梁 紅，霍紅艷

(西安高新醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710075)

膿毒癥是一種由感染引起的嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)，與高發(fā)病率和病死率有關(guān)。膿毒癥臨床表現(xiàn)包括血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、凝血問題和多器官功能障礙等[1-2]。在膿毒癥的進(jìn)展中，具有內(nèi)皮屏障功能障礙特征的血管滲漏是一個(gè)關(guān)鍵的病理生理步驟，可導(dǎo)致組織水腫和器官功能障礙，急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，ALI使許多臨床癥狀復(fù)雜化，表現(xiàn)為肺功能減退、肺水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡毛細(xì)血管膜通透性增加[3]。炎癥因子的過度釋放、粘附分子上調(diào)、中性粒細(xì)胞聚集、血管完整性喪失、肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是膿毒癥相關(guān)肺損傷的主要病理變化[4-5]。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，廣泛用于重癥監(jiān)護(hù)室危重患者的圍手術(shù)期鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮[6]。越來越多的證據(jù)表明DEX具有抗炎、抗凋亡和抗氧化特性，可減輕動(dòng)物模型中缺血/再灌注、脂多糖和通氣后的肺損傷[7]。最近發(fā)現(xiàn)DEX具有調(diào)節(jié)線粒體融合/裂變以減輕膿毒癥相關(guān)肺損傷的作用，已被證明可通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活來防止膽紅素誘導(dǎo)的肺損傷[7]。臨床報(bào)告的嚴(yán)重膿毒癥患者的研究表明，DEX通過其抗炎作用提高了存活率[8]。本研究中探討了DEX對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)作用及其與磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)/酪氨酸磷酸化(p-STAT3)通路的潛在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 30只健康成年雄性無病原體Wistar大鼠(體重250～300 g)購(gòu)自陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，許可證號(hào)SYXK(陜)2018-002。所有動(dòng)物都飼養(yǎng)在21～ 23 ℃,30%～40% 濕度和12 h明暗循環(huán)中，飼養(yǎng)期間大鼠可隨意獲取食物和水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天有限公司，批號(hào)PT512；TRIzol 試劑、RevertAid 逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自賽默飛世科技科技，批號(hào)EP0442、15596026；p-JAK2(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、和 β-肌動(dòng)蛋白(1∶8000)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司，批號(hào)分別為ab57602、ab2185和KM9001。

1.3 膿毒癥大鼠模型 對(duì)所有大鼠肌肉注射50 mg/kg鹽酸氯胺酮、5 mg/kg甲苯噻嗪和靜脈注射2 g/(kg·h)芬太尼，對(duì)所有大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)和維持麻醉，麻醉深度由腳趾捏反應(yīng)法確定。通過尾靜脈導(dǎo)管提供水合和藥物輸注，以0.5 ml/h的速率注入等滲氯化鈉溶液維持水合。建立盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型，在實(shí)驗(yàn)過程中，讓大鼠自主呼吸，同時(shí)監(jiān)測(cè)外周血氧飽和度。膿毒癥是通過盲腸結(jié)扎和穿刺引起的，通過3 cm中線切口進(jìn)行剖腹探查、結(jié)扎和穿孔盲腸。盲腸用3-0絲結(jié)扎，用18 G針打孔2次，輕輕擠壓，擠出少量糞便。將盲腸重新置于腹腔內(nèi)，并關(guān)閉剖腹切口。在盲腸結(jié)扎和穿刺程序之后，將大鼠放回各自的籠子，自由獲取食物和水。假手術(shù)組(對(duì)照組)大鼠僅接受剖腹和關(guān)腹操作。

1.4 分組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、模型組和 DEX組。每組10只。模型組和DXE組大鼠均行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，對(duì)照組僅行剖腹和關(guān)腹操作。DEX組大鼠給予5 g/(kg·h) DEX靜脈滴注1 h，模型組和對(duì)照組的大鼠接受等體積的鹽水。6 h后大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪組合麻醉每組4只，并抽取血樣用于測(cè)量炎癥因子水平分析。CLP術(shù)后24 h，其余各組大鼠靜脈注射戊巴比妥200 mg/kg安樂死，采集肺標(biāo)本進(jìn)行組織分析、組織學(xué)檢查。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 檢測(cè)炎癥細(xì)胞因水平:收集外周血和肺組織樣本用于分析炎性細(xì)胞因子。使用ELISA試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1) 的水平。

1.5.2 分析肺組織學(xué):將肺標(biāo)本固定在2%戊二醛和2%多聚甲醛在0.1 mol/L甲胂酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的混合物中，用分級(jí)酒精系列脫水，并在52 ℃下嵌入石蠟中。制備切片并用蘇木精和伊紅 (HE) 染色以進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。由病理醫(yī)師對(duì)每個(gè)肺切片的肺損傷進(jìn)行評(píng)分，觀察并記錄肺泡毛細(xì)血管充血、出血、中性粒細(xì)胞在血管壁中的浸潤(rùn)或聚集，以及肺泡壁的厚度。每個(gè)項(xiàng)目根據(jù)以下等級(jí)進(jìn)行評(píng)分：0：最小損壞；1：輕度損壞；2：中度損壞；3：嚴(yán)重?fù)p壞；4：最大傷害。

1.5.3 肺組織原位凋亡:通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的熒光dUTP標(biāo)記(TUNEL)方法測(cè)定肺組織中的原位DNA片段化。根據(jù)制造商的說明，使用Apop Tag過氧化物酶原位凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行TUNEL。過氧化物酶底物3.3-二氨基聯(lián)苯胺用于觀察凋亡細(xì)胞。甲基綠(0.5%)用于核染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察 TUNEL 陽性細(xì)胞。對(duì)肺中淋巴濾泡形成區(qū)域之外的5個(gè)不同的大生長(zhǎng)區(qū)域中的TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，計(jì)算平均值。

1.5.4 檢測(cè)氧化應(yīng)激:氧化應(yīng)激指數(shù) (OSI) 計(jì)算為總氧化劑狀態(tài) (TOS) 和總抗氧化劑水平 (TAS) 水平之間的比率。血清TOS和TAS濃度按照商業(yè)試劑盒制造商的說明，使用微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。TOS測(cè)定用過氧化氫 (H2O2)進(jìn)行校準(zhǔn)，結(jié)果以μmol H2O2當(dāng)量/L表示；TAS使用標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物(Trolox)進(jìn)行校準(zhǔn)，結(jié)果以μmol Trolox 當(dāng)量/L表示。

1.5.5 檢測(cè)肺組織凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá):使用TRIzol試劑提取肺組織或NR8383細(xì)胞中的總RNA。在以下條件下，使用RevertAid 逆轉(zhuǎn)錄酶將1 μg總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min和70 ℃10 min。RT-PCR 分析使用Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和軟件，使用BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和β-的特異性mRNA引物進(jìn)行。PCR混合物的預(yù)變性在95 ℃下進(jìn)行5 min，進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)，包括在95 ℃下變性10 s，在60 ℃下退火和延伸30 s。每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的拷貝數(shù)計(jì)算為歸一化法管家基因β-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)拷貝數(shù)。2-ΔΔCt方法用于確定靶基因的相對(duì)mRNA表達(dá)。

1.5.6 檢測(cè)p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá):冷凍的肺標(biāo)本通過冰上的裂解緩沖液勻漿，將細(xì)胞裂解物在4 ℃下以9000 g離心10 min，收集上清液。通過二辛可寧酸測(cè)定法定量蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)提取物(40 μg)加熱、變性并加載到10% SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在37 ℃下用Tris緩沖鹽水(TBST)中的5%脫脂牛奶封閉膜1 h，用p-JAK2(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、和β-肌動(dòng)蛋白(1∶8000)在4 ℃過夜。用TBST洗滌四次后，將印跡與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。上樣對(duì)照是組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)β-肌動(dòng)蛋白，印跡通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)可視化，并使用Image J進(jìn)行分析。

1.5.7 檢測(cè)膿毒癥大鼠血管通透性:通過大鼠頸靜脈注射9 mg/kg異硫氰酸熒光素牛血清白蛋白(FITC-BSA)，給藥后1 h，打開腹腔，切開腹主動(dòng)脈，經(jīng)頸靜脈緩慢注入生理鹽水直至肺組織變白。用OCT膠包埋右肺組織，并進(jìn)行冰凍切片(切片厚度10～15 μm)。用4%多聚甲醛固定組織15 min，用0.1% Triton-X滲透5 min，并在37 ℃下與4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1∶50)一起培養(yǎng)30 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察肺組織中的FITC-BSA滲出。沿腹部中部切開2 cm的切口，供其他大鼠選擇腸系膜固定有豐富的微血管。FITC-BSA被注入股靜脈6 min后，通過倒置顯微鏡觀察FITC-BSA滲漏到腸系膜微血管中。

2 結(jié) 果

2.1 DEX減輕膿毒癥大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng) 模型組TNF-α、IL-6和MCP-1水平較對(duì)照組升高(均P<0.05)，而IL-10水平較對(duì)照組降低(均P<0.05)，DEX組TNF-α、IL-6和MCP-1水平較模型組降低(均P<0.05)，IL-10水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠肺組織炎癥因子水平比較(pg/ml)

2.2 DEX對(duì)肺組織病理學(xué)和細(xì)胞凋亡的影響 模型組HE染色和TUNEL染色評(píng)分較對(duì)照組升高(均P<0.05)，DEX組HE染色和TUNEL染色評(píng)分較模型組降低(均P<0.05)，見表2。CLP和假手術(shù)后24 h獲得的肺切片的代表性病理表現(xiàn)：對(duì)照組結(jié)構(gòu)正常，肺泡清晰。與對(duì)照組比較，模型組肺標(biāo)本的初步觀察表明存在明顯的病理病變，包括嚴(yán)重的白細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚、肺水腫和出血，經(jīng)DEX預(yù)處理后，大鼠病變情況明顯減輕。見圖1。

表2 HE和TUNEL染色分析大鼠肺損傷(分)

圖1 肺切片的代表性病理表現(xiàn)(HE染色，×40)

2.3 三組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組血清TAS水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，DEX組血清TAS水平較模型組升高(P<0.05)，模型組血清TOS水平和OSI指數(shù)較對(duì)照組升高(均P<0.05)，DEX組血清TOS水平和OSI指數(shù)較模型組降低(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.4 肺組織凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá) 模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)，Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)升高(均P<0.05)，DEX組Bcl-2 mRNA表達(dá)較模型組升高(P<0.05)，Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)比較

2.5 DEX抑制CLP誘導(dǎo)的p-JAK2/p-STAT3通路的激活 模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高(均P<0.05)，DEX組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)較模型組降低(均P<0.05)。見表5。

表5 三組大鼠檢測(cè)p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá)比較

2.6 DEX抑制膿毒癥大鼠的血管通透性檢測(cè) 模型組肺血管通透性和腸系膜血管通透性較對(duì)照組升高(均P<0.05)，DEX組血管通透性較模型組降低(P<0.05)。與對(duì)照組比較，膿毒癥大鼠的肺血管(A)和腸系膜(B)通透性顯著增加(均P<0.05)，與模型組相比，Dex可使肺血管和腸系膜的FITC-BSA的滲漏顯著緩解(均P<0.05)。見表6。

表6 三組大鼠血管通透性比較(μg/g)

3 討 論

肺損傷是膿毒癥的嚴(yán)重并發(fā)癥，與高病死率相關(guān)。肺泡毛細(xì)血管屏障損傷、氧化應(yīng)激、炎癥級(jí)聯(lián)刺激、細(xì)胞因子反應(yīng)增加、及肺泡上皮和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是病理性的與肺損傷相關(guān)的過程。膿毒癥患者通常需要鎮(zhèn)靜以維持有效的機(jī)械通氣，以確?；颊邔?duì)這種治療的依從性，并減少焦慮[9-10]。DEX是一種有效的、高選擇性的α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，由于其鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用而無呼吸抑制，因此優(yōu)選用于重癥監(jiān)護(hù)病房的鎮(zhèn)靜。除了鎮(zhèn)靜、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和交感神經(jīng)阻滯作用外，DEX已被證明具有抗炎和抗凋亡作用。臨床表明，腹腔注射DEX可抑制膿毒癥小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，并且這種作用部分是由膽堿能抗炎途徑介導(dǎo)的[11-12]。CLP誘導(dǎo)體內(nèi)模型概括了人類全身性膿毒性肺損傷的主要特征，肺組織病理學(xué)損傷和肺損傷評(píng)分顯著上升，TOS、OSI水平升高，TAS降低。本文研究結(jié)果表明：DEX賦予肺保護(hù)免受CLP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，改善肺、腸系膜血管通透性，降低炎癥因子水平和細(xì)胞凋亡。ALI作為敗血癥的標(biāo)志，是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，盡管ICU有顯著改善，但治療選擇極為有限[13-15]。目前在膿毒癥相關(guān)肺損傷的發(fā)病機(jī)制中廣泛提出了可能由異常激活的ROS引起的線粒體融合和裂變的異常平衡。事實(shí)上，氧化應(yīng)激源于線粒體活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的mtDNA釋放，導(dǎo)致線粒體功能障礙和超微結(jié)構(gòu)損傷[16]。本研究中應(yīng)用血清TOS、TAS和OSI水平反映氧化劑/抗氧化劑平衡。體內(nèi)研究表明，CLP誘導(dǎo)后24 h足以引起氧化損傷。本研究闡明了DEX通過減輕血管滲漏從而對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的ALI起到保護(hù)作用，為膿毒癥的防治提供了新的方向。血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)皮表面，形成一道屏障。循環(huán)血液和組織，避免各種有毒物質(zhì)和炎癥損傷造成的組織損傷。膿毒癥引起的內(nèi)皮損傷導(dǎo)致血管滲漏，從而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征[17]。本研究表明，膿毒癥大鼠的血管通透性顯著增加，DEX給藥減輕了血管滲漏，為膿毒癥引起的血管滲漏和器官功能障礙的防治提供了新的方向。

肺損傷可由內(nèi)毒素和其他細(xì)菌毒素引起。膿毒癥是一種急性炎癥，可增加肺上皮細(xì)胞的通透性并迅速在肺部積聚液體，導(dǎo)致急性肺水腫伴間質(zhì)纖維化[18]。博來霉素誘導(dǎo)的纖維化釋放炎癥細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。中性粒細(xì)胞的激活與炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-1β和IL-6)和趨化因子(IL-8和MCP-1)密切相關(guān)，它們?cè)贏LI中起重要作用。此外，巨噬細(xì)胞募集促纖維化細(xì)胞因子，如TNF-α或(和)IL-6，為纖維化提供微環(huán)境。TNF-α和IL-6反映了機(jī)體的炎癥程度。TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮是重要的促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子之間的相互作用，伴隨著放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加速了膿毒癥誘導(dǎo)的ALI的進(jìn)展，從而改變了血管通路通透性，導(dǎo)致肺水腫的形成[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DEX顯著抑制CLP刺激的肺組織中炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和MCP-1)的表達(dá)，提示DEX可能在肺通過抑制炎癥反應(yīng)。肺組織中的細(xì)胞凋亡與膿毒癥期間肺損傷的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。全身炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)和中性粒細(xì)胞在肺組織中的積累可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肺功能障礙和膿毒癥病死率增加。肺泡凋亡已被證明會(huì)破壞上皮屏障功能，引發(fā)ALI。在本研究中，檢測(cè)到凋亡細(xì)胞以確定DEX對(duì)肺損傷的影響。TUNEL結(jié)果顯示，與模型組相比，DEX組細(xì)胞凋亡率降低，說明外源性DEX能有效抑制膿毒癥ALI大鼠肺上皮細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要凋亡因子；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。Caspase-3是細(xì)胞凋亡下游途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，可觸發(fā)細(xì)胞凋亡并最終介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而刺激Caspase-3誘導(dǎo)肺細(xì)胞凋亡。相比之下，DEX逆轉(zhuǎn)了該過程，表明DEX抑制肺上皮細(xì)胞的凋亡以防止肺損傷。JAK2/STAT3通路涉及許多生物過程，JAK2/STAT3通路在炎癥介導(dǎo)的生物學(xué)進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。許多研究報(bào)告稱，JAK2/STAT3通路參與了ALI的發(fā)展。以往研究報(bào)告稱，JAK與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，而STAT3激酶與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞凋亡有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)STAT可能與ALI的發(fā)展有關(guān)，并證明JAK2/STAT3水平在嚴(yán)重急性胰腺炎ALI大鼠模型中上調(diào)[20]。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組JAK2和STAT3蛋白主要為磷酸化，表達(dá)水平較低。CLP誘導(dǎo)后，肺中的JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，表現(xiàn)為JAK2和STAT3的磷酸化水平升高，DEX顯著抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平，顯著CLP誘導(dǎo)的ALI大鼠模型中JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活。

綜上所述，DEX通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路降低體內(nèi)炎癥反應(yīng)，減少肺上皮細(xì)胞凋亡并改善肺血管通透性，從而可有效抑制與膿毒癥相關(guān)的ALI，這些發(fā)現(xiàn)可能為膿毒癥的治療提供新的方向。