賀心茹，何舒懷，龍鳳英，李英杰，胡 蝶，費永俊

（1.長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.浙江五洲工程項目管理有限公司，浙江 杭州 310000）

南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei為紅豆杉科Taxaceae 紅豆杉屬Taxus的常綠喬木，是中國特有的白堊紀(jì)孑遺植物，在我國長江流域及臺灣等山地或溪谷地帶間斷分布[1]。其樹形優(yōu)美、材質(zhì)堅硬、含高效抗癌物質(zhì)紫杉醇，是集觀賞、材用和藥用的綜合植物資源[2]。南方紅豆杉花單性，雌雄異株，天然群落中雌雄樹比例懸殊（大致為1︰9），花期不遇，自然更新困難[3]；且由于氣候變化、生境破壞及人為干擾等原因，野生資源已處于瀕危狀態(tài)，被列為我國Ⅰ級保護植物，并被《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）收錄?，F(xiàn)階段，以南方紅豆杉為研究對象進行的相關(guān)試驗主要集中在種子萌發(fā)、苗木繁育、紫杉醇含量及合成途徑、群落特征與種群結(jié)構(gòu)、種群遺傳多樣性、瀕危機制等方面[4-8]。費永俊等發(fā)表的保康紅豆杉Taxus chinensisf.baokangsis與原變種南方紅豆杉主要區(qū)別在于其雄株上有部分枝條發(fā)育成雌性枝條或雌雄球花在同一果枝上，呈現(xiàn)雌雄同株現(xiàn)象[9]，這種由雌雄異株到雌雄同株的進化方式較為特殊[10-11]。

植物性別分化是有性繁殖中一個較為普遍的現(xiàn)象，因受到遺傳因子與環(huán)境的影響，具復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，目前的研究主要集中在白麥瓶草Silene latifolia、玉米Zea mays和黃瓜Cucumis sativus等模式植物，裸子植物涉及較少。本研究以保康紅豆杉和南方紅豆杉為研究對象，通過研究不同發(fā)育時期大小孢子葉球形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及內(nèi)源激素的變化，旨在探明?？导t豆杉性別分化的關(guān)鍵時期和激素對花性別分化的影響，為?？导t豆杉性別分化調(diào)控機制的深入研究提供新的理論知識。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗材料采自于長江大學(xué)實習(xí)基地—湖北省監(jiān)利縣潤景園林綠化股份有限公司苗圃基地，位于29°49′N，112°54′E，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。年輻射總量為104～110 kcal/cm2，年日照時數(shù)1 800～2 000 h，年平均氣溫15.9～16.6℃，年無霜期242～263 d，年降水量1 100～1 300 mm。四季分明、光能充足、熱量豐富、雨水充足、無霜期長，水熱同步為植物生長提供了優(yōu)良的條件。

1.2 試驗材料

?？导t豆杉和南方紅豆杉于2012 年引自湖南長沙跳馬紅豆杉基地，2015 年開始開花結(jié)實。采集時為9 年生母樹，胸徑達6～8 cm，樹高約2 m，冠幅為W 0.8 m×E 1.2 m，長勢優(yōu)良。保康紅豆杉大、小孢子葉球分別用Taxus-TD 和Taxus-TX 表示；南方紅豆杉大、小孢子葉球分別用Taxus-D 和Taxus-X 和表示。

1.3 試材取樣及處理

以保康紅豆杉和南方紅豆杉的大、小孢子葉球為試材，從2016 年12 月4 日開始，每隔10 d到湖北省荊州市監(jiān)利縣采集試材，共采集5 次。材料分為兩種采集方式：1）采集帶有一定數(shù)量試材的枝條（為石蠟切片試驗材料），分類標(biāo)記并插至花泥中，帶回實驗室進行后續(xù)處理；2）戶外采好樣品，用蒸餾水沖洗雜物，迅速置于液氮中固定，帶回實驗室后放入超低溫冰箱儲存?zhèn)溆?。在試驗地均選取至少10 株母樹進行試材采樣，并在樹的各個方向采集且混合。

1.4 試驗方法

1.4.1 形態(tài)指標(biāo)的測定

將采集的大、小孢子葉球置于體視顯微鏡（Leica M165C）觀察，描述其形態(tài)特征。

1.4.2 石蠟制片法

將采集的大、小孢子葉球剝?nèi)グ蠓謩e置于70%FAA 固定液中（固定液體積高于材料總體積的20 倍），各個時期的孢子葉球經(jīng)過梯度脫水后用常規(guī)的石蠟切片技術(shù)包埋，Leica RM2235 連續(xù)切片，切片厚度為8 μm，采用番紅—固綠對染法進行染色[12]，中性樹脂封片鏡檢[13-14]。

1.4.3 內(nèi)源激素的測定

選擇母細(xì)胞發(fā)育時期的大、小孢子葉球進行內(nèi)源激素測定，小孢子葉球的采樣時間為2016 年12 月4 日，大孢子葉球的采樣時間為2017 年1 月13 日。采集的樣品采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）[15]分別單獨測定保康紅豆杉和南方紅豆杉大、小孢子葉球脫落酸（ABA）、細(xì)胞分裂素(CTK)、吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA4、GA3）和油菜素內(nèi)酯（BR）7 種內(nèi)源激素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大、小孢子葉球發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征

通過體視顯微鏡觀察了5 個不同分化時期的大、小孢子葉球的發(fā)育形態(tài)特征（圖1）。開始采集時（12 月初），大孢子葉球由多層芽鱗包裹、呈橢球形，與營養(yǎng)芽很難區(qū)分，唯一的區(qū)別在于營養(yǎng)芽頂端呈圓錐形；隨著大孢子葉球的發(fā)育，其珠心、珠被以及珠鱗的發(fā)育，其大孢子葉球的橫徑逐漸增大，與營養(yǎng)芽的區(qū)別也逐漸明顯。小孢子葉球在采集時體積就較生殖芽、營養(yǎng)芽大很多，很容易區(qū)分；小孢子葉球外披苞片，內(nèi)由13～20 個小孢子葉組成，每個小孢子葉包含數(shù)個盾形小孢子囊；隨著小孢子葉球的發(fā)育，其橫徑逐漸增大，于1 月份開始大于縱徑，小孢子葉球也逐漸伸出苞片，裸露在空氣中，其顏色逐漸從嫩綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色。在12 月份至次年的1 月份，通過比較同一時期的大、小孢子葉球，發(fā)現(xiàn)小孢子葉球的形態(tài)發(fā)育較大孢子葉球快。

圖1 不同分化時期大、小孢子葉球的形態(tài)變化Fig.1 The morphology structure changes of ovulate strobilus and microstrobilus in different differentiation phases

2.2 大、小孢子葉球發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征

12 月初，Taxus-D 的胚珠原基分化完成形成珠心（圖2A—B），Taxus-TD 的胚珠原基正在分化中（圖2F—G）；12 月末，大孢子葉球的珠心中下部出現(xiàn)與周圍明顯不同的造孢細(xì)胞（圖2-C，2-H），其較周圍細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)更為濃密、細(xì)胞核更大；次年1 月，造孢組織中分化出大孢子母細(xì)胞（圖2D—E，I—J）。比較同一時期的Taxus-D和Taxus-TD 可知，Taxus-TD 的發(fā)育相對落后于Taxus-D，但差異不明顯。

12 月初，Taxus-X 中小孢子母細(xì)胞內(nèi)含物豐富且凌亂、染色較深，正處于減數(shù)分裂前期（圖2K）；Taxus-TX 發(fā)育稍滯后，處于小孢子母細(xì)胞成熟期（圖2P）。隨后進行減數(shù)分裂（圖2L，2Q—R），形成四分體（含左右對稱形、四面體形和線形排列方式）；之后進入小孢子游離期（圖2M—N，2S）；次年的1 月中旬，游離小孢子開始生長，表現(xiàn)為細(xì)胞核增大、遷往細(xì)胞中心，隨著細(xì)胞壁的逐漸增厚，花粉粒逐漸成熟（圖2O，2T）。比較同一時期的Taxus-X 和Taxus-TX 可知，Taxus-TX 的發(fā)育相對落后于Taxus-X，但差異不大。

2.3 大、小孢子葉球內(nèi)源激素的含量分析

如圖3 所示，?？导t豆杉和南方紅豆杉大、小孢子葉球的ABA 含量明顯高于其他六種激素含量。比較保康紅豆杉大小孢子葉球和南方紅豆杉大小孢子葉球中的內(nèi)源激素含量可知：在?？导t豆杉大孢子葉球中CTK、IAA、ABA、GA3、MeJA 和BR 的含量均高于小孢子葉球中的含量，GA4的含量低于小孢子葉球中的含量；在南方紅豆杉大孢子葉球中ABA 和BR 含量高于小孢子葉球中的含量，CTK、IAA、GA3、GA4、MeJA 的含量均低于小孢子葉球中的含量。

圖3 大、小孢子葉球內(nèi)源激素的含量分析Fig.3 Analysis of endogenous hormones in ovulate strobilus and microstrobilus

通過比較?？导t豆杉和南方紅豆杉大孢子葉球間、小孢子葉球間的內(nèi)源激素含量發(fā)現(xiàn)：

?？导t豆杉大孢子葉球中CTK、IAA 和MeJA 的含量均高于南方紅豆杉大孢子葉球中的含量，ABA、GA3、GA4和BR 的含量均低于南方紅豆杉大孢子葉球中的含量；?？导t豆杉小孢子葉球中CTK、ABA、MeJA 和BR 的含量均高于南方紅豆杉小孢子葉球中的含量，IAA、GA3和GA4的含量均低于南方紅豆杉小孢子葉球中的含量。

綜上分析可知，?？导t豆杉和南方紅豆杉大孢子葉球中的ABA 和BR 含量均顯著高于小孢子葉球，GA4 含量顯著低于小孢子葉球中的含量，CTK、IAA、GA3和MeJA 在保康紅豆杉大孢子葉球中的含量均高于小孢子葉球，而在南方紅豆杉大孢子葉球中的含量均低于小孢子葉球的含量。CTK 和MeJA 在?？导t豆杉大、小孢子葉球中的含量均高于南方紅豆杉大、小孢子葉球，GA3和GA4的含量均低于南方紅豆杉大、小孢子葉球。IAA 在保康紅豆杉大孢子葉球中的含量高于南方紅豆杉大孢子葉球，而在?？导t豆杉小孢子葉球中的含量低于南方紅豆杉小孢子葉球。

2.4 大、小孢子葉球內(nèi)源激素的相關(guān)性分析

由表1 可知，CTK 與IAA 之間為顯著正相關(guān)（R=0.590*），與MeJA 之間呈極顯著正相關(guān)（R=0.912**），與GA4呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.936；IAA 與ABA 之間存在顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.655*）；ABA 與GA3之間存在顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.629*）；GA3與GA4之間顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.705，與MeJA 之間呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.635*）；GA4與MeJA 之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.932。

表1 大、小孢子葉球內(nèi)源激素的相關(guān)性分析?Table 1 Correlation analysis of endogenous hormones in ovulate strobilus and microstrobilus

3 結(jié)論與討論

3.1 ?？导t豆杉形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究

?？导t豆杉、南方紅豆杉的胚珠單生頂端，與紅豆杉屬其他植物一樣，而區(qū)別于松柏類植物的胚珠側(cè)生，這個結(jié)論與徐剛標(biāo)等的結(jié)論相一致[16]。根據(jù)松杉類的胚珠進化趨勢，一般認(rèn)為胚珠直立較其他類植物原始。保康紅豆杉和南方紅豆杉的大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體的方式與太白紅杉Larix chinensis[17]、云南松Pinus yunnanensis和樟子松Pinus sylvestris[18]相同，都是大孢子母細(xì)胞通過兩次減數(shù)分裂形成4 個大孢子，遠離珠孔的1 個大孢子發(fā)育成功能性大孢子。與歐洲紅豆杉不同，?？导t豆杉和南方紅豆杉都可能形成多個大孢子母細(xì)胞，這也驗證了費永俊等認(rèn)為南方紅豆杉具孤雌生殖的能力[19]，但?？导t豆杉的孤雌生殖暫時還未發(fā)現(xiàn)。?？导t豆杉、南方紅豆杉的每個小孢子葉中小孢子囊數(shù)目基本一致，約4～9 個，與肖玉菲等的結(jié)果相同[25]；兩者的小孢子母細(xì)胞進行減數(shù)分裂形成四分體（包括左右對稱、四面體、線形），在越冬前進入小孢子游離期，次年春季發(fā)育成成熟花粉粒。

?？导t豆杉和南方紅豆杉的大、小孢子葉球發(fā)育正常，同紅豆杉屬其他植物一樣，大孢子葉球的生長發(fā)育比小孢子葉球的慢；大孢子母細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞蘊含大量的遺傳信息，是性別分化的重要步驟，該時期對研究?？导t豆杉雌雄同株變異性狀的機理探究具有重要意義。

3.2 內(nèi)源激素對?？导t豆杉性別決定的影響

大量研究證明植物激素參與了植物性別決定過程[20]，前人研究表明控制性別表達的基因受IAA、ABA、CTK、GA 和MeJA 等植物激素的影響，現(xiàn)有研究主要集中于雌雄異株植物上[21-22]。ABA參與調(diào)控植物花發(fā)育的不同時期，王英等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期棕櫚雌花的ABA 含量一直高于雄花，高水平的ABA 含量更有利于雌花的發(fā)育；盛云燕等[24]在研究與甜瓜的性別分化相關(guān)的植物激素中發(fā)現(xiàn)BR 對黃瓜性別分化具有間接作用；赤霉素在性別分化中被認(rèn)為是一種雄性激素，可促進部分植物的雄性發(fā)育[25]，也有研究結(jié)果表明，GA 具有促進植物雌花性別分化的作用[26]。本研究中，保康紅豆杉和南方紅豆杉的大孢子葉球中的ABA 和BR 含量均高于小孢子葉球中的含量，GA4含量顯著低于小孢子葉球中的含量，與上述研究結(jié)果一致，說明高水平ABA 和BR 含量促進?？导t豆杉和南方紅豆杉的大孢子葉球的發(fā)育，低水平GA4含量促進小孢子葉球發(fā)育。

CTK 在植物的性別表達過程中具有促雌的作用，研究發(fā)現(xiàn)，對大麻噴施一定濃度的細(xì)胞分裂素會出現(xiàn)明顯的促雌作用[27]；IAA具有雌性效應(yīng)，如IAA 對仙人掌[28]促雌的影響，莫長明等[29]在測定羅漢果花芽分化過程中IAA 含量時發(fā)現(xiàn)在雌花分化過程中IAA 含量出現(xiàn)下降趨勢，在雄花芽、兩性花芽分化過程中IAA 含量保持穩(wěn)定，表明IAA可能對羅漢果花性別分化具有重要作用。MeJA 參與植物各種各樣的發(fā)育過程，可以誘導(dǎo)小麥等作物的穎花開放，有研究表明柿雌花中JA 濃度顯著高于雄花，預(yù)示著JA 有助于柿雌蕊的發(fā)育[30]。在本研究中，CTK、IAA、GA3和MeJA 在?？导t豆杉大孢子葉球中的含量均高于小孢子葉球，與上述研究結(jié)果一致，說明CTK、IAA、GA3和MeJA 有助于促進?？导t豆杉大孢子葉球的發(fā)育，而在南方紅豆杉中研究結(jié)果相反，這可能與物種的差異性有關(guān)，后期可以進一步深入研究CTK、IAA、GA3和MeJA 四種激素對?？导t豆杉和南方紅豆杉性別決定的影響。本實驗結(jié)果中，CTK 和MeJA 在?？导t豆杉大、小孢子葉球中的含量均高于南方紅豆杉大、小孢子葉球，GA3和GA4的含量均低于南方紅豆杉大、小孢子葉球，IAA 在?？导t豆杉大孢子葉球中的含量高于南方紅豆杉大孢子葉球，而在?？导t豆杉小孢子葉球中的含量低于南方紅豆杉小孢子葉球，激素在?？导t豆杉和南方紅豆杉大、小孢子葉球中的表達差異可能是由于激素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的差異所引起的，具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)需要進一步深入研究。

本研究從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和內(nèi)源激素的角度為?？导t豆杉性別分化調(diào)控機制提供了新的理論知識，但是這只是單純從生化的角度來分析?？导t豆杉性別分化過程中大小孢子葉球發(fā)育的情況，仍然還需要從分子水平深入研究才能夠進一步揭示?？导t豆杉性別分化的機制。