閆鐘榮，謝承智，宋希強(qiáng)，王洪星

（海南大學(xué) a.海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.林學(xué)院，海南 ?？?570228）

蘭科植物是多年生草本植物，全世界范圍內(nèi)約有750 屬25 000 種，其野生種群主要分布于美國(guó)、智利、阿根廷等國(guó)家的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。蘭花具有花型獨(dú)特、花色艷麗、花香濃郁等特點(diǎn)，是一種重要的觀賞花卉，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。蘭花中一些內(nèi)生菌可促進(jìn)蘭花生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植株抗逆性[2-3]，對(duì)蘭花炭疽病具有生物防治潛力[4]。蘭花花瓣中含有揮發(fā)性物質(zhì)而具有獨(dú)特的香味，其中揮發(fā)性物質(zhì)主要由萜類(lèi)化合物、苯丙酸類(lèi)和脂肪酸衍生物組成，具有防治病原菌侵害、吸引昆蟲(chóng)授粉繁殖等功能[5-6]。與此同時(shí)，蘭花的生長(zhǎng)發(fā)育受到溫度、濕度、病原菌等因素的影響，嚴(yán)重影響其形態(tài)特征、觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-8]。

蘭花生長(zhǎng)過(guò)程中易受到病原菌的侵染，已從感病的蘭花植株中分離并鑒定了57 種病毒[9]，其中以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus,CymMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）危害最顯著[10-11]。CymMV 屬甲型線(xiàn)形病毒科（Alphaflexiviridae）馬鈴薯X 病毒屬（Potexvirus），基因組為ssRNA（約6 200 bp），編碼RNA 指導(dǎo)的RNA 聚合酶、運(yùn)動(dòng)蛋白、外殼蛋白等蛋白質(zhì)，介導(dǎo)病毒的快速?gòu)?fù)制和長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)移[12]。CymMV 外殼蛋白（Coat Protein,CP）基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為672 bp，編碼223 個(gè)氨基酸，在病毒細(xì)胞間和長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[12]。CymMV 可通過(guò)水源灌溉、機(jī)械損傷、交叉接觸、外源輸入等方式進(jìn)行傳播，廣泛分布于美國(guó)、新加坡、韓國(guó)、中國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家和地區(qū)[13-14]。蘭花感染CymMV 后，導(dǎo)致葉和花器官變形與褪色，最終形成壞死的凹斑，嚴(yán)重影響蘭花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。ORSV 屬帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），基因組為ssRNA（約6 618 bp），具有4 個(gè)開(kāi)放閱讀框，且病毒衣殼無(wú)包膜[16]。ORSV 誘導(dǎo)蘭花葉片上形成菱形斑駁或環(huán)斑，同時(shí)誘導(dǎo)花器官變色或形成環(huán)斑[15]。此外，蘭花植株同時(shí)感染上述兩種病毒，可誘發(fā)花棕色壞死條紋出現(xiàn)[10-11]。在新加坡，蘭花CymMV 的感染率高達(dá)54.6%，ORSV 的感染率為4.0%，兩種病毒的復(fù)合侵染率為14.2%[17]。劉福秀等[18]利用ELISA 法調(diào)查了海南島文心蘭感染病毒病情況，研究結(jié)果顯示CymMV 的感染率為77.58%，ORSV 的感染率為16.04%，兩種病毒的復(fù)合侵染率為10.19%。泰國(guó)[19]、中國(guó)臺(tái)灣[20]以及世界其他的一些地區(qū)也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果[21-23]。蘭花病毒分子常用的檢測(cè)方法與技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）、免疫膠體金技術(shù)、免疫毛細(xì)區(qū)帶電泳法（Immuno-Capillary Zone Electrophoresis,I-CZE）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Revers Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）、免疫捕捉PCR 技術(shù)（Immuno-Capture PCR,IC-PCR）、TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（TaqMan realtime quantity RT-PCR）技術(shù)、石英晶體微天平生物傳感器檢測(cè)技術(shù)（Quartz Crystal Microbalance Biosensor,QCM biosensor）、液相色譜-質(zhì)譜分析法（Liquid Chromatography Mass Spectrometry,LCMS）等，但未見(jiàn)小RNA 深度測(cè)序技術(shù)在海南蘭花病毒病分子鑒定中的應(yīng)用[24-26]。

文心蘭Oncidium hybridum屬蘭科Orchidaceae文心蘭屬Oncidium多年生常綠草本植物，具有花期長(zhǎng)、花形優(yōu)美、花色艷麗多樣、觀賞價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，素有“吉祥蘭”的稱(chēng)號(hào)，是世界重要的盆花和切花種類(lèi)之一，也是極具競(jìng)爭(zhēng)力和發(fā)展?jié)摿Φ囊环N高經(jīng)濟(jì)價(jià)值花卉[27-28]。文心蘭生長(zhǎng)過(guò)程中易受到病毒病的侵害，病毒病則顯著影響文心蘭植株的生長(zhǎng)活力、成花時(shí)間、成花品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，進(jìn)而影響文心蘭全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展[29-30]。海南省是文心蘭重要的種植與繁育之地，目前關(guān)于海南省文心蘭主產(chǎn)區(qū)感染病毒的種類(lèi)和數(shù)量尚不清楚，且文心蘭病毒分子水平的系統(tǒng)鑒定尚不完善。因此，本研究以海南省不同區(qū)域種植的文心蘭為試驗(yàn)材料，分析疑似病樣葉片，利用RT-PCR 以及sRNA 深度測(cè)序技術(shù)對(duì)文心蘭病毒進(jìn)行鑒定，明確海南文心蘭病毒病的種類(lèi)和CP 基因的序列特征，建立系統(tǒng)、準(zhǔn)確的海南文心蘭病毒檢測(cè)方法，為海南文心蘭病毒病的鑒定與防治奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 文心蘭葉片采集

根據(jù)海南省文心蘭葉片系統(tǒng)性斑駁、壞死斑、環(huán)斑等病癥，于2020 年12 月和2021 年5 月分別在海南博大蘭花科技有限公司、海南出入境檢驗(yàn)檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心、?？诤ｊP(guān)熱帶植物隔離檢疫中心、樂(lè)東生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司、南龍壽洋休閑觀光農(nóng)業(yè)有限公司、海南省林業(yè)總公司、五指山紅山繽紛花場(chǎng)、五指山萬(wàn)泉園藝有限公司、海南省保亭縣天樂(lè)花卉有限責(zé)任公司、三亞市林業(yè)科學(xué)研究院等企業(yè)單位或文心蘭種植基地以S 形路線(xiàn)采樣，共計(jì)采集178 份樣品（第1次采樣46 份，第2 次采樣132 份）。樣品包括‘黃金三號(hào)’‘黃金二號(hào)’‘檸檬綠8061’‘檸檬綠8060’‘檸檬綠8058’‘NO0008’‘博大一號(hào)’‘劍葉文心’‘散干平白’‘香水文心’‘新奇士文心’‘月光文心’等12 個(gè)品種,每份樣品（葉片）采集重量為100～200 g，除去樣品表面污染物，保鮮袋封裝后于實(shí)驗(yàn)室-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

文心蘭樣品總RNA 提取采用北京華越洋生物公司的“快速通用植物RNA 提取試劑盒3.0”（貨號(hào)0416-50）進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa 公司的“PrimeScript ? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒”（貨號(hào)6110A）進(jìn)行，具體實(shí)驗(yàn)操作方法與步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 病毒的PCR 檢測(cè)

利用GenBank 中已有病毒的基因組序列和已發(fā)表的文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)CymMV、ORSV、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus,BYMV）、辣椒褪綠病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）、蘭花斑點(diǎn)病毒（Orchid fleck virus,ORF）、鳳仙花壞死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus,INSV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和落葵皺紋花葉病毒（Basella rugose mosaic virus,BaRMV）8 種病毒的Coat Protein（CP）基因引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息如表1 所示。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Vazyme,P213-01）12.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，引物對(duì)應(yīng)退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其中電壓為80 V，時(shí)間為30 min。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 海南文心蘭病毒PCR 擴(kuò)增引物名稱(chēng)與序列Table 1 Primers for virus PCR amplification in leaves of Hainan Oncidium hybridum

1.4 CymMV 和ORSV CP 基因的克隆與序列分析

根據(jù)上述設(shè)計(jì)的CymMV 和ORSV CP 基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收產(chǎn)物與pMD-19T vector 進(jìn)行連接（T4 連接酶），然后利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，涂平板并過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板上陽(yáng)性單克隆至滅菌的eppendorf 管中，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar 軟件進(jìn)行CymMV 和ORSV CP 基因序列拼接，同時(shí)利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的BLAST 軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)和分析；利用MEGA-X 軟件，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建基于CP 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 sRNA 深度測(cè)序

將具有明顯褐色斑、壞死斑等病癥且未檢測(cè)到病毒的9 份海南文心蘭葉片樣品混合，利用TRIzol 試劑提取總上述樣品的總RNA（體積為50 μL），同時(shí)對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行如下分析與評(píng)估：1）瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA 的降解程度并評(píng)估其污染程度；2）利用Nanodrop 法檢測(cè)總RNA 的純度（OD260/280比值）；3）利用Qubit法對(duì)總RNA 溶液的濃度進(jìn)行精確定量分析；4）利用Agilent 2100 儀器精確檢測(cè)RNA 的完整性。樣品檢測(cè)合格后，依據(jù)Small RNA 的3′及5′端特殊結(jié)構(gòu)（5′端有完整的磷酸基團(tuán)，3′端有羥基），以提取的總 RNA 為起始樣品，利用Small RNA Sample Pre Kit 直接將Small RNA 兩端加上接頭，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增，利用PAGE 膠分離目標(biāo)DNA 片段，切膠回收得到cDNA 文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0 軟件進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1 ng/μL，然后使用Agilent 2100 儀器對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度（insert size）進(jìn)行檢測(cè)，insert size 符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2 nM），以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進(jìn)行HiSeq/MiSeq 測(cè)序。為了確定引起癥狀的潛在病毒，我們使用NovaseQ6000 系統(tǒng)對(duì)sRNAs 進(jìn)行深度測(cè)序，以FASTQ 格式接收高質(zhì)量的原始讀數(shù)（raw reads）。測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片表型

由圖1 可知，感染不同病毒后，海南文心蘭‘黃金三號(hào)’‘黃金二號(hào)’‘檸檬綠8061’‘檸檬綠8060’‘檸檬綠8058’和‘NO0008’品種葉片整體或局部出現(xiàn)大小不一的褪綠塊狀斑（圖1A—C）或褪綠條紋斑（圖1D—F），‘博大一號(hào)’‘劍葉文心’和‘散干平白’品種的葉片局部呈現(xiàn)黃化的霧狀斑（圖1G—I），‘香水文心’‘新奇士文心’和‘月光文心’品種的葉片表現(xiàn)出明顯的皺縮或畸形和黑色壞色斑癥狀（圖1J—L），表明不同病毒對(duì)海南文心蘭葉片的表面形態(tài)具有重要的影響，且不同品種之間存在明顯差異。

圖1 海南文心蘭葉片感染病毒的表型Fig.1 Symptoms of leaves from Hainan Oncidium hybridum infected with virus

2.2 病毒的分子鑒定

由圖2 可知，在‘黃金三號(hào)’‘檸檬綠8058’‘NO0008’ ‘散干平白’‘香水文心’‘月光文心’‘黃金二號(hào)’和‘檸檬綠8060’葉片中檢測(cè)到CymMV 病毒的CP 基因，約為700 bp；在‘黃金三號(hào)’‘散干平白’‘香水文心’‘新奇士文心’和‘檸檬綠8060’葉片中檢測(cè)到ORSV病毒的CP 基因，約為500 bp，表明不同類(lèi)型的海南文心蘭葉片表型主要由CymMV 和ORSV 病毒的侵染而導(dǎo)致。

圖2 海南文心蘭葉片病毒的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of viruses in leaves of Hainan Oncidium hybridum

2.3 CP 基因的克隆與序列分析

基因測(cè)序結(jié)果顯示，建蘭花葉病毒海南分離物CymMV-HN 的CP 基因全長(zhǎng)為672 bp，編碼223個(gè)氨基酸，其GeneBank登錄號(hào)為MZ662114（圖3A）。CymMV-HN 的CP 基因編碼的氨基酸序列分析結(jié)果顯示，氨基酸的F87S 和N29D 位點(diǎn)發(fā)生突變，剩余氨基酸則完全相同，表明海南文心蘭CymMV-HN 的CP 基因在進(jìn)化中相對(duì)比較保守（圖4A）。與已報(bào)道CymMV 的CP 基因序列進(jìn)行比較，海南分離物CymMV-HN 的CP 基因序列與巴西分離物CymMV-PHALAEN-ATIBAIA 的CP 基因序列（KX960734.1）同源性為97.47%，與中國(guó)廣東分離物CymMV-LZ14的CP基因序列（KP137370.1）和中國(guó)河南分離物CymMV-CHN-HNZZ01 的CP基因序列（KU873000.1）同源性分別為97.32%和97.17%，表明海南文心蘭CymMV 的CP 基因在進(jìn)化過(guò)程中十分保守（圖5A）。

齒蘭環(huán)斑病毒海南分離物ORSV-HN 的CP 基因全長(zhǎng)為477 bp，編碼158 個(gè)氨基酸，其GeneBank 登錄號(hào)為MZ662115（圖3B）。ORSV-HN 的CP 基因編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的新加坡分離物ORSV-Singapore 的CP 基因序列（AF404777.1）、韓國(guó)分離物ORSV-ONK1的CP 基 因 序 列（AB541505.1 和AB541487.1）的序列完全相同（圖4B）。與此同時(shí)，海南文心蘭ORSV-HN 的CP 基因序列與新加坡分離物ORSV-Singapore 的CP 基因序列（AF406777.1）的同源性為99.37%，與韓國(guó)分離物ORSV-ONK1和ORSV-CYK1 的CP 基因序列（AB541505.1 和AB541487.1）的同源性均為99.16%，表明海南文心蘭ORSV 的CP 基因在進(jìn)化過(guò)程中同樣十分保守（圖5B）。

圖3 CymMV-HN（A）和ORSV-HN（B）CP 基因核酸與氨基酸序列分析Fig.3 Analysis of nucleotides and amino acid sequences of CP genes of CymMV-HN (A) and ORSV-HN (B)

圖4 CymMV-HN (A)和ORSV-HN (B) CP 氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of CP protein amino acid sequences of CymMV-HN (A) and ORSV-HN (B)

圖5 基于CymMV-HN (A)和ORSV-HN (B) CP 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on CP gene sequences of CymMV-HN (A) and ORSV-HN (B)

2.4 sRNA 深度測(cè)序分析

海南文心蘭葉片樣品進(jìn)行sRNA 深度測(cè)序共獲得26 976 941 條raw reads，質(zhì)控后得到26 039 391條clean reads。植物感染病毒后富集的病毒siRNAs 長(zhǎng)度主要為21-nt，22-nt 和24-nt 三種類(lèi)型。在海南文心蘭葉片sRNA 深度測(cè)序后質(zhì)控的clean reads 分析結(jié)果顯示，24-nt 長(zhǎng)度的sRNA 序列數(shù)量最多，占比為35.42%，其次是21-nt 和22-nt，分別占比為25.01%和15.06%（圖6A）。利用bowtie 軟件將sRNA 數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，在GenBank Virus RefSeq 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到94 780 條reads，其中21-nt 長(zhǎng)度的sRNA 序列數(shù)量最多，占比為23.08%，其次是18-nt 長(zhǎng)度的序列，占比為15.73%（圖6B）。通過(guò)velvet 軟件，篩選18～26 nt的序列進(jìn)行拼接組裝，獲得1 256 個(gè)contigs，其中長(zhǎng)度為50～100 bp 的contigs 最多，為1 078 個(gè)，500～1 000 bp 最少，僅有1 個(gè)（圖6C）。利用Blast 算法，采用參數(shù)限制e-value（1e-6 for BLASTN,1e-4 for BLASTX），對(duì)1256個(gè)contigs 進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)贜CBI Nr（NCBI nonredundant protein sequences）、NCBI Nt（NCBI non-redundant nucleotide sequences）、GenBank Virus RefSeq Nucletide、GenBank Virus RefSeq Protein 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到211、518、111 和112個(gè)contigs，共同注釋到66 個(gè)contigs（圖6D）。從分類(lèi)注釋結(jié)果中，分離病毒相關(guān)的contigs 注釋信息，在CymMV 和ORSV 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到56 和39 個(gè)contigs，表明海南文心蘭葉片感病表型是由上述兩種病毒侵染而導(dǎo)致，此結(jié)果與PCR 鑒定結(jié)果相一致（表2）。

圖6 海南文心蘭葉片樣品sRNA 深度測(cè)序結(jié)果分析Fig.6 Analysis of small RNA deep sequencing results in leaf samples of Hainan Oncidium hybridum

表2 利用sRNA 深度測(cè)序分析海南文心蘭CyMV 和ORSV 病毒的種、科、屬Table 2 Analysis of virus species, families and genus of CymMV and ORSV by small RNA deep sequencing in leaf samples of Hainan Oncidium hybridum

3 討 論

文心蘭是一種常綠觀賞草本植物，其生長(zhǎng)過(guò)程中易受到病毒的侵染，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蘭花感染CymMV 或ORSV 后，表現(xiàn)為環(huán)斑、壞死斑、褪綠條紋、灰白斑等癥狀[1]，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)矮小、花小不艷、花期縮短[14]，已在蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）、南茜文心蘭（OncidiumGower Ramsey）、建 蘭（Cymbidium ensifolium）等品種進(jìn)行了分離和鑒定[25,31]。本文研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地和品種的海南文心蘭感染病毒后，葉片呈現(xiàn)褪綠狀斑或條紋、黃化霧狀斑、皺縮、黑色壞色斑等癥狀，表明海南文心蘭受到不同類(lèi)型的病毒侵染（圖1）。與此同時(shí)，利用RT-PCR 技術(shù)在采集的海南文心蘭病樣中僅檢測(cè)到CymMV 或ORSV，且同時(shí)在‘黃金三號(hào)’‘散干平白’‘香水文心’‘新奇士文心’和‘檸檬綠8060’樣品中檢測(cè)到了CymMV 和ORSV，表明CymMV 和ORSV 是導(dǎo)致海南文心蘭感病的主要病毒類(lèi)型，這與吳偉文等的研究結(jié)果相一致（圖2）[25]。已有的研究結(jié)果顯示，在福建[27]、廣東[28]、臺(tái)灣[17]、云南[18-19]等地栽培的文心蘭病樣組織中分別檢測(cè)到CymMV、ORSV、BYMV、CaCV、CMV 和INSV，而在海南文心蘭葉片病樣中未檢測(cè)到CymMV 和ORSV 以外的其他病毒，說(shuō)明CymMV 和ORSV 是海南文心蘭感病的主要病毒因子。

CP 蛋白是文心蘭病毒的一種重要蛋白質(zhì)，其核酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性，在病毒細(xì)胞間和長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[12]。已從卡特蘭Cattleya hybida[13]和建蘭[32]病樣組織中分離并鑒定了CymMV 和ORSV 的CP 基因，其核酸序列長(zhǎng)度分別為672 和477 bp，編碼223 和158 個(gè)氨基酸。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CymMV-HN和ORSV-HN CP 基因的核酸序列長(zhǎng)度分別為672和477 bp，分別編碼223 和158 個(gè)氨基酸，這與羅金水的研究結(jié)果相一致[32]。海南文心蘭CymMV－HN 和ORSV-HN CP 基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，它們與巴西和新加坡分離到的CymMV 和ORSV 的CP 基因核酸序列具有較高的同源性，且沒(méi)有明顯的差異，表明海南文心蘭CymMV 和ORSV 的CP基因序列具有較高的保守性（圖2～5）。

植物細(xì)胞內(nèi)sRNA 序列經(jīng)過(guò)Dicer 酶的催化形成微 RNA（miRNA）和小干擾 RNA（siRNA），然后被裝載到Argonaute（AGO）蛋白家族上，引導(dǎo)產(chǎn)生RNAi 沉默復(fù)合體到互補(bǔ)的靶RNA 或DNA 鏈上，在生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)、DAN 修復(fù)、病毒防御、生物和非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[33-34]。病原菌的基因組（ssRNA 和dsRNA）在感染植物后可以整合到植物基因組中，經(jīng)過(guò)剪切作用產(chǎn)生miRNA 和siRNA，在病原菌復(fù)制、轉(zhuǎn)移、毒害等方面發(fā)揮著重要作用[35-36]。因此，對(duì)植物中sRNA 群體進(jìn)行深度高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，可以將給定樣本進(jìn)行通用病毒檢測(cè)和完整的病毒基因組重建[35]。利用sRNA深度測(cè)序技術(shù)對(duì)海南文心蘭葉片病樣進(jìn)行分析，海南文心蘭葉片病樣質(zhì)控后得到26 039 391 條clean reads，其中24-nt 的sRNAs 含量最豐富，其次是21-nt 和22-nt 長(zhǎng)度的sRNA。海南文心蘭葉片clean reads 拼接后獲得1 256 個(gè)Contigs，在Nr 等4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共同注釋到66 個(gè)Contigs，在CymMV 和ORSV 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到56和39 個(gè)Contigs，表明海南文心蘭葉片病癥主要由CymMV 和ORSV 侵染而導(dǎo)致，這與上述的分子鑒定結(jié)果相一致（圖2 和圖6）。本文建立了海南文心蘭病毒病系統(tǒng)、科學(xué)的鑒定體系，但CymMV和ORSV 侵染海南文心蘭的分子機(jī)制及致病機(jī)理尚不清楚，需利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和RNA 組學(xué)等技術(shù)開(kāi)展研究。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)海南?？?、文昌、樂(lè)東、三亞等地區(qū)的文心蘭進(jìn)行檢查，感病葉片呈現(xiàn)褪綠塊狀斑、褪綠條紋斑、黃化霧狀斑、黑色壞色斑、皺縮或畸形癥狀，表明病毒侵染影響海南文心蘭的生長(zhǎng)發(fā)育；利用RT-PCR 技術(shù)在海南文心蘭葉片病樣組織中檢測(cè)到CymMV 和ORSV，且CP 基因序列具有較高的保守性，表明CymMV 和ORSV 是導(dǎo)致其感病的主要病毒類(lèi)型；利用sRNA 深度測(cè)序技術(shù)分析海南文心蘭葉片組織中sRNA 的類(lèi)型與豐度，質(zhì)控后拼接獲得1 256 個(gè)contigs，在Nr等數(shù)據(jù)庫(kù)中共注釋到66 個(gè)contigs，在CymMV和ORSV 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到56 和39 個(gè)Contigs，表明CymMV 和ORSV 是海南文心蘭染病的主要因素。與此同時(shí)，本研究建立了系統(tǒng)、快速鑒定海南文心蘭CymMV 和ORSV 病毒的檢測(cè)方法，為海南文心蘭病毒病的診斷與防治提供了技術(shù)體系與理論依據(jù)。