馮傳濤，唐軍偉

(1.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院麻醉手術科，陜西 寶雞 721000；2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院疼痛科，陜西 寶雞 721000)

糖尿病病理性神經(jīng)性疼痛(Diabetic pathologic neuropathic pain,DNP)是糖尿病多發(fā)的慢性并發(fā)癥[1]，近年隨著糖尿病發(fā)病率的升高DNP發(fā)病率亦逐年升高。DNP患者臨床多表現(xiàn)為痛覺過度、誘發(fā)性疼痛和自發(fā)性疼痛，對DNP患者的日常生活質(zhì)量造成了嚴重的負面影響[2]。DNP的發(fā)病機制復雜且尚未完全闡明，持續(xù)高糖微環(huán)境致使微血管損傷，微血管損傷可繼發(fā)導致營養(yǎng)缺失和能量缺失，進而致使神經(jīng)細胞凋亡水平升高并誘發(fā)外周神經(jīng)損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，外周神經(jīng)損傷發(fā)生后可繼發(fā)激活炎性細胞釋放更多促炎因子并導致神經(jīng)元異位放電增多和疼痛閾值降低。故炎癥反應假說認為外周炎癥水平的升高與DNP病情密切相關[5]。此外近期有證據(jù)表明，神經(jīng)性疼痛患者存在明顯的細胞免疫功能缺陷，其機制可能與免疫反應過度激活可促使痛覺過敏產(chǎn)生有關[6]。右美托咪定是高選擇性的α2-腎上腺素受體激動劑，在臨床術后鎮(zhèn)痛、麻醉中得到了廣泛的應用[7]。多項證據(jù)顯示[8-9]，右美托咪定可通過調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎性因子的分泌進而發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛效果。然而，現(xiàn)階段右美托咪定是否可通過調(diào)節(jié)免疫功能和抑制炎癥反應水平，進而改善DNP患者疼痛閾值進而促進病情轉(zhuǎn)歸仍未見系統(tǒng)證據(jù)?；诖吮尘?，本研究擬通過構(gòu)建DNP大鼠模型，并采用右美托咪定進行干預，旨在為后續(xù)DNP的干預治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SPF級成年雄性SD大鼠32只，體重(220±20)g，8～10周齡。采用隨機數(shù)字表法將所有大鼠分為四組。空白對照組(8只，不做處理，NC組)，右美托咪定組(8只，采用右美托咪定干預，NC+DD組)、糖尿病神經(jīng)痛組(8只，僅構(gòu)建模型，DNP組)和糖尿病神經(jīng)痛+右美托咪定組(8只，構(gòu)建模型聯(lián)合右美托咪定干預，DNP+DD組)。

1.2 糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型建立[10]采用腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg的方式構(gòu)建糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型，造模后1、7、14 d觀察模型組大鼠是否存在自發(fā)性疼痛行為，主要包括自殘、抗重力行為、舔腳、抬腳等行為且血糖≥16.7 mmol/L，若存在則可視為造模成功。模型組在鏈脲佐菌素注射完成14 d后進行右美托咪定注射干預，方法為背部消毒后采用30 G針頭在第4和5腰椎間做穿刺，并在觀察大鼠有抬足反應后進行右美托咪定注射1.5 μg/kg，糖尿病神經(jīng)痛組注射等量生理鹽水。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠行為學測定：①熱輻射刺激：造模成功后14 d對大鼠進行熱輻射熱刺激試驗，每次30 s，每日重復3次，每兩次間間隔5 min，并記錄大鼠后肢抬腳的潛伏期。②冷板試驗：在熱輻射刺激相同時間進行，冷板溫度為4 ℃，每次30 s，每日重復3次，每兩次間間隔5 min，并記錄5 min內(nèi)總縮腿次數(shù)和大鼠足趾縮腿反應潛伏期。③觸覺過敏試驗：在熱輻射刺激相同時間進行，選取清潔的鐵網(wǎng)并在鐵網(wǎng)下放置Semmes-Weinstein Monofilaments A835儀器，采用不同壓力對大鼠足底進行刺激，每次30 s，每日重復3次，每兩次間間隔5 min，記錄最小能誘發(fā)其縮腿的閾值。

1.3.2 機械痛閾的測定：分別于右美托咪定注射后1、7、14 d采用Von Frey電子測痛儀，對大鼠疼痛閾值進行測定。方法為：由Von Fery燈絲施加壓力，以0.13 g作為壓力起點，使壓力呈線性增強直至大鼠力達到 20.1 g(終止值)或大鼠發(fā)生撤退反應。經(jīng)1 mm的錐形塑料尖端將壓力傳遞至后爪背面，并采用相同方法進行壓力的施加，以采集大鼠錐形塑料尖端。所有測試均重復3次，結(jié)果取平均值。當大鼠機械痛閾<4 g為出現(xiàn)痛覺超敏反應。

1.3.3 免疫功能檢測：取20 μl血樣加入紅細胞裂解液震蕩后靜置15 min，靜置完成后進行離心操作，離心7 min后，吸棄上清并加入1 ml PBS并再次重復上述離心操作，離心持續(xù)7 min。隨后對大鼠CD4抗體、CD3抗體和CD8a抗體進行標記，分別采用PE、PerCP、FITC進行標記，均為0.2 μl。隨后在震蕩混勻，并在避光條件下進行染色(染色環(huán)境為：4 ℃，時間持續(xù)30～40 min)，隨后采用流式細胞儀檢測全血T淋巴細胞CD4+、CD3+和CD8+的表達水平，并計算CD4+/CD8+比值。

1.3.4 炎癥反應指標檢測：采用脊柱脫臼法處死大鼠后，采集2 ml血樣，并采用ELISA法檢查所有大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)。所有檢查均嚴格按照ELISA試劑盒操作進行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學測定 與NC組比較，NC+DD組爪子對冷刺激的消退潛伏期、爪子對熱刺激的消退潛伏期、爪子機械刺激退縮反應更低(均P<0.05)，DNP組和DNP+DD組冷刺激的消退潛伏期、爪子對熱刺激的消退潛伏期、爪子機械刺激退縮反應高于NC組和NC+DD組(均P<0.05)，且DNP組高于DNP+DD組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學測定(s)

2.2 各組大鼠機械撤退閾值 1、7和14 d與NC組比較，NC+DD組機械撤退閾值明顯更高(均P<0.05)，DNP組和DNP+DD組機械撤退閾值明顯低于NC組和NC+DD組(均P<0.05)，且DNP組顯著低于DNP+DD組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠機械撤退閾值比較(g)

2.3 各組大鼠免疫功能比較 與NC組比較，NC+DD組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+明顯更高(P<0.05)，DNP組和DNP+DD組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+明顯低于NC組和NC+DD組(均P<0.05)，且DNP組顯著低于DNP+DD組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠免疫功能比較

2.4 各組大鼠炎癥反應指標比較 與NC組比較，NC+DD組TNF-α、IL-1β、IL-18明顯更低(均P<0.05)，DNP組和DNP+DD組TNF-α、IL-1β、IL-18明顯高于NC組和NC+DD組(均P<0.05)，且DNP組顯著高于DNP+DD組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠炎癥反應指標比較

3 討 論

DNP起病機制復雜，紊亂的神經(jīng)細胞微環(huán)境被認為是DNP病情進行性發(fā)展的中心靶點[11]。高糖微環(huán)境致使?jié)B透壓、氧化還原狀態(tài)和代謝系統(tǒng)功能紊亂是神經(jīng)細胞凋亡水平升高的關鍵，亦是繼發(fā)導致神經(jīng)元出現(xiàn)不可逆損傷的重要誘因[12]。本次研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法構(gòu)建了DNP大鼠模型，注射后大鼠出現(xiàn)明顯的自殘、抗重力行為、舔腳、抬腳等行為且血糖明顯升高，表明DNP大鼠模型構(gòu)建成功。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中脊髓小膠質(zhì)細胞重要的免疫效應細胞生理穩(wěn)態(tài)被打破后，小膠質(zhì)細胞的形態(tài)、數(shù)量和功能受到影響并出現(xiàn)一系列變化，進而在神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)損傷中扮演重要的橋梁作用[13]。近年來多項動物實驗證實[14]，脊髓中小膠質(zhì)細胞的激活與外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關，而損傷的外周神經(jīng)系統(tǒng)被證實是DNP的重要病理誘因。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細胞，其介導免疫功能和炎癥反應機制被證實在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用[15]。Tsuda等[16]認為，不同于生理性疼痛的是，病理性疼痛不依賴于組織損傷的刺激，而脊髓小膠質(zhì)細胞的活化在神經(jīng)性疼痛病情的進展尤為重要。有觀點認為，小膠質(zhì)細胞異常激活后神經(jīng)系統(tǒng)的免疫功能受損，且促炎因子表達升高進而導致神經(jīng)性疼痛疾病的病情進展[17]。T淋巴細胞亞群是機體細胞免疫的重要組成。DNP發(fā)生后腦部微血管存在明顯的損傷，而血管通透性的增加和血管擴張可導致白細胞外溢并促使更多的巨噬細胞向病變處募集，而逐漸積累的巨噬細胞可招募T淋巴細胞向病變處，最終過度聚集的T淋巴細胞可導致免疫功能紊亂。CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+是評估機體T淋巴細胞亞群功能的重要因子。TNF-α、IL-1β、IL-18是機體重要的促炎因子。IL-1β、IL-18受NLRP3炎癥小體表達的調(diào)控，并在機體免疫-炎癥機制的激活中發(fā)揮著重要的橋梁作用。研究表明[18]，巨噬細胞被激活后可促進下游TNF-α、IL-1β、IL-18因子的表達并激活神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。本次研究結(jié)果顯示，右美托咪定可有效抑制DNP大鼠炎癥反應和調(diào)節(jié)T細胞免疫功能，提示右美托咪定可通過介導炎癥和免疫機制改善DNP癥狀。小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥激活是促進老年癡呆、認知功能障礙等慢性神經(jīng)疾病發(fā)生、發(fā)展的關鍵，NLRP3/Caspase-1炎癥小體信號通路是神經(jīng)系統(tǒng)免疫-炎癥激活的關鍵信號軸，Caspase-1的表達上調(diào)可IL-1β、IL-18的表達，進而促進炎癥反應水平的升高，右美托咪定可靶向調(diào)節(jié)免疫功能水平，并抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，其機制與調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1炎癥小體信號通路的表達有關。Meng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞誘導的炎癥反應激活是導致神經(jīng)元細胞死亡的重要誘因，采用右美托咪定可靶向上調(diào)sirt1的表達進而抑制炎癥反應水平升高發(fā)揮神經(jīng)元細胞保護作用。Bao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB被認為是神經(jīng)系統(tǒng)炎癥激活的關鍵，右美托咪定的應用可有效逆轉(zhuǎn)NF-κB參與激活的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥并發(fā)揮腦保護作用。本研究結(jié)果顯示，DNP大鼠采用右美托咪定干預后疼痛閾值明顯升高且疼痛相關行為亦明顯好轉(zhuǎn)，證實右美托咪定可改善DNP大鼠病情?？紤]糖尿病起病后持續(xù)的高血糖微環(huán)境造成微血管損傷，隨著微血管損傷的進行性發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞被激活并招募T淋巴細胞向病變處募集，同時可直接促進下游促炎因子的表達，最終表現(xiàn)為導致神經(jīng)細胞凋亡水平升高，而右美托咪定靶向抑制炎癥因子的表達和調(diào)節(jié)細胞免疫功能有效改善了下游神經(jīng)細胞凋亡水平，進而促進DNP患者病情轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，炎癥反應激活和免疫功能紊亂與DNP大鼠病情密切相關，采用右美托咪定干預可有效抑制炎癥因子的表達，并調(diào)節(jié)免疫功能，進而促進DNP大鼠疼痛水平轉(zhuǎn)歸。臨床可進一步設計相關隨機試驗以闡明DNP患者采用右美托咪定進行干預，對逆轉(zhuǎn)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和調(diào)節(jié)T細胞免疫功能的價值，進而為DNP患者病情的控制和促進病情轉(zhuǎn)歸提供新思路。