高曉磊，張麗仔，唐 窈，鄒 鋒，熊 歡，朱景樂，唐 駿

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，河南 鄭州，450003；3.國有信陽市平橋區(qū)天目山林場(chǎng)，河南 信陽 464194）

栓皮櫟Quercus variabilis是殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus落葉喬木，是重要的珍貴用材樹種，是我國軟木、栲膠的重要來源[1]。栓皮櫟在我國分布廣泛，北起遼寧省南至云南省均有分布，在涵養(yǎng)水源、保持水土和維持生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[2]。然而由于長(zhǎng)期的亂砍濫伐和生境破壞，栓皮櫟林的數(shù)量和質(zhì)量不斷下降，嚴(yán)重影響到我國軟木、栲膠等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益受損嚴(yán)重[3]。栓皮櫟育苗方式為圃地播種，移栽造林過程中起苗易傷根，在丘陵山地造林實(shí)踐中，存在苗木側(cè)根稀少造成的苗木成活率低、生長(zhǎng)不良等問題，嚴(yán)重阻礙了栓皮櫟的造林進(jìn)程。栓皮櫟是外生菌根（Ectomycorrhiza,ECM）宿主植物，目前菌根化育苗技術(shù)被認(rèn)為是提高苗木造林成活率的有效措施，在苗木培育、植樹造林等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物激素調(diào)控著根系發(fā)育，其中生長(zhǎng)素起主導(dǎo)作用[4]，生長(zhǎng)素等內(nèi)源激素在根尖的積累和梯度分布誘導(dǎo)了宿主植物菌根的發(fā)育，從而改變了宿主植物的根系構(gòu)型[5]。在經(jīng)過接菌處理的福鼎大白茶Camellia sinensis ‘Fudingdabaicha’、蘋果Malus pumila、番茄Lycopersicon esculentum等植株根系內(nèi)均出現(xiàn)了IAA 和GA3等激素含量的增加以及根系的擴(kuò)張[6-8]。接菌增強(qiáng)了植株對(duì)水分及養(yǎng)分的吸收能力，進(jìn)而對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)有著良好的促進(jìn)作用[9,10]，Segnitz 等[11]也報(bào)道了ECM 對(duì)植物根系吸收土壤養(yǎng)分及生長(zhǎng)的積極影響。Makita 等[12]對(duì)日本枹櫟Q.serrata進(jìn)行接菌處理，研究結(jié)果顯示，ECM 可以通過調(diào)節(jié)植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收來改變植物的形態(tài)特征，使枹櫟的比根長(zhǎng)增大，擴(kuò)大根系的吸收范圍。

光合作用是綠色植物重要的生理過程，植物的光合特性一定程度上能夠反映植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)情況[13]，植物葉片發(fā)出的葉綠素?zé)晒庑盘?hào)反映了植株的光合作用信息，可以利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)研究植株光合作用的真實(shí)狀況[14]。在對(duì)接菌植物光合特性的研究中發(fā)現(xiàn)，ECM 真菌接種能夠顯著提高葉片的凈光合速率和水分利用效率，Martins 等[15]報(bào)道稱菌根真菌促進(jìn)了歐洲栗Castanea sativa葉片的凈光合速率提升；高悅等[16]也對(duì)華美牛肝菌Boletus speciosus、彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius等外生菌根真菌接種的馬尾松Pinus massoniana、濕地松P.elliottii和黑松P.thunbergii幼苗的葉綠素含量及其主要葉綠素?zé)晒鈪?shù)（ФPS Ⅱ和ETR）進(jìn)行了研究。目前菌根化育苗技術(shù)在世界已有廣泛應(yīng)用，在栓皮櫟領(lǐng)域，劉現(xiàn)剛等[17]研究了接種綿毛絲膜菌Cortinarius sublanatus和美味牛肝菌B.edulis對(duì)北京種源栓皮櫟幼苗光合生理和氣體交換特征的影響，而關(guān)于外生菌根對(duì)不同種源栓皮櫟生長(zhǎng)及生理影響的研究尚少見報(bào)道。

硬皮馬勃Sclerodermasp.是一類常見的菌根真菌，與殼斗科植物普遍共生。本研究以北京和河南種源的栓皮櫟為試材開展硬皮馬勃接種盆栽試驗(yàn)，比較分析了不同處理栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合參數(shù)、根尖內(nèi)源激素含量的差異，旨在闡明ECM 真菌對(duì)不同種源栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)和生理特征的影響，以期為探索主要造林樹種的菌根應(yīng)用技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖南省長(zhǎng)沙市中南林業(yè)科技大學(xué)苗圃（112°59′32″E，28°08′12″N）。試驗(yàn)地海拔92 m，年平均氣溫17.2℃，年降水量為1 200～1 400 mm，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，氣候溫和，降水充沛，雨熱同期，該地區(qū)母巖為典型的第四紀(jì)網(wǎng)紋紅壤，風(fēng)化程度較深，區(qū)內(nèi)土壤為低酸性土壤或中性土壤，適宜植物及菌根真菌生長(zhǎng)，地帶性植被為常綠闊葉林。

1.2 試驗(yàn)材料制備

1.2.1 菌劑制備

從湖南省瀏陽市板栗人工林采集子實(shí)體后，進(jìn)行分離純化，經(jīng)分子鑒定為硬皮馬勃，簡(jiǎn)稱Sc[18]。于MMN 培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，然后用不含瓊脂的MMN 培養(yǎng)基做液體培養(yǎng)，最后在草炭和蛭石2∶1 混合的基質(zhì)上擴(kuò)大培養(yǎng)，得到固體菌劑[19]。

1.2.2 播種

于2019 年3 月中旬進(jìn)行播種，將黃心土∶泥炭按照體積分?jǐn)?shù)2∶1 混合作為容器育苗基質(zhì)，經(jīng)過37%的甲醛消毒處理，通風(fēng)陰干后分裝入口徑20 cm，高22 cm 的塑料容器中，將北京（BJ）和河南（HN）種源栓皮櫟種子經(jīng)0.5%的KMnO4溶液浸泡2 h，用清水洗凈陰干后進(jìn)行播種。BJ 和HN 種源各播種150 盆，每盆播種一粒種子，2 周后，發(fā)芽率分別為89.33%和92.67%，選取出苗時(shí)期、苗高、地徑相對(duì)一致的幼苗作為試驗(yàn)材料。

1.2.3 接種

本試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)置北京種源-接菌（BJ-Sc）、河南種源-接菌（HN-Sc）、北京種源-不接菌（BJ-CK）、河南種源-不接菌（HN-CK）等4 個(gè)處理，3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 株，共240 株。待栓皮櫟苗長(zhǎng)出2～3 片真葉，在幼苗周圍挖5 cm 深的孔洞，將硬皮馬勃固體菌劑施入其中并覆土，每株幼苗接種5 g 固體菌劑，對(duì)照施入不含菌劑的基質(zhì)（CK）。各處理擺放間距0.5 m以上，以防止相互侵染。育苗期間正常澆水管理。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.3.1 苗高、地徑測(cè)量

5 月7 日至7 月7 日（每隔10 d）、9 月5 日、11 月14 日觀測(cè)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)情況，使用卷尺測(cè)量苗高（cm），使用游標(biāo)卡尺測(cè)量地徑（mm）。

1.3.2 外生菌根形態(tài)觀察

每個(gè)處理隨機(jī)抽取3 株幼苗，取其根系浸泡在水中，洗去浮土，剪成5 cm 長(zhǎng)的根段，將根段放入含有少量水的表面皿中，置于OLYMPUS SZX16 體視顯微鏡下觀察其菌根形態(tài)[20]。

1.3.3 石蠟切片

將菌根根尖在Carnoy 固定液中抽氣10 h，完全排除材料中的空氣，置于70%的酒精溶液中，4℃下儲(chǔ)存。對(duì)固定的材料進(jìn)行適當(dāng)修整，并使用6 種濃度酒精進(jìn)行脫水，用二甲苯使樣品透明，嵌入石蠟中，然后用石蠟切片機(jī)（徠卡RM2235，德國海德堡）切片，厚度為10 μm。用1%番紅染色，制作封片，并使用顯微鏡（德國海德堡徠卡DM2500）獲取照片[18]。

1.3.4 細(xì)根生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

將上述根系經(jīng)掃描儀EPSON V7000 掃描成圖片，利用根系分析軟件分析直徑為0～2 mm 的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積、根體積等指標(biāo)[21]。

1.3.5 葉片SPAD 值測(cè)定

SPAD 值代表葉綠素相對(duì)含量，其與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，能夠有效反映葉綠素的水平。每個(gè)處理隨機(jī)選取3 株幼苗，使用便攜式SPAD-502 Plus 葉綠素儀測(cè)定葉綠素含量，每株幼苗選擇同一葉位、無病蟲害的成熟葉片，測(cè)定3次，記錄數(shù)據(jù)[22]。

1.3.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

于8 月下旬晴朗天氣的上午，每個(gè)處理隨機(jī)選取3 株幼苗，選擇生長(zhǎng)一致且受光方向相同的葉片，采用英國Hansatech 公司生產(chǎn)的FMS2 型脈沖調(diào)制熒光儀，參照馮玉龍等[23]的方法，測(cè)定光系統(tǒng)Ⅱ（PS Ⅱ）最大光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）、PS Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率（ФPS Ⅱ）及電子傳遞速率（ETR）。

1.3.7 光合參數(shù)的測(cè)定

對(duì)于上述幼苗，于晴朗天氣上午10:00，選擇同一葉位葉片（從頂端數(shù)第5 片功能葉），使用Li-6400 便攜式光合儀測(cè)定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）及蒸騰速率（Tr），并計(jì)算水分利用率（WUE）：水分利用率（WUE）=凈光合速率（Pn）/蒸騰速率（Tr）[17]。

1.3.8 根系內(nèi)源激素含量測(cè)定

取上述幼苗的根尖，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒測(cè)定玉米素核苷（ZR）、生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）含量[24]，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2018 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 13.0 軟件實(shí)現(xiàn)方差分析及LSD 多重比較，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種硬皮馬勃的菌根形成情況

在體視顯微鏡下可見接種Sc 的栓皮櫟幼苗根系出現(xiàn)黃白色短棒狀菌根，白色絮狀菌絲（圖1A—B）。對(duì)菌根橫截面進(jìn)行切片觀察，可見與正常根相比，菌根的表皮細(xì)胞外覆蓋有一層致密的菌套（Mantle），哈氏網(wǎng)（Hartig net）延伸至表皮和皮層細(xì)胞間（圖1C—D）。硬皮馬勃與栓皮櫟的親和性較強(qiáng)，接菌后60 d，BJ 和HN 幼苗的菌根侵染率分別為43.33%和45.00%；接菌后90 d，達(dá)到76.67%和81.33%；接菌120 d 時(shí)，兩個(gè)種源幼苗的菌根侵染率均超過90%，CK 組菌根侵染率為0（圖1E）。

圖1 栓皮櫟幼苗菌根形態(tài)特征及侵染率Fig.1 Morphological characteristics and colonization rate of mycorrhiza in Q.variabilis seedlings

2.2 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響

接種硬皮馬勃處理的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)明顯優(yōu)于未接菌幼苗。如圖2 所示，5 月8 日—6 月27 日（接菌后10～60 d），幼苗生長(zhǎng)速率較高；6 月27 日接菌處理與對(duì)照間幼苗高和地徑出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；6 月27 日—7 月7 日（接菌后60～70 d），菌根苗仍維持較高生長(zhǎng)速率，對(duì)照的幼苗生長(zhǎng)速率明顯減緩；11 月4 日（接菌后190 d），接菌的BJ、HN 栓皮櫟苗高分別為37.02 和37.69 cm，與相應(yīng)對(duì)照相比，增幅分別達(dá)到19.5%和18.9%，2 個(gè)種源栓皮櫟菌根苗地徑分別為4.55 和4.60 mm，較相應(yīng)對(duì)照高14.9%和14.4%，表明接種硬皮馬勃能夠顯著促進(jìn)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)。

圖2 不同處理的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)Fig.2 Growth dynamics of the Q.variabilis seedlings under different treatments

2.3 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗根系形態(tài)的影響

由表1 可見，接種硬皮馬勃的BJ、HN 栓皮櫟幼苗細(xì)根根長(zhǎng)分別比相應(yīng)對(duì)照高166.9%和97.6%，根表面積高163.4%和83.5%，根體積高127.7%和64.6%，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明接種硬皮馬勃能夠顯著促進(jìn)栓皮櫟幼苗細(xì)根的生長(zhǎng)；兩個(gè)種源間未接菌幼苗的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積及根體積無顯著差異，BJ 菌根苗的細(xì)根根長(zhǎng)、根表面積及根體積顯著高于HN 菌根苗。

2.4 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)和SPAD 值的影響

接種硬皮馬勃顯著提高了HN 栓皮櫟葉片的實(shí)際光化學(xué)效率（ФPS Ⅱ）和PS Ⅱ電子傳遞速率（ETR），對(duì)光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）的影響不顯著。與對(duì)照相比，ФPS Ⅱ和ETR 分別提高了53.6%和62.3%。然而，接種硬皮馬勃對(duì)BJ 栓皮櫟幼苗的葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)無顯著影響。接種硬皮馬勃顯著提高了BJ 和HN 栓皮櫟幼苗葉片SPAD 值，增幅分別為13.9%和15.4%。BJ 和HN 間未接菌栓皮櫟幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)及SPAD 值均無顯著差異。

2.5 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟幼苗光合參數(shù)的影響

接種硬皮馬勃顯著提高了BJ 和HN 栓皮櫟幼苗葉片的凈光合速率（Pn）（表3）。兩個(gè)種源的凈光合速率分別比相應(yīng)對(duì)照高40.2%和74.5%，Pn大小順序?yàn)镠N-Sc ＞BJ-Sc ＞BJ-CK ＞HN-CK。HN 菌根苗葉片氣孔導(dǎo)度（Gs）及蒸騰速率（Tr）顯著高于CK。接菌處理對(duì)兩個(gè)種源幼苗葉片的胞間CO2濃度（Ci）及水分利用效率（WUE）均無顯著影響。兩個(gè)種源間菌根苗葉片的Pn、Gs、Ci及WUE 無顯著差異，其未接菌栓皮櫟幼苗葉片的Pn、Gs、Ci亦無顯著差異，HN 的未接菌栓皮櫟幼苗葉片的Tr值顯著低于BJ 種源。

表2 不同處理的葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及SPAD 值比較Table 2 Comparison of the chlorophyll fluorescence parameters and SPAD values of leaves under different treatments

表3 不同處理的栓皮櫟葉片光合參數(shù)比較Table 3 Comparison of the photosynthetic parameters of the Q.variabilis leaves under different treatments

2.6 接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟根尖內(nèi)源激素含量影響

BJ-Sc 的根尖IAA 含量為99.8 ng·g-1，較CK顯著提升12.1%，ABA 含量為96.64 ng·g-1，較CK顯著增加12.2%。HN-Sc 的根尖IAA 和ABA 的含量也顯著高于相應(yīng)的未接菌苗，增幅分別為15.3%和17.4%（P＜0.05）（表4）。接種硬皮馬勃對(duì)兩個(gè)種源栓皮櫟幼苗根尖的GA3及ZR 含量均無顯著影響，HN-Sc 的IAA 和ZR 含量顯著高于BJSc。兩個(gè)種源間未接菌幼苗根尖的各激素含量無顯著差異。

表4 不同處理的栓皮櫟根尖內(nèi)源激素含量比較Table 4 Comparison of the endogenous hormone content of Q.variabilis root tips under different treatments

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

植物內(nèi)源激素在調(diào)節(jié)根系生理活動(dòng)方面起著非常重要的作用，報(bào)道顯示，外生菌根真菌能夠誘導(dǎo)植物根尖激素的積累進(jìn)而促進(jìn)細(xì)根的形成[25]。本研究中，Sc 接種處理的BJ 及HN 栓皮櫟幼苗根系內(nèi)IAA 及ABA 含量顯著高于未接種處理。細(xì)根是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官[22]，試驗(yàn)中接種Sc 能夠增加栓皮櫟幼苗的細(xì)根長(zhǎng)度、表面積和體積，擴(kuò)大根系的吸收范圍，且對(duì)北京種源栓皮櫟幼苗根系的促生效果更好。祁金玉等[26]亦研究證明，接種外生菌根真菌褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）能促進(jìn)油松（P.tabuliformis）根系構(gòu)型擴(kuò)張。說明ECM 真菌侵染宿主植物根系后，能夠影響宿主植物內(nèi)源激素含量并改變其平衡狀況，促進(jìn)細(xì)根生長(zhǎng)，進(jìn)而能夠更好地適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)抗逆能力。

更進(jìn)一步而言，根系的擴(kuò)張促進(jìn)了植株對(duì)土壤水分、養(yǎng)分及礦質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而影響葉片光合作用[27]。植物葉片的SPAD 值與葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量間均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系[28]，本研究中，菌根苗葉片SPAD 值較對(duì)照高14%以上，反映了接菌能夠增加栓皮櫟葉片的葉綠素含量，這一結(jié)論與徐洪文等[29]證實(shí)接種菌根真菌能夠顯著提高玉米（Zea mays）葉片SPAD 值的結(jié)果一致，這可能是由于接菌促進(jìn)了根系對(duì)N、Mg 等營養(yǎng)元素的吸收[30]，為葉綠素的合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，硬皮馬勃的接種顯著提高了HN栓皮櫟的實(shí)際光化學(xué)效率和PS Ⅱ電子傳遞速率，顯著提升了BJ 和HN 栓皮櫟葉片的凈光合速率，HN-Sc 處理的Pn值最高，達(dá)到7.17 μmol·m-2·s-1，氣孔導(dǎo)度也顯著大于對(duì)照，而細(xì)胞間CO2濃度無顯著差異，說明接菌導(dǎo)致凈光合速率的提升是由非氣孔因素引起的。綜合SPAD、ФPS Ⅱ、ETR、Pn的變化，可以認(rèn)為，接種Sc 能夠提升葉綠素含量，光合色素吸收光能的增加進(jìn)而促進(jìn)了光合電子的傳遞，增強(qiáng)了PS Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)活性，提高了葉片凈光合速率。

植株根系吸收能力及葉片光合速率的增強(qiáng)，共同促進(jìn)了植株地上部分的生長(zhǎng)[31]。栓皮櫟接種Sc 后，苗高、地徑得到了顯著提高，接種后190d，接菌的BJ 和HN 栓皮櫟苗高分別較對(duì)照提高19.5%和18.9%，地徑分別較對(duì)照提高14.9%和14.4%，表明ECM 真菌能極大促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，與閻秀峰等[32]發(fā)現(xiàn)接種鉚釘菇（Gomphidius viscidus）和臭紅菇（Russula foetens）能夠促進(jìn)遼東櫟（Q.wutaishanica）生長(zhǎng)的結(jié)果相似。7 月，接菌處理和對(duì)照的栓皮櫟幼苗生長(zhǎng)速率均有不同程度的減緩（圖2），可能是由于夏季高溫，栓皮櫟幼苗正值種子供給營養(yǎng)與葉片光合供給營養(yǎng)的轉(zhuǎn)換期，在夏季生長(zhǎng)緩慢[33]。BJ 和HN 栓皮櫟未接菌幼苗的蒸騰速率（Tr）及水分利用效率（WUE）出現(xiàn)顯著差異，且Sc 對(duì)兩個(gè)種源栓皮櫟幼苗的根系和光合作用促進(jìn)程度不同，可能是由于不同種源栓皮櫟在不同生境下的適應(yīng)性及對(duì)硬皮馬勃的親和性不同。

3.2 結(jié) 論

綜上研究結(jié)果，接種硬皮馬勃能夠顯著增加北京及河南種源栓皮櫟幼苗根尖內(nèi)IAA 及ABA 含量，促進(jìn)細(xì)根生長(zhǎng)，并進(jìn)一步提高栓皮櫟葉片的SPAD 值，改善葉片光能利用效率，顯著提高幼苗葉片凈光合速率，促進(jìn)栓皮櫟幼苗的生長(zhǎng)。接種硬皮馬勃對(duì)栓皮櫟生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著，且對(duì)北京栓皮櫟的根系促生作用優(yōu)于河南，對(duì)河南栓皮櫟的光合作用促進(jìn)效果優(yōu)于北京。