聶清華，李 飛

(咸陽市第一人民醫(yī)院麻醉科,陜西 咸陽 712000)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)是一種被定義為麻醉和手術(shù)后出現(xiàn)的認(rèn)知功能下降，主要以記憶力受損、學(xué)習(xí)困難和注意力減退為特征的輕度認(rèn)知功能障礙[1-2]。POCD是老年手術(shù)患者最常見的術(shù)后并發(fā)癥之一，也是麻醉、精神、老年等各?？乒餐P(guān)注的熱點(diǎn)問題[3]。POCD不僅引起手術(shù)患者康復(fù)延遲，還嚴(yán)重影響其生活自理能力和生活質(zhì)量，顯著增加家庭與社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。然而，目前有關(guān) POCD 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，尚未開發(fā)出預(yù)防和治療POCD發(fā)生的有效藥物。因此，開發(fā)和尋找預(yù)防或治療POCD的臨床方案和藥物對于降低POCD發(fā)生率和減弱POCD危害意義重大。

右美托咪定是一種相對選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，主要應(yīng)用于重癥監(jiān)護(hù)病房患者的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜，被證實(shí)可有效控制重癥監(jiān)護(hù)病房患者譫妄癥狀[5-6]。右美托咪定不僅具有鎮(zhèn)靜、阿片類藥物等作用，還具有抗交感、協(xié)同鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜以及較小的呼吸抑制作用[7-8]。此外，之前的研究還報(bào)道右美托咪定可以通過調(diào)控MAPK/ERK信號通路的激活而抑制麻醉藥物引起的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，進(jìn)而減少麻醉導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9-10]。相關(guān)分子機(jī)制研究提示[11]，右美托咪定具有抑制促凋亡蛋白表達(dá)的作用，這是其抑制神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。本研究旨在探討右美托咪定對異氟烷麻醉后老年小鼠認(rèn)知功能的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠：45只C57BL/6J小鼠(21月齡，SPF級，雄性，28～32 g左右)斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2022-027]。所有小鼠被適應(yīng)性喂養(yǎng)一周(自由進(jìn)食飲水，晝夜各半，22 ℃)后被用于本研究。本研究所涉及動物實(shí)驗(yàn)部分均經(jīng)我院動物倫理委員會審查通過，并監(jiān)督動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

1.1.2 試劑與儀器：吸入異氟烷(國藥準(zhǔn)字H20020267)；鹽酸右美托咪定注射液(國藥準(zhǔn)字H20110085)；Bcl-2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)抗體(41162，CellSignalingTechnology)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)抗體(15071，Cell Signaling Technolog)；BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，P0018S，碧云天生物技術(shù)公司)，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光，C1086，碧云天生物技術(shù)公司)；徠卡激光掃描共聚焦顯微鏡(STELLARIS 5 Cryo，徠卡)；小動物吸入式麻醉機(jī)(R500，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)儀器(XR-XM101-Z，上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組與治療：對照組小鼠被放入麻醉箱中，麻醉箱通入氧氣，維持4 h。模型組小鼠被放入麻醉箱，麻醉箱通入異氟烷和氧氣，異氟烷濃度維持在1.5%，異氟烷麻醉時間共計(jì)4 h。治療組小鼠在被放入麻醉箱前腹腔注射15 μg/kg右美托咪定，然后放在通入1.5%異氟烷和氧氣的麻醉箱中，共計(jì)4 h。

1.2.2 血?dú)夥治觯核行∈笤谕瓿陕樽肀┞逗螅∥察o脈血離心(1000 g，室溫，5 min)以分離血清，pH計(jì)測量血漿pH值。同時使用血?dú)夥治鰞x檢測所有小鼠血氧分壓(PO2)和血二氧化碳分壓(PCO2)。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):所有小鼠完成異氟烷暴露后第2天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)以評估認(rèn)知功能。定位巡航實(shí)驗(yàn)：小鼠被放入一個圓形裝滿水的池子中，池子某一個象限內(nèi)放置一個平臺，將小鼠從池子邊緣放入，記錄小鼠從入水到找到中央平臺的時間，即為逃逸潛伏期。若小鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺，將其引導(dǎo)到平臺上停留15 s再次測定。每次測定間隔時間為半小時，每只小鼠每天測定4次，取其平均值，即為該小鼠當(dāng)天平均逃逸潛伏期，連續(xù)測試5 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束第2天，撤除平臺，將小鼠放入平臺放置象限的對向平臺，記錄2 min內(nèi)小鼠在平臺放置象限的活動時間和跨越平臺的次數(shù)。

1.2.4 礦場實(shí)驗(yàn):Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束第2天進(jìn)行礦場實(shí)驗(yàn)。礦場實(shí)驗(yàn)使用一個圓形封閉裝置，該裝置自底部被分為25個格子，中央為中央格，自中央格放入小鼠，觀察120 s內(nèi)穿越的格子數(shù)(3只腳進(jìn)入其他小方格)、后腿(兩前腿同時離地面)直立次數(shù)以及在中央格停留時間。

1.2.5 神經(jīng)元凋亡檢測:小鼠在完成所有認(rèn)知行為學(xué)檢測后，通過頸椎脫臼法被處死，分離小鼠腦組織海馬區(qū)，4%多聚甲醛室溫固定過夜，經(jīng)石蠟包埋后制作5 μm的組織切片，使用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對小鼠海馬區(qū)組織進(jìn)行染色，在共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)每個視野綠色熒光細(xì)胞數(shù)目(凋亡神經(jīng)元)，每只小鼠共選擇10個視野計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元數(shù)目，取平均值即為該小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目。

1.2.6 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá):小鼠在完成所有認(rèn)知行為學(xué)檢測后，通過頸椎脫臼法被處死，分離小鼠腦組織海馬區(qū)，加入組織裂解液裂解組織，離心以收集裂解液上清，并使用BCA試劑盒測定組織裂解液中總蛋白濃度。使用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳膠進(jìn)行分離細(xì)胞裂解總蛋白，然后將蛋白通過電泳法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。室溫下，使用5%的脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜1 h。PBS溶液洗滌3遍后，隨后與抗Bax和Bcl-2抗體一起在4 ℃條件下孵育過夜。PBS沖溶液洗滌3遍后，加入山羊抗兔或山羊抗鼠的二抗室溫孵育1 h。最后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光儀器拍照檢測蛋白印跡。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較 三組小鼠在麻醉過程中均未出現(xiàn)呼吸抑制，血漿pH值均在正常范圍內(nèi)波動，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；三組小鼠在麻醉期間均未出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象，三組間小鼠PO2和PCO2比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。見表1。

表1 三組小鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較

2.2 三組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 三組小鼠在定位巡航實(shí)驗(yàn)的第1～5天，平均逃逸潛伏期逐漸縮短，但模型組小鼠每天平均逃逸潛伏期均顯著長于對照組小鼠和治療組小鼠(均P<0.05)，見表2。此外，在定速巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，三組小鼠均進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：模型組小鼠在目的象限活動時間均顯著低于對照組小鼠和治療組小鼠，并且模型組小鼠穿越平臺次數(shù)均低于對照組小鼠和治療組小鼠(均P<0.05)，見表3。

表2 三組小鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)逃逸潛伏期比較(s)

表3 三組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 三組小鼠礦場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 三組小鼠分別在完成Morris水迷宮第2天進(jìn)行礦場實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：模型組在中央格停留時間均顯著高于對照組和治療組，而模型組跨格次數(shù)和直立次數(shù)均顯著低于對照組和治療組(均P<0.05)。見表4。

表4 三組小鼠礦場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.4 三組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目均顯著高于對照組和治療組小鼠(均P<0.05)；模型組小鼠海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組和治療組小鼠，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著低于對照組和治療組小鼠(均P<0.05)。見表5。

表5 三組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目和凋亡相關(guān)蛋白含量比較

3 討 論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是圍術(shù)期最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，出現(xiàn)POCD的患者臨床癥狀包括混亂、焦慮、性格改變和記憶力受損[1]。重要的是，術(shù)后認(rèn)知功能障礙還與手術(shù)患者病死率增加、住院時間延長、術(shù)后并發(fā)癥增加和短期生活質(zhì)量下降有關(guān)[3-4]。高齡是POCD的主要危險(xiǎn)因素之一，這主要是由于高齡患者自身調(diào)節(jié)功能受損，身體和心理功能有所減退，對麻醉和手術(shù)等事件的應(yīng)激能力也有所下降；高齡同時伴隨著藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的變化、腎和肝清除能力下降、藥物清除半衰期延長和藥物敏感性的改變[3,12]。此外，老年人常合并多種基礎(chǔ)疾病或損害，如心血管疾病、糖尿病和肝腎功能不全等，這些因素均增加了圍術(shù)期POCD的風(fēng)險(xiǎn)[12]。近年來，隨著我國老齡化進(jìn)程的進(jìn)一步深入，外科手術(shù)中老年患者所占的比例越來越大。而流行病學(xué)數(shù)據(jù)也顯示[13-14]，年齡是POCD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在大、中型非心臟手術(shù)中，65歲以上患者POCD的發(fā)生率高達(dá)40%，而在心臟手術(shù)中，該比例可高達(dá)60%。因此，研究老年患者POCD發(fā)生的分子機(jī)制，尋找可預(yù)防或治療老年P(guān)OCD的新藥物或新的治療方案對減少老年患者POCD發(fā)生率，減低POCD對老年患者的危害意義重大。

本研究將老年小鼠暴露于異氟烷中以建立麻醉誘導(dǎo)的老年小鼠認(rèn)知功能障礙模型，結(jié)果顯示：模型組老年小鼠血?dú)夥治龈黜?xiàng)指標(biāo)均與對照組小鼠比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但每天平均逃逸潛伏期和中央格停留均時間較對照組顯著增加，并且模型組小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中的穿越平臺次數(shù)，在礦場實(shí)驗(yàn)中跨格次數(shù)和直立次數(shù)均顯著減少，這表明異氟烷暴露誘導(dǎo)老年小鼠認(rèn)知功能障礙模型建立成功。這一結(jié)果與Cao等[15]的研究結(jié)果一致，Cao等[15]研究發(fā)現(xiàn)異氟烷暴露可顯著損害老年老鼠認(rèn)知功能障礙。進(jìn)一步分析可知[16]，異氟烷是一種常被用于手術(shù)術(shù)前麻醉和術(shù)中麻醉維持的吸入性麻醉藥物，由于其麻醉誘導(dǎo)和復(fù)蘇均較快，麻醉時無交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮現(xiàn)象等諸多優(yōu)勢而常常被用于老年患者手術(shù)麻醉。因此，本研究使用異氟烷暴露建立麻醉誘導(dǎo)的老年小鼠認(rèn)知功能障礙模型更貼近于臨床實(shí)際。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)右美托咪定治療的治療組小鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)中每天平均逃逸潛伏期和礦場實(shí)驗(yàn)中中央格停留時間均較模型組顯著降低，而治療組小鼠平臺穿越次數(shù)、跨格次數(shù)和直立次數(shù)均顯著升高，表明提前腹腔注射右美托咪定治療可顯著改善異氟烷麻醉引起的老年小鼠認(rèn)知功能障礙。這與屈獻(xiàn)鋒等[17]的研究結(jié)果一致，屈獻(xiàn)鋒等[17]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可顯著降低七氟烷麻醉小鼠逃逸潛伏期和中央格停留時間，提高穿越平臺次數(shù)、跨格次數(shù)和直立次數(shù)。與本次研究所不同的是屈獻(xiàn)鋒等[17]研究所建立的麻醉誘導(dǎo)的老年小鼠認(rèn)知功能障礙模型所使用的藥物是七氟烷，而本次研究所使用的麻醉藥物是異氟烷；相比較于七氟烷，異氟烷在老年患者麻醉誘導(dǎo)和麻醉維持中的應(yīng)用更加廣泛。進(jìn)一步分析可知[5-8]，右美托咪定作為強(qiáng)α2-腎上腺素能激動劑，具有一系列可能對術(shù)后有益的作用，包括右美托咪定通過下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)全身應(yīng)激反應(yīng)而在動物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，臨床研究也發(fā)現(xiàn)[18]，術(shù)中輸注右美托咪定可有效降低重大非心臟手術(shù)老年患者術(shù)后譫妄和認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率。結(jié)合本研究結(jié)果表明，右美托咪定對麻醉引起的老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙具有預(yù)防作用。

進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定治療可通過抑制小鼠海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)而減少異氟烷暴露引起的海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，這與Zhang[19]和Zhu等[20]的研究結(jié)果一致。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡并通過損傷線粒體來損壞學(xué)習(xí)與記憶，是引起老年患者POCD發(fā)生的誘因之一；而Zhu等[20]的研究表明，右美托咪定通過靶向 miR-155 介導(dǎo) ERK1/2 信號通路抑制Bax蛋白表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)而減少氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧引起大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。結(jié)果表明，右美托咪定通過抑制Bax、促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)而減弱外界不良刺激引起的老鼠神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，右美托咪定可顯著改善異氟烷麻醉引起的老年小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與通過Bax/Bcl-2軸調(diào)控的小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡有關(guān)。