徐 艷，陳瑞芳，柯 珂，彭慧婧，姜發(fā)軍**

(1.廣西科學(xué)院，廣西北部灣海洋研究中心，廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣西南寧 530007；2.廣西科學(xué)院，廣西海洋研究所有限責(zé)任公司，廣西北海 536000)

牟氏角毛藻(ChaetocerosmuelleriLemmermann)隸屬于硅藻門(Bacillariophyta)中心硅藻綱(Centricae)盒形藻目(Biddulphiales)角毛藻科(Chaetoceraceae)角毛藻屬(Chaetoceros)，是一種小型的海洋浮游硅藻，其細(xì)胞壁薄，藻體呈金黃色，通常單個或2-3個細(xì)胞相連成群體生活[1]。由于牟氏角毛藻含有大量的脂肪酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，并且具有適鹽性廣、耐高溫、繁殖速度快、抗污染能力強等特點，被廣泛用于魚類、貝類和蝦等幼體的孵化[2-5]。

牟氏角毛藻被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，例如水產(chǎn)養(yǎng)殖、生物能源和環(huán)境凈化等，和其他海洋微藻一樣，其生產(chǎn)性培養(yǎng)存在諸多問題。當(dāng)前在生產(chǎn)上培養(yǎng)微藻所采用的營養(yǎng)鹽五花八門，加之培養(yǎng)設(shè)施多為開放式水泥池，存在易受污染、培養(yǎng)條件難以控制、生長周期受季節(jié)限制、培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定等缺點，導(dǎo)致培養(yǎng)效率低、細(xì)胞密度小等問題。如何建立最優(yōu)的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出充足的純度高、密度大、細(xì)菌少、生長鮮嫩的藻類，顯得尤為重要。

和其他浮游植物一樣，牟氏角毛藻的生長與生活環(huán)境密切相關(guān)，除了受到溫度、鹽度、光照、營養(yǎng)鹽等諸多非生物因素的影響，還受到生物因素、培養(yǎng)方式以及其他因素的綜合影響[6-10]。研究微藻的生長、組成與基礎(chǔ)生態(tài)因子的關(guān)系，是一項必需的基礎(chǔ)性研究工作。目前國內(nèi)外有很多關(guān)于藻類培養(yǎng)條件優(yōu)化方面的研究，為了解各種影響因素對牟氏角毛藻生長和組成的影響規(guī)律，獲得既能平衡生物量生長，又能誘導(dǎo)油脂積累的培養(yǎng)條件，本文分別從非生物因素、生物因素以及大規(guī)模培養(yǎng)和采收3個層面概述牟氏角毛藻的研究進(jìn)展，為優(yōu)化培養(yǎng)條件、增加生物量、促進(jìn)油脂積累和提高ω-3不飽和脂肪酸含量提供理論依據(jù)，以期為今后開展牟氏角毛藻的培養(yǎng)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 非生物因素的影響

1.1 環(huán)境因素

作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用較多的硅藻之一，牟氏角毛藻為耐高溫種類，適合夏季培養(yǎng)[11]。駱云慧等[12]認(rèn)為硅藻門種群的變化主要與溫度、鹽度等密切相關(guān)，還受到各種環(huán)境因子交互作用的影響[13]，應(yīng)根據(jù)藻的生長習(xí)性確定最適的水溫、鹽度等，并保持相對穩(wěn)定。

1.1.1 溫度

溫度是影響海洋微藻生長和繁殖最重要的生態(tài)因子之一，其對酶的活性、營養(yǎng)物的吸收及細(xì)胞分裂周期等均產(chǎn)生較大影響，溫度波動頻率和幅度越大對牟氏角毛藻的生長速率和藻細(xì)胞密度的增加越不利[14]。牟氏角毛藻屬于耐高溫的海洋微藻[15,16]，在25-34℃均能正常生長繁殖，其適宜的生長溫度為28-31℃，最適生長溫度是31℃[5]。類似地，Minggat等[5]的研究結(jié)果也表明，牟氏角毛藻生物量生產(chǎn)的最適溫度為30℃，但在20-35℃可以保持至少66%的最高產(chǎn)量。在適宜溫度范圍外的低溫(25℃)下，牟氏角毛藻呈現(xiàn)緩慢生長狀態(tài)，但有利于胞內(nèi)短鏈脂肪酸的積累[17,18]，而當(dāng)溫度升至適宜溫度時隨即迅速恢復(fù)生長，推測可能是低溫對牟氏角毛藻生長產(chǎn)生了短暫的抑制效應(yīng)[14,19]。

1.1.2 鹽度

鹽度變化對海洋微藻的生長和生理反應(yīng)產(chǎn)生較大影響[14]。牟氏角毛藻在5-40的鹽度條件下均能生長，但中鹽度(20-30)是牟氏角毛藻穩(wěn)定培養(yǎng)的適宜鹽度范圍，在21-26的鹽度條件下藻細(xì)胞生長速度較快，其中最適鹽度為(20±1)，此時總脂產(chǎn)率最高[14,20,21]。不同的海域會導(dǎo)致牟氏角毛藻的最適鹽度存在一定差異[5]。

1.1.3 光照條件

光照作為影響微藻生長的重要生態(tài)因子，主要從光照強度和光質(zhì)等方面來影響其生長[22-24]。多數(shù)海洋微藻對光能有相同的適應(yīng)生理，對光照強度有一個光飽和點，低于光飽和點時，隨著光照強度增加生長速率增加；高于光飽和點時生長速率減慢[14，25]。研究表明，硅藻最適的光照強度一般在2 000-10 000 lx，不同硅藻生長和積累脂肪的最適光照強度不同，而同一種藻的最適光照強度也存在差異，這可能與所處的海區(qū)氣候、水質(zhì)環(huán)境和培養(yǎng)密度有極大關(guān)聯(lián)，為環(huán)境因子間的交互作用導(dǎo)致[5,14-16]。

不同的光質(zhì)對牟氏角毛藻的生長有不同的作用。顧穎慧[26]在單色綠光條件下，采用不同梯度的光照強度，研究了綠光對牟氏角毛藻生長的影響，結(jié)果表明綠光能促進(jìn)牟氏角毛藻的繁殖，但所需光照強度不高，適宜的光照強度是30-130 lx，牟氏角毛藻在70 lx達(dá)到最大生長速率。關(guān)萬春等[27]研究發(fā)現(xiàn)，紫外輻射(Ultra Violet Radiation，UVR)可以抑制藻類的生長、光合固碳和游動性(有鞭毛的種類)，并損傷細(xì)胞色素和遺傳物質(zhì)DNA。Liang等[28]研究了紫外線輻射對牟氏角毛藻生長、光合作用以及脂肪酸組成的影響，結(jié)果表明所有主要脂肪酸均隨采收期和紫外線輻射而變化，在光合有效輻射加紫外輻射處理下，單不飽和脂肪酸的百分比增加，而二十碳五烯酸(EPA)等多不飽和脂肪酸降低。Iwasaki等[24]通過將不同的光質(zhì)調(diào)整為相等的光合可利用輻射，研究了光質(zhì)對牟氏角毛藻大分子組成的影響，發(fā)現(xiàn)在白光、藍(lán)光和綠光下牟氏角毛藻的生長速率和光合產(chǎn)氧量沒有變化，但在紅光下較低，藍(lán)光提高了生物量、總蛋白質(zhì)、總脂質(zhì)、總碳水化合物和脂肪酸生產(chǎn)的能源投資回報率，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料生產(chǎn)。

1.1.4 通氣狀況

CO2對微藻光合作用及固碳效率的影響已有廣泛的研究，高濃度的CO2能促進(jìn)脂肪酸的合成，但對于不飽和脂肪酸的定向積累則仍是值得研究的問題。胡晗華等[29]的研究結(jié)果顯示，大氣中CO2濃度加倍(700 μL·L-1)可促進(jìn)牟氏角毛藻的生長。鄒寧等[30]的研究表明，牟氏角毛藻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)達(dá)到一定密度之后，CO2的供應(yīng)可以有效地提高生長速度和細(xì)胞密度，并且不同的CO2通入方式，產(chǎn)生的效果不同，其中以空氣和純CO2混合后通入效果最好。Wang等[31]認(rèn)為，在高CO2通氣水平(10%-20%)下，牟氏角毛藻生長良好，在10% CO2曝氣條件下，各指標(biāo)均達(dá)到最高值。王蒙等[32,33]指出，CO2/空氣=1/15 (約6.7%)的混合氣體最適合牟氏角毛藻的生長以及粗脂肪的積累；CO2/空氣=1/25 (4.0%)最適合牟氏角毛藻不飽和脂肪酸的積累。

1.2 營養(yǎng)鹽

為了獲得最佳的營養(yǎng)鹽配方，許多學(xué)者研究了營養(yǎng)鹽對牟氏角毛藻生長和組成的影響。目前，關(guān)于單因子營養(yǎng)鹽對硅藻生長影響的報道較多，而多因子組合對硅藻生長影響的報道較少。

1.2.1 營養(yǎng)鹽的來源

硅藻生長所需的營養(yǎng)元素主要包括氮、磷、硅、鐵等，不同的硅藻生長所需的營養(yǎng)鹽來源不同，在不同的培養(yǎng)期影響也不同，不同來源的營養(yǎng)鹽會導(dǎo)致牟氏角毛藻的生化特征發(fā)生變化[34]。朱昔恩等[35]和張國慶等[36]認(rèn)為牟氏角毛藻的最適氮源為硝酸鈉，尿素和碳酸氫銨在高濃度(>75 mg·L-1)下對其生長有明顯抑制作用；而班劍嬌等[21]則認(rèn)為最佳氮源為尿素，硝酸鈉次之，氯化銨較差。除此以外，在磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉2種磷源中，用磷酸二氫鉀培養(yǎng)牟氏角毛藻效果最佳；有機(jī)碳源(C6H12O6)的促長效果優(yōu)于無機(jī)碳源(NaHCO3)；以硅酸鈉為硅源最佳；維生素B1和B12聯(lián)用效果顯著優(yōu)于分別單獨添加(P<0.05)；在硫酸亞鐵和檸檬酸鐵2種鐵源中，用檸檬酸鐵培養(yǎng)牟氏角毛藻效果最佳[35-37]。

1.2.2 營養(yǎng)鹽的濃度和比例

營養(yǎng)鹽在適宜濃度下能顯著促進(jìn)微藻的生長，進(jìn)而提高規(guī)?；囵B(yǎng)的產(chǎn)量和穩(wěn)定性，但在高濃度下均對藻的生長速度和藻細(xì)胞濃度產(chǎn)生明顯的抑制作用[38]。另外，營養(yǎng)鹽的濃度和比例對微藻油脂含量和百分比組成有很大影響，其中以氮、磷、硅的影響最為顯著，而營養(yǎng)鹽脅迫則有利于藻細(xì)胞脂肪尤其是甘油三酯的積累[39-41]。McGinnis等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在氮缺乏時，牟氏角毛藻的脂肪積累明顯提高，為對照的5倍多。

微藻的生長不僅與營養(yǎng)鹽的濃度有關(guān)，當(dāng)營養(yǎng)鹽達(dá)到一定水平時，還受營養(yǎng)鹽比例的影響，比例過高或過低均不利于微藻的生長[42]。曲克明等[43]研究了氮、磷及其比例對浮游硅藻組成的影響，認(rèn)為氮、磷濃度越高，氮磷比(N/P)離Redfield比(16∶1)越遠(yuǎn)，硅藻種類越少，且硅藻在高氮磷比條件下生長較好。

文獻(xiàn)報道的牟氏角毛藻營養(yǎng)鹽的最適濃度和比例差異不大，且在較高的N/P時具有更好的適應(yīng)性[44]。有研究者認(rèn)為，氮與磷的質(zhì)量濃度比為(23-28)∶1時，牟氏角毛藻生長最快[41,45,46]；而王揚才[47]認(rèn)為培養(yǎng)牟氏角毛藻的氮、磷、鐵質(zhì)量濃度的理想比例為30∶3∶0.1;張國慶等[36]則認(rèn)為最佳氮、磷、鐵質(zhì)量濃度比例為30∶0.5∶0.2。以上差異可能是不同營養(yǎng)因子間的相互作用以及培養(yǎng)條件不同造成的。王蒙等[32,48]報道了不同碳氮比(C/N，1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)培養(yǎng)液對牟氏角毛藻生長及總脂含量的影響，綜合比較表明，C/N比為2∶1時，最適合牟氏角毛藻的生長及總脂肪積累。

楊彥豪等[49]和曲克明等[50]研究了銅、鋅離子對牟氏角毛藻生長的生態(tài)效應(yīng)，結(jié)果表明，銅離子活度低于10-7.80mol·L-1時，角毛藻生長繁殖良好，銅離子活度≥10-7.80mol·L-1時產(chǎn)生毒性；鋅離子并非為牟氏角毛藻所必需，鋅離子活度>10-7.00mol·L-1時不利于牟氏角毛藻生長繁殖；與鋅離子相比，牟氏角毛藻對銅離子的毒性更為敏感。

1.3 其他環(huán)境因素

據(jù)報道，在適宜超聲波頻率條件下，采用低功率、短時間、多次間歇超聲輻射，牟氏角毛藻的生長速率常數(shù)、脂肪酸不飽和度和主要不飽和脂肪酸百分比均有不同程度的提高，其中，生長的最佳超聲輻射條件為20 kHz、6 W、10 s、3次；提高脂肪酸不飽和度和主要不飽和脂肪酸百分比的最佳超聲輻射條件為30 kHz、4 W、10 s、3次[51]。

雖然天然海水中稀土元素屬超痕量水平，但是稀土對植物光合作用也有明顯的促進(jìn)作用。曲克明等[52]研究了混合稀土對牟氏角毛藻生長繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)稀土對牟氏角毛藻的生長繁殖有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理可能是稀土元素離子通過與某些酶結(jié)合，激活了酶的活性，從而使單胞藻的光合作用加快。另外，辛福言等[53]研究了稀土絡(luò)合物鑭-脯氨酸和鑭-苯丙氨酸對牟氏角毛藻的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種絡(luò)合物對藻細(xì)胞的繁殖和葉綠素的合成均有明顯的促進(jìn)作用，鑭的氨基酸絡(luò)合物與鑭對藻的作用效果是等同的，但最佳濃度明顯降低。

2 生物因素的影響

2.1 共培養(yǎng)微藻

據(jù)邵波等[54]的報道，牟氏角毛藻與青島大扁藻(Platymonashelgolandica)共培養(yǎng)時，角毛藻/扁藻的接種比例為2∶1左右比較合適，該比例既能保證牟氏角毛藻的生產(chǎn)，又能維持一定的青島大扁藻數(shù)量。胡一丞等[55]研究了牟氏角毛藻與微擬球藻(Nannochloropsissp.)的混合培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)果表明，角毛藻/微擬球藻的接種比例為5∶1左右比較合適，該比例既能保證牟氏角毛藻的生產(chǎn)，又能維持一定的微擬球藻數(shù)量。另外，Long[56]研究了牟氏角毛藻與微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum)的化感作用，結(jié)果顯示，微小亞歷山大藻的化感物質(zhì)在幾分鐘內(nèi)就破壞了牟氏角毛藻的膜功能，引起膜的通透性改變、光合作用的抑制、活性氧的產(chǎn)生以及膜生化組成的改變，并且此化感物質(zhì)的化學(xué)效價可由環(huán)境參數(shù)顯著調(diào)節(jié)。

2.2 水生細(xì)菌和病毒

水生細(xì)菌與微藻有著密切的關(guān)系，一方面，它們吸收微藻產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)，為藻的生長提供必要的營養(yǎng)和生長因子，調(diào)節(jié)藻的生長環(huán)境；另一方面，它們也可以抑制藻細(xì)胞的生長，甚至裂解藻細(xì)胞[57]。喬洪金等[58]發(fā)現(xiàn)了一株牟氏角毛藻伴生菌(Marinobactersp.)，屬于化能異養(yǎng)的革蘭氏陰性菌，其在分解微藻胞外產(chǎn)物為微藻提供無機(jī)營養(yǎng)鹽、分泌促生長因子和促進(jìn)微藻的生長等方面可能發(fā)揮著重要作用。王媛媛[59]從浙江寧波象山港海域水樣中，分離得到一種對牟氏角毛藻具有溶藻效果的細(xì)菌，該菌是一種混合菌，至少有兩種不同的形態(tài)，溶藻方式為競爭性溶藻。吳慶喜等[60]新發(fā)現(xiàn)了一株能裂解牟氏角毛藻的病毒，命名為牟氏角毛藻病毒，該病毒具有很強的感染力和嚴(yán)格的宿主專一性。

藻際微環(huán)境中聚集著大量細(xì)菌[61]，通過藻菌間的相互作用及雙向選擇，可以形成以藻為基礎(chǔ)的、特定的、具有獨特作用的、與藻共存的細(xì)菌群落(藻際細(xì)菌)[62]，這種藻-菌共生系統(tǒng)可以促進(jìn)微藻的生長，并對外來影響因素具有明顯的排他性和復(fù)原性特點。據(jù)林偉等[61-63]的報道，餌料微藻培育系統(tǒng)能抑制弧菌，但是這種抑制作用需要微藻及與藻際細(xì)菌相互配合、協(xié)同作用，而且在數(shù)量上需要達(dá)到一定水平。姚雪梅等[64]研究了不同接種密度的牟氏角毛藻培育系統(tǒng)對副溶血弧菌(Vibroparahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)的抑制效果及其相關(guān)性，結(jié)果表明，牟氏角毛藻培育系統(tǒng)能夠抑制2種弧菌的生長，但弧菌并沒有促進(jìn)或抑制牟氏角毛藻的生長，其作用僅表現(xiàn)在競爭生態(tài)空間上，所以，牟氏角毛藻是理想的生物餌料，更為重要的是，它不僅不能被弧菌裂解，還能拮抗弧菌。

3 其他影響因素

3.1 大規(guī)模培養(yǎng)

微藻的大規(guī)模培養(yǎng)主要有兩種模式：開放池培養(yǎng)和光合密閉培養(yǎng)[1]。開放池培養(yǎng)可以利用自然水源或大的淺水池、水槽、圓形池和跑道式池塘，所需設(shè)備簡單、投資少、成本低，但易受氣候條件的影響，需要大面積的場地，易受微生物的污染且微藻易被浮游生物捕食，因此采用開放池培養(yǎng)時，藻的生長速度比較慢，生物量也較低。光合密閉培養(yǎng)可以利用跑道式、板式、管狀等生物反應(yīng)器，雖然生物反應(yīng)器密閉培養(yǎng)模式存在設(shè)備成本高、滅菌困難等缺點，但它將是微藻大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)展方向[1]。

3.2 藻的采收

目前通常采用液體法培養(yǎng)牟氏角毛藻?？捎糜谖⒃宀墒盏募夹g(shù)包括離心、過濾、混凝、空氣浮選、超聲處理和絮凝處理?？紤]到運行經(jīng)濟(jì)、收獲效率和技術(shù)可行性，絮凝處理是從大規(guī)模養(yǎng)殖中收獲微藻的最佳方法。微藻的絮凝方式有自然絮凝、pH和殼聚糖誘導(dǎo)絮凝。被用于收獲不同藻類的絮凝劑有無機(jī)金屬離子和有機(jī)陽離子聚合物等。Kumaran等[6]將陽離子聚合物殼聚糖用于收獲牟氏角毛藻，并比較了3種絮凝方式對藻生物量回收率的影響。與此同時，Huo等[65]分析了牟氏角毛藻的堿性絮凝機(jī)理，發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞的粒徑隨著pH值的增加而線性增加，堿性絮凝主要歸因于氫氧化鎂的產(chǎn)生，而不是磷酸鈣或氫氧化鈣。

4 總結(jié)與展望

牟氏角毛藻的生長除了受到諸多非生物因素和生物因素的影響外，還受到培養(yǎng)方式的影響，并且隨季節(jié)、地區(qū)和人為因素等多種因素的變化而變化[9,66]，任何一種因子的缺乏或過量都會導(dǎo)致脅迫的產(chǎn)生，從而對牟氏角毛藻的生長產(chǎn)生不同程度的影響。

溫度、鹽度、光照和氮、磷營養(yǎng)鹽是影響牟氏角毛藻生長和繁殖的主要生態(tài)因子，其中溫度對牟氏角毛藻的生長和發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，對酶的活性、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率及細(xì)胞分裂周期等諸多方面都存在不同程度的影響；鹽度在一定程度上影響牟氏角毛藻的滲透壓、營養(yǎng)鹽的吸收及其懸浮性；光照的強弱和時間的長短決定牟氏角毛藻的光合作用效率，對藻的生長速率也起著至關(guān)重要的作用[14]；氮、磷營養(yǎng)鹽條件不僅是決定牟氏角毛藻生長繁殖的主要因子，也是微藻種間競爭的關(guān)鍵因素之一。在理想環(huán)境條件下，牟氏角毛藻無須改變?nèi)魏渭?xì)胞內(nèi)部的生理或生化功能，就能保持光合作用的能量供應(yīng)和卡爾文循環(huán)的能量消耗之間的平衡，而這種能量平衡則反映在牟氏角毛藻適宜的生長率上[13]。

牟氏角毛藻是一種很有前途的生物量新來源，被廣泛應(yīng)用于蝦、蟹、貝類幼體及海水仔魚的人工育苗，以促進(jìn)生長和降低死亡率[67]；同時還可以有效降低養(yǎng)殖水體的污染，去除水體殘留抗生素[68]。在育苗和養(yǎng)殖生產(chǎn)中開展牟氏角毛藻培養(yǎng)條件的研究，以及培養(yǎng)條件間的交互作用對其重要營養(yǎng)物質(zhì)含量影響的研究，摸清不同條件下牟氏角毛藻的生長規(guī)律，是深度開發(fā)牟氏角毛藻資源的重要工作[69,70]。然而，對于牟氏角毛藻的商業(yè)化應(yīng)用，還需要在優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)、優(yōu)化可持續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)和增強下游加工方面，應(yīng)用戰(zhàn)略性的新型生物技術(shù)方法進(jìn)行探索[71,72]。