā)酵液中的HDMF含量最高為2.18 mg/L，顯著高于其他實驗組（P＜0.05）。當初始pH為5.7時，發(fā)酵液中的HDMF含量最低。因此，魯氏酵母菌適合在較低酸性的條件下生長代謝，當初始pH為4.2時有利于魯氏酵母菌QOR6生長和代謝。

圖2 不同初始pH條件下QOR6合成HDMF產量Fig.2 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different initial pH

研究表明，在發(fā)酵過程中，適宜的初始pH有利于提高發(fā)酵過程中微生物中酶的活性，從而促進其生長代謝[16]。魯氏酵母菌可在pH1.5～10.5的范圍內生長，且最適生長范圍在3.5～5.0[3]，這與本文的研究結果相類似。因此，將培養(yǎng)基pH調至4.2作為初始pH用于后續(xù)研究。

2.3 轉速對魯氏酵母菌QOR6合成HDMF產量的影響

培養(yǎng)轉速對魯氏酵母菌QOR6產HDMF產量的影響如圖3所示。隨著轉速的增加，發(fā)酵液中的HDMF含量呈現出先升高后降低的趨勢。在培養(yǎng)轉速為180 r/min時，發(fā)酵液中的HDMF含量最高為2.6 mg/L（P＜0.05）。而當培養(yǎng)轉速為220 r/min時，發(fā)酵液中的HDMF含量最低為1.76 mg/mL。

圖3 不同轉速條件下QOR6合成HDMF產量Fig.3 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different agitation speeds

魯氏酵母屬于兼性厭氧菌，在有氧環(huán)境更適宜生長，適當的搖瓶培養(yǎng)可以為酵母生長提供充足的氧氣，利于前期細胞數目的積累[17]。轉速過高導致發(fā)酵液中HDMF含量降低的原因可能是由于供氧充足時，導致細胞數目增加，耗氧量高，酵母快速生長而代謝產物減少[18]。因此，后續(xù)實驗培養(yǎng)轉速為180 r/min。

2.4 接種量對魯氏酵母菌QOR6產HDMF產量的影響

接種量對魯氏酵母菌QOR6產HDMF含量的影響如圖4所示。隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的HDMF含量呈現出先升高后降低的趨勢。在接種量為20×107CFU/mL時，發(fā)酵液中的HDMF含量最高為1.54 mg/L，顯著高于其他實驗組（P＜0.05）；當接種量為2×107CFU/mL時，發(fā)酵液中的HDMF含量最低。因此，當接種量為20×107CFU/mL時，有利于魯氏酵母菌QOR6代謝。研究表明，酵母接種量對細胞的生長代謝具有顯著的調節(jié)作用[19]。隨著發(fā)酵接種量的增加，發(fā)酵液中的HDMF含量呈現出先升高后降低，可能是由于接種量過低，酵母細胞數量少，代謝出的目標產物少。而接種量較高，細胞間競爭加劇，營養(yǎng)物質或氧氣不足導致酵母細胞生長緩慢[18]。

圖4 不同接種量條件下QOR6合成HDMF產量Fig.4 HDMF production from Z. rouxii QOR6 under different inoculation amounts

2.5 正交試驗結果

正交試驗結果表明（表2），影響QOR6合成HDMF的因素順序為：溫度（A）＞轉速（C）＞初始pH（B）＞接種量（D）。方差分析結果表明（表3），溫度、轉速和初始pH對QOR6發(fā)酵生產HDMF具有顯著影響（P＜0.05），而接種量對HDMF產量無顯著影響（P＞0.05）。正交試驗優(yōu)化得到的條件為：發(fā)酵溫度28 ℃、初始pH4.2、轉速180 r/min、接種量20×107CFU/mL。此條件下，測得HDMF產量高達2.90 mg/L。由于外源D-果糖和NaCl對魯氏酵母產HDMF具有促進作用，因此與前人研究結果6.77 mg/L存在差異[4]。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal test

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance

2.6 揮發(fā)性物質分析

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，利用GC-MS技術測定魯氏酵母菌QOR6代謝合成的揮發(fā)性物質，結果如表4所示。

2.6.1 醇類揮發(fā)物質分析 醇類物質主要是魯氏酵母菌通過糖酵解途徑產生，表現為甜香和花果香[20-21]。樣品中共檢測出7種醇類（表4），占總揮發(fā)物的81.13%。主要有異丁醇（酒精氣味）、異戊醇（花香，水果香）、叔戊醇（焦灼味）和苯乙醇（清甜的玫瑰樣花香）等[22]。其中含量最多的是苯乙醇，占總揮發(fā)物的56.58%，是由苯丙氨酸代謝出的一種具有玫瑰香味的芳香醇，因其嗅聞強度較高，是果酒中常見的香氣活性物質[23]。趙培城等[24]在研究紹興黃酒的香氣物質時發(fā)現，醇香的主要貢獻來源是苯乙醇和異戊醇。因此，魯氏酵母菌QOR6也能夠增加食品的甜果香，可應用于食品發(fā)酵。

2.6.2 酯類揮發(fā)物質分析 酯類物質通常由發(fā)酵期間微生物代謝作用及醇類和有機酸的酯化反應生成[25]。樣品共檢測出10種酯類（表4），占總揮發(fā)物的6.49%。主要有苯乙酸乙酯（花香，蜂蜜香）、乙酸苯乙酯（花香和水果香）、2-甲基丁酸，2-苯乙酯（月季花香、甜果香和蠟燭氣味）等[26]。其中乙酸苯乙酯的占比最大為3.48%，是風味物質中花果香氣的主要來源。酯類物質對白酒風格形成具有重大意義，不同香型的白酒中，酯類的種類及含量不同[27]。酯類物質也是醬類發(fā)酵食品中主要香氣貢獻成分，醬油中的酯類化合物是已報道物質中品種最多的[28]。因此，在發(fā)酵過程中添加魯氏酵母菌QOR6，可以增加食品的花果香氣。

表4 揮發(fā)性化合物GC-MS測定結果Table 4 Results of volatile compounds by GC-MS detection

2.6.3 醛類揮發(fā)物質分析 醛類化合物主要來源于糖類與氨基酸作用，閾值較低，具有脂肪香氣[29]。樣品中共檢測到8種醛類（表4），占總揮發(fā)物的1.32%。主要有巴豆醛（臭味）、異戊醛（青草香、巧克力香味）、苯甲醛（苦杏仁、櫻桃及堅果香）、苯乙醛（風信子花香和甜果香）、壬醛（玫瑰、柑橘和油脂氣味）、3,4-二甲基苯甲醛（杏仁味）和4-戊烯醛[30]等，其中苯甲醛的占比最大為0.34%。發(fā)酵過程中醛類的生成量雖少，但對香氣成分的貢獻很大。醛類物質在肉制品加工中對風味的影響突出，含有小分子量的醛時，可使產品整體的風味更醇厚。李永杰等[31]在風干腸中檢測到壬醛，由不飽和脂肪酸的自動氧化而成，有較強的油脂味，對發(fā)酵肉制品的香味有重要貢獻。劉丹丹等[32]在對醬牛肉風味物質測定時，發(fā)現醛類是最主要的風味來源，其中苯甲醛含量最高。因此，魯氏酵母菌QOR6的添加，能增強食品的油脂香，可在肉制品中進行應用。

2.6.4 芳香族化合物及烴類揮發(fā)性物質分析 發(fā)酵液中共檢測到5種芳香族化合物（表4），占總揮發(fā)物的1.19%，其中3-乙基-2,5-甲基吡嗪含量最高為0.70%。芳香族化合物的產生主要由醛和烯醇進一步環(huán)化生成的吡嗪和吡啶。發(fā)酵液中共檢測到4種烴類化合物（表4），占總揮發(fā)物的0.50%，其中氯甲氧基甲烷含量最高為0.20%。烴主要來源于脂肪酸醇氧自由基的均質化和脂肪降解，一般會有所謂的烷烴氣味，其中閾值較低的不飽和烴對香氣貢獻較大[33-34]。烯烴和烷烴類大多屬于小分子物質，在發(fā)酵前期，可作為營養(yǎng)物質，經酵母發(fā)酵進一步合成酯類物質[35]。

2.6.5 其他揮發(fā)性物質分析 發(fā)酵液中產生的其他揮發(fā)性物質，主要有酰胺類、酚類、酸類和醚類，占總揮發(fā)物的9.42%。酰胺類物質對風味沒有顯著貢獻，具有一定刺激性氣味。酸類物質是醇和醛氧化產生，多作為非揮發(fā)性香氣物質存在于發(fā)酵液。醚類可能是在高溫下，由醇脫水化合而成。樣品中只檢測到1種酚類為2,6-二叔丁基苯酚，其相對含量為8.77%，也有學者在糯米酒、熟制香菇和軟兒梨果酒等食品揮發(fā)性成分中檢測到該物質[36-37]。上述各種物質間的相互作用，使得魯氏酵母菌QOR6代謝出的揮發(fā)性香氣成分更為豐富。

3 結論

本研究對魯氏酵母菌QOR6代謝合成HDMF培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，并對其代謝出的揮發(fā)成分進行分析，為酵母因釀造方式帶來的環(huán)境改變提供適宜的發(fā)酵參數。最終確定該菌株產HDMF最優(yōu)培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度28 ℃、初始pH4.2、轉速為180 r/min、接種量為20×107CFU/mL。在此條件下，合成的HDMF產量為2.90 mg/L。此外，代謝得到的醇、酯、醛類化合物種類豐富，檢測到有苯乙醇、異戊醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛等關鍵香氣成分，他們的呈味效果將更突出，使發(fā)酵液整體呈現出甜果香及堅果的香氣。由此可見，魯氏酵母菌不僅可以提高HDMF的含量，還能顯著改善發(fā)酵液風味。后續(xù)可在此研究基礎上，對風味物質形成的特定代謝途徑以及相關的調控基因進行挖掘。研究結果可為魯氏酵母菌基因改造菌株進一步研究，以及利用其呈味特征在食品工業(yè)中的應用提供技術參考。