吳楊平，曹 奕，陳愛華，張 雨，陳素華，張志東

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007)

江蘇省作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖大省之一，擁有豐富的海水貝類資源。2020年，江蘇省海水貝類產(chǎn)量約為63.09萬t，占全省海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的68.4%。其中，以文蛤(Meretrixmeretrix)為代表的蛤類是江蘇省主要的養(yǎng)殖品種，產(chǎn)量達38.88萬t，占海水貝類產(chǎn)量的61.6%[1]。然而，由于圍填海、港口建設(shè)等因素的影響，文蛤等經(jīng)濟貝類所處的潮間帶灘涂棲息環(huán)境受到影響，灘涂養(yǎng)殖資源量有所下降[2]。為了彌補灘涂養(yǎng)殖文蛤?qū)︿N售市場供應(yīng)的嚴(yán)重不足，池塘養(yǎng)殖文蛤已成為穩(wěn)定市場供給的必要補充，并逐漸形成了由粗放型養(yǎng)殖向集約化養(yǎng)殖發(fā)展的新趨勢。

目前，我國養(yǎng)殖池塘正處于生態(tài)化改造實施階段，多營養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖(Integrated Multi-Trophic Aquaculture，IMTA)等生態(tài)健康養(yǎng)殖模式得到大力推廣。多營養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖狹義上是指在同一水體進行不同營養(yǎng)層次生物的混養(yǎng)[3]，在生產(chǎn)過程中常見的綜合養(yǎng)殖模式有蝦貝混養(yǎng)、魚蝦混養(yǎng)、蝦蟹混養(yǎng)等[4-6]。混養(yǎng)模式相比傳統(tǒng)的單一養(yǎng)殖模式能提高單位水體利用效率，獲取額外經(jīng)濟效益，提升產(chǎn)品品質(zhì)[7]。在肌肉營養(yǎng)品質(zhì)[8,9]、水體穩(wěn)定性[10]、生化免疫[11]等方面混養(yǎng)模式要優(yōu)于單養(yǎng)模式。因此，探討不同養(yǎng)殖模式下文蛤的生理狀況，對文蛤的健康養(yǎng)殖及綠色生態(tài)模式構(gòu)建具有重要意義。

代謝組(Metabolome)是指在某段時間細胞內(nèi)代謝物的集合，是生物體生理狀態(tài)的直觀反映，能夠切實有效地反映環(huán)境因素的影響[12]。代謝組學(xué)通過多元統(tǒng)計方法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)結(jié)合，可以更直觀地看到生物體在特定環(huán)境中代謝物的變化，相比于單一指標(biāo)的測定，其所反映的生物體生理狀況更為全面準(zhǔn)確[13]。目前有關(guān)文蛤生理情況的研究主要集中在排氨率和耗氧率、基因或蛋白表達量及酶活指標(biāo)測定等[14-16]，關(guān)于紅殼色文蛤(以下簡稱“紅文蛤”)選育系的研究主要利用代謝組分析不同世代營養(yǎng)品質(zhì)的差異[17]，但尚未見有不同養(yǎng)殖模式對紅文蛤代謝生理影響的研究報道。因此，本實驗擬從代謝組學(xué)角度研究紅文蛤在不同養(yǎng)殖模式下代謝產(chǎn)物的差異，旨在探究紅文蛤在不同養(yǎng)殖模式下的代謝響應(yīng)機制，為文蛤的科學(xué)健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計

實驗所用文蛤為江蘇省文蛤良種場繁育的紅文蛤選育系，紅文蛤養(yǎng)殖采用單養(yǎng)(D組)和蝦蛤混養(yǎng)(H組)兩種模式，實驗地點位于江蘇省啟東市某家庭農(nóng)場。池塘四周平臺建3-5 m寬的貝埕用于紅文蛤養(yǎng)殖(放養(yǎng)密度50萬粒/667 m2)，貝埕水深控制在0.5-1.0 m，混養(yǎng)池塘深水區(qū)放養(yǎng)脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)種蝦(養(yǎng)殖密度為1-1.5 kg/667 m2)，其余環(huán)境條件基本一致(pH值為7.6-8.0)。H組和D組各設(shè)置3個平行，紅文蛤4月份投苗養(yǎng)殖至當(dāng)年9月份取樣，樣品規(guī)格如表1所示。從池塘南北兩處平臺上分別隨機選取30個活力良好的紅文蛤組成2個樣品，將紅文蛤樣品置于冰面解剖獲取部分肝胰腺，于液氮中速凍，放置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；另取足部肌肉混樣用于游離氨基酸測定。稱取樣品并加入5%三氯乙酸，于均質(zhì)機(FSH-2A，常州市億能實驗儀器廠)均質(zhì)并定容至25 mL，超聲波提取20 min后，靜置2 h，用雙層濾紙過濾，吸取1 mL過濾液，離心10 min (4℃，10 000 g)，吸取上清液，采用高效液相色譜儀測定氨基酸組成和含量。

表1 紅文蛤樣品規(guī)格 Table 1 Sample specification of red M.meretrix

1.2 方法

1.2.1 代謝物提取

精確稱取樣品(100±0.02) mg至5 mL EP管中，加入1 mL組織提取液(75%甲醇∶氯仿=9∶1，25% ddH2O)，再加入3顆鋼珠，于組織研磨儀50 Hz研磨1 min，重復(fù)上述操作2次。室溫超聲波提取30 min，冰上放置30 min，12 000 g離心20 min，取上清液650 μL至2 mL離心管中，真空濃縮儀濃縮后，加入200 μL 50%乙腈溶液配置4 mg/L 2-氯苯丙氨酸溶液復(fù)溶樣品，經(jīng)過0.22 μm膜過濾，得到待測液[18]。

1.2.2 LC-MS檢測

色譜條件：儀器采用液相色譜儀(賽默飛Thermo Vanquish)，使用ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm (2.1 mm×150 mm)色譜柱，自動進樣器溫度設(shè)為8℃，以0.25 mL/min的流速、40℃的柱溫，進樣2 μL進行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水(A2)- 0.1%甲酸乙腈(B2)，負(fù)離子5 mmol/L甲酸銨水(A3)-乙腈(B3)。梯度洗脫程序為0-1 min，2% B2/B3；1-9 min，2%-50% B2/B3；9-12 min，50%-98% B2/B3；12-13.5 min，98% B2/B3；13.5-14 min，98%-2% B2/B3；14-20 min，2% B2-正模式,14-17 min，2% B3-負(fù)模式。

質(zhì)譜條件：儀器使用質(zhì)譜儀(賽默飛Thermo Q Exactive Plus)，電噴霧離子源(ESI)，正(Positive,PDS)、負(fù)(Negative,NEG)離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度325℃，以分辨率70 000進行全掃描，掃描范圍 m/z為81-1 000，并采用高能誘導(dǎo)裂解(HCD)進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理與代謝物篩選

使用ProteoWizard軟件(v3.0.8789)將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成xcms輸入文件格式，利用R軟件(v3.3.2)的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾和峰對齊，得到包括質(zhì)核比、保留時間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出通過Excel等軟件進行后續(xù)分析，進而通過峰面積批次歸一化等手段比較不同量級的數(shù)據(jù)[19]。在多元統(tǒng)計分析前對數(shù)據(jù)進行自適(UV)換算處理，以獲得更加可靠且直觀的結(jié)果。轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)矩陣通過主成分分析(PCA)獲得樣本總體分布情況，然后應(yīng)用偏最小二乘法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)判別分析組間差異。同時，基于京都基因及基因組百科全書(KEGG，https://www.genome.jp /kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫和代謝通路分析(MetPA，https://www.metaboanalyst.ca)進行代謝物ID的轉(zhuǎn)換以及代謝物富集分析。

篩選條件：在P≤0.05且變量投影重要度(VIP)≥1的條件下進行代謝物篩選。篩選后對代謝物進行鑒定，首先須確認(rèn)代謝物精確分子量(分子量誤差<30 ppm)，然后根據(jù)MS/MS模式所得碎片信息在人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB，https://www.hmdb.ca)、Metlin數(shù)據(jù)庫(https://metlin.scripps.edu)、Massbank數(shù)據(jù)庫(https://www.massbank.jp/)、LipidMaps數(shù)據(jù)庫(https://www.lipidmaps.org)以及Mzcloud數(shù)據(jù)庫(https://www.mzcloud.org)進一步匹配注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元統(tǒng)計分析

將兩種不同養(yǎng)殖模式的紅文蛤樣品進行PCA，結(jié)果顯示所有樣本均出現(xiàn)在95%置信區(qū)間的橢圓內(nèi)，正負(fù)離子模式下D組和H組數(shù)據(jù)點在空間分布上明顯分離，表明兩組之間的代謝模式有差異[圖1:(a)(b)]。在PLS-DA和OPLS-DA兩種模型下，D組和H組樣本均發(fā)生組內(nèi)聚集且組間分離趨勢，以O(shè)PLS-DA模型下更加明顯[圖1:(c)(d)(e)(f)]，說明單養(yǎng)模式和蝦蛤混養(yǎng)模式下紅文蛤代謝模式產(chǎn)生了變化。PLS-DA和OPLS-DA模型中R2和Q2用于判別模型的穩(wěn)定性，由表2可知，PLS-DA和OPLS-DA模型中R2和Q2均大于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠，且數(shù)值越接近1說明模型越好。

圖1 紅文蛤肝胰腺的代謝物譜散點圖Fig.1 Scatter diagram of hepatopancreas metabolite spectra of red M.meretrix

圖1 紅文蛤肝胰腺的代謝物譜散點圖(續(xù)圖)Fig.1 Scatter diagram of hepatopancreas metabolite spectra of red M.meretrix (continued figure)

表2 PLS-DA與OPLS-DA模型的評價參數(shù)Table 2 Evaluation parameters of PLS-DA and OPLS-DA model

2.2 差異代謝物的篩選

通過代謝物篩選，最終獲得3 192種差異代謝物，其中POS模式中有1 386種，NEG模式中有1 806種。其中，在POS模式中上調(diào)的差異代謝物有491種，下調(diào)的差異代謝物有895種[圖2(a)]；在NEG模式中上調(diào)的差異代謝物有601種，下調(diào)的差異代謝物有1 205種[圖2(b)]。進一步通過代謝物鑒定，可獲得準(zhǔn)確信息的代謝物有151種，其中POS模式中有105種，NEG模式中有46種。

Red indicates significantly up-regulated metabolites,blue indicates significantly down-regulated metabolites圖2 差異代謝物柱狀圖Fig.2 Bar plots of differential metabolites

差異代謝物聚類分析熱圖結(jié)果如圖3所示。與D組相比，H組有54種差異代謝物上調(diào)，97種差異代謝物下調(diào)。這些差異顯著的代謝物主要包括氨基酸及其衍生物(如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等)、核苷酸(如AMP、胞嘧啶苷酸、尿嘧啶苷酸等)、能量物質(zhì)等。其中，氨基酸及其衍生物上調(diào)的有L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸等，下調(diào)的有L-丙氨酸、2-氧精氨酸等。

圖3 紅文蛤顯著差異代謝物的凝聚層次聚類分析熱圖Fig.3 Aggregation hierarchical cluster analysis heat map of significantly different metabolites of red M.meretrix

2.3 差異代謝物的代謝通路分析

將H組和D組比較后得到的顯著性差異代謝物進行KEGG代謝通路富集，共富集到76條代謝通路。IP (Impact)>0.2 中排名前9的代謝通路分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，精氨酸生物合成，谷胱甘肽代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，泛酸和輔酶A的生物合成，嘧啶代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(圖4)。可見兩種養(yǎng)殖模式以氨基酸代謝通路影響為主，富集顯著性最高的是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路。篩選出的8種差異代謝物(谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、L-精氨酸、鳥氨酸、γ-氨基丁酸、2-氧精氨酸、尿嘧啶)的位置、相互作用關(guān)系以及它們指向的代謝路徑如圖5所示。其中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸是上述9條代謝通路中的關(guān)鍵差異代謝物(表3)。

圖4 紅文蛤差異代謝物的代謝通路影響因子分析Fig.4 Metabolic pathway influencing factors analysis of different metabolites of red M.meretrix

Red arrow represents up regulation,green arrow represents down regulation,blue arrow represents the relationship between metabolites圖5 關(guān)鍵差異代謝物在主要代謝通路上的關(guān)系示意圖Fig.5 Schematic diagram of the relationship between key differential metabolites on major metabolic pathways

表3 KEGG通路富集結(jié)果Table 3 Results of KEGG pathway enrichment

2.4 氨基酸測定驗證

兩種不同養(yǎng)殖模式下紅文蛤斧足組織氨基酸的測定結(jié)果顯示，D組和H組存在差異。由表4可知，H組與D組相比，天冬酰胺、谷氨酸等9種氨基酸含量發(fā)生了顯著變化(P<0.05)，這與代謝組的分析結(jié)果基本一致。

表4 兩種養(yǎng)殖模式下紅文蛤氨基酸測定結(jié)果Table 4 Determination results of amino acids in red M.meretrix under two different culture modes

3 討論

本研究結(jié)果表明，混養(yǎng)模式和單養(yǎng)模式下紅文蛤的代謝存在差異，可能是由于不同的養(yǎng)殖模式下其群落結(jié)構(gòu)、浮游植物數(shù)量及水體理化指標(biāo)等諸多因素均有不同，對養(yǎng)殖生物的生理狀態(tài)和物質(zhì)積累有不同程度的影響。有研究表明，蟹蝦貝混養(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)的細菌群落結(jié)構(gòu)與功能得到了優(yōu)化，所以混養(yǎng)系統(tǒng)中水體細菌群落代謝活性顯著高于單養(yǎng)系統(tǒng)[20]，而且這些微生物涉及動物的營養(yǎng)、安全和健康，對于保持養(yǎng)殖池塘的生產(chǎn)力和生態(tài)效率有著重要意義[21]。蝦貝混養(yǎng)可以使品種間生長、餌料利用等方面相互促進。有研究表明混養(yǎng)模式對化學(xué)需氧量(COD)、懸浮物、活性磷、葉綠素a、浮游藻類數(shù)量和弧菌數(shù)量均有較大影響，而混養(yǎng)模式中這些水體環(huán)境的生物因子比單養(yǎng)池塘更有利于養(yǎng)殖品種的生長[5]；蝦在水體里頻繁活動對底質(zhì)碎屑的擾動可以提高碎屑的利用率，底棲生物的生長則與碎屑的利用率息息相關(guān)[4]。本研究的蝦蛤混養(yǎng)系統(tǒng)中，脊尾白蝦和紅文蛤均屬于池塘底部生活品種，而且紅文蛤埋棲較淺，有的泥質(zhì)松軟處甚至出現(xiàn)泥面上的大量層疊分布，脊尾白蝦的覓食、游動等生物攪動可能也會對養(yǎng)殖紅文蛤的生理生態(tài)產(chǎn)生影響。筆者認(rèn)為養(yǎng)殖過程中蝦的排泄物及殘餌的積累促進了底泥中微生物群落，如底棲硅藻、氨氧化菌(AOB)、亞硝酸鹽氧化菌(NOB)等的生長與繁殖，從而為紅文蛤的埋棲生活營造了適宜的養(yǎng)殖微環(huán)境，促進了紅文蛤生長與營養(yǎng)物質(zhì)的積累。王煜坤等[22]的研究表明羅非魚(Oreochromisniloticus)混養(yǎng)模式下的氨基酸總量要高于單養(yǎng)模式。張愛芳等[8]也認(rèn)為混養(yǎng)模式不會降低草魚(Ctenopharyngodonidellus)的營養(yǎng)價值，反而會提高蛋白質(zhì)含量、降低脂肪含量，在一定程度上能提高草魚的肌肉品質(zhì)。本研究通過氨基酸測定進一步驗證了兩種養(yǎng)殖模式下氨基酸的差異，蝦蛤混養(yǎng)組的天冬氨酸、谷氨酸這兩種鮮味氨基酸要顯著高于單養(yǎng)組，這與代謝組測定結(jié)果一致。因此，蝦蛤混養(yǎng)同樣有助于紅文蛤?qū)Π被岬姆e累。

本研究通過LC-MS技術(shù)對單養(yǎng)和混養(yǎng)兩種模式的紅文蛤代謝物進行了研究，共觀察到76條代謝通路，篩選出9條差異最顯著的代謝通路，且主要集中在氨基酸代謝和合成通路，除最主要的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路外，精氨酸和脯氨酸代謝等4條通路皆與谷氨酸密切相關(guān)，而谷氨酸是決定文蛤口感鮮美度最重要的游離氨基酸[23]。近年來在文蛤新品種選育中也發(fā)現(xiàn)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路是傳代過程中主要的代謝通路，隨著選育代次的增加，子代F5的滋味強度明顯強于原代F0[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，蝦蛤混養(yǎng)和文蛤單養(yǎng)對紅文蛤氨基酸代謝有顯著影響，谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、精氨酸均顯著上調(diào)。谷氨酰胺能有效提高機體抗應(yīng)激能力，主要表現(xiàn)在營養(yǎng)代謝、能量供給、抑制病菌和抗氧化等方面[25]。精氨酸作為功能性氨基酸，在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，是最具免疫增強功能的氨基酸[26]。魚類的研究表明，機體內(nèi)精氨酸水平升高能夠促進谷氨酰胺生成，谷氨酰胺又可作為能源物質(zhì)氧化，清除細胞內(nèi)氧化物質(zhì)以保護細胞組分免受氧化損傷[27]。在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的研究中發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸參與了細胞功能尤其是免疫功能的發(fā)揮[28]。天冬氨酸通過脫氨生成草酰乙酸而促進三羧酸循環(huán)，是三羧酸循環(huán)的重要成分。楊創(chuàng)業(yè)[29]研究表明，在海水貝類的三羧酸循環(huán)中，谷氨酸和谷氨酰胺能起到補充作用，并且二者是免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)間的重要信號傳導(dǎo)物質(zhì)。此外，谷氨酸是合成谷胱甘肽所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)氨基配合物，而谷胱甘肽是防御氧化應(yīng)激的重要組分[30]。因此，上述氨基酸及其衍生物的上調(diào)可能也說明了其在紅文蛤免疫和抗氧化能力方面發(fā)揮了作用，推測蝦蛤混養(yǎng)池塘有助于紅文蛤氨基酸的積累，提高紅文蛤的免疫和抗氧化狀態(tài)，其原因可能有以下兩點：一是在混養(yǎng)模式中，單細胞藻類數(shù)量充足、藻相復(fù)雜，能夠給紅文蛤提供相對充足的營養(yǎng)；二是紅文蛤在躲避蝦類擾動的過程中，代謝旺盛，免疫力增強。關(guān)于混養(yǎng)模式對紅文蛤生理的其他積極影響，后續(xù)還需結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏基因組分析進一步驗證。

4 結(jié)論

在單養(yǎng)和蝦蛤混養(yǎng)兩種養(yǎng)殖模式下，紅文蛤的代謝產(chǎn)物存在差異，其中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等氨基酸及其衍生物是主要的差異代謝物。氨基酸測定結(jié)果也驗證了兩種養(yǎng)殖模式的氨基酸差異，蝦蛤混養(yǎng)組的天冬氨酸和谷氨酸這兩種鮮味氨基酸要顯著高于單養(yǎng)組，這與代謝組中主要差異代謝物結(jié)果一致。本研究為后續(xù)進一步研究紅文蛤養(yǎng)殖品質(zhì)差異及開發(fā)利用養(yǎng)殖模式提供了參考。