夏廣英， 高庚渠

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學院，河南平頂山 467000)

由于集約化農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展和土壤地質(zhì)高背景，農(nóng)業(yè)土壤中重金屬污染程度日益嚴重，其中鎘(Cd)污染是脅迫農(nóng)田健康的主要重金屬之一[1]。鎘(Cd)具有高移動性和高毒害性等特征，可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構成嚴重威脅，同時通過食物鏈進一步威脅牲畜和人類健康，因此迫切需要采用生態(tài)友好的方法對污染土壤進行修復[2]。作為綠色友好的修復措施，植物修復技術可有效去除污染物[3]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界范圍內(nèi)被廣泛用作修復重(類)金屬的功能植物，相對于其他修復植物紫花苜蓿具有根深蒂固、高產(chǎn)、耐旱等諸多明顯優(yōu)勢[4]。生物炭是廢棄物、畜禽糞便和污泥等生物質(zhì)材料在限氧或無氧條件下，經(jīng)熱裂解得到的一種富碳產(chǎn)品[5]。研究表明，生物炭由于其多孔結構、較大的比表面積、較高的表面電荷密度以及高pH值，可以有效吸附和固定重金屬離子[6]，目前已廣泛運用于修復鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)等金屬離子污染的土壤。

對于農(nóng)業(yè)土壤修復，除了去除或鈍化土壤污染物外，還應關注土壤養(yǎng)分保持和生物地球化學循環(huán)的作用[7]。土壤養(yǎng)分受植物攝入量和根系分泌物調(diào)節(jié)，功能性植物可以通過改變土壤物理結構來影響有機質(zhì)分解、養(yǎng)分釋放和土壤呼吸等[8]。因此，植物修復可以顯著改變受污染土壤的理化性質(zhì)，從而影響功能微生物的豐度，進而影響土壤的生物地球化學循環(huán)[7，9]。土壤氮(N)礦化是地球生物化學N循環(huán)的重要過程，主要由功能性微生物介導[10]。作為N礦化的重要表征，蛋白酶在分解土壤蛋白質(zhì)以提供礦物質(zhì)氮方面發(fā)揮著關鍵作用[11]，編碼土壤蛋白酶的功能基因包括nprA和aprA基因，除蛋白酶外，幾丁質(zhì)酶亦參與了土壤有機質(zhì)中礦物N的釋放，微生物中編碼幾丁質(zhì)分解酶的關鍵功能基為chiA基因[12]。屬于水解酶的土壤蛋白酶和幾丁質(zhì)酶可以反映整個土壤微生物的活性，同時皆參與了污染物的轉化和降解[13]。眾多研究表明，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在恢復土壤生態(tài)系統(tǒng)服務中扮演著極其重要的角色。

此外，功能性氨氧化古菌(AOA)和細菌(AOB)對土壤污染物反應較為敏感，因此相對于其他生化過程，由于功能多樣性較低，土壤礦化對不同類型污染源的敏感性存在差異[14]。因此，N素礦化率(Rm)是反映功能微生物豐度、土壤理化性質(zhì)和污染物含量的重要表征，已被廣泛用作量化土壤環(huán)境質(zhì)量的有效指標[7]。盡管一些研究已經(jīng)報道了污染土壤中N礦化速率的變化特征，然而很少有研究同時關注酶活性和相應的功能基因豐度?；诖耍狙芯客ㄟ^盆栽試驗探討了Cd污染土壤中生物炭對紫花苜蓿鎘吸收、土壤性質(zhì)及氮礦化相關基因的影響，研究結果可為生物炭和植株修復廣泛運用于修復污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2021年4—7月在河南質(zhì)量工程職業(yè)學院研究場地溫室中進行，棚中晝/夜平均溫度為 28 ℃/19 ℃，相對濕度為75%。

供試紫花苜蓿種子來自河南省農(nóng)業(yè)科學院，紫花苜蓿種子在體積分數(shù)10%的過氧化氫溶液中進行表面消毒，在黑暗中潮濕的濾紙上催芽24 h。供試生物炭來自河南省生物炭工程技術研究中心，采用玉米和小麥秸稈(質(zhì)量比1 ∶2)在低氧、450 ℃條件下連續(xù)炭化60 min制得，其基本性質(zhì)為：全碳含量49.5%，總氮含量2.15%，比表面積為15.48 m2/g，容重為0.27 g/cm3，pH值為8.32，主要官能團為羥基、烷烴和酰胺基。

供試土壤取自河南省平頂山某鎘污染農(nóng)田土壤0～20 cm表層。土壤類型為褐土，pH值為8.06，土壤全Cd含量為5.28 mg/kg，根據(jù)國家標準環(huán)境質(zhì)量標準(GB 15618—1995)，pH值>7.5，Cd含量>1 mg/kg，即為鎘超標，該農(nóng)田土壤Cd含量為限額的5.28倍。土壤理化性質(zhì)為：有機質(zhì)含量 20.26 g/kg，全氮含量1.05 g/kg、堿解氮含量140.86 mg/kg，有效磷含量17.52 mg/kg，速效鉀含量115.61 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，設置5個處理分別為，MX：單獨種植紫花苜蓿；MX+BC1：種植紫花苜蓿+1%生物炭；MX+BC2：種植紫花苜蓿+2%生物炭；MX+BC4：種植紫花苜蓿+4%生物炭；不種植苜蓿植物修復和不添加生物炭的為空白對照處理(CK)；其中1%、2%、4%生物炭指添加生物炭質(zhì)量與盆栽用土質(zhì)量的百分比。每個處理3次重復。每盆裝土2 kg。將相應處理的生物炭比例與土壤提前混合均勻。每盆播撒種子3粒(按田間種植密度8×107粒/hm2)，保持70%土壤持水量。種植期間不定時加入自來水，其他管理措施同作物培育方法，試驗培育期90 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 植株生物量、Cd含量及土壤Cd含量測定 培育結束后收獲紫花苜蓿植株，采用清水小心清洗根系，將苜蓿不同部位分離，小心快速沖洗，然后置于烘箱中105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量并稱質(zhì)量記錄。采用石墨爐-原子吸收光譜法測定植物提取物中的Cd濃度。

稱取1.00 g土壤樣品于Teflon PFA窄口瓶中，加入2 mL HNO3和2 mL 30% H2O2在封閉條件下高溫消解得到消解樣品。采用電感耦合等離子體光譜儀(ICP-OES)測定土樣中的Cd濃度。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性測定 采用奧豪斯ST3100/F型pH值計進行土壤pH值測定(水 ∶土=2.5 ∶1)，采用K2Cr2O7氧化還原滴定法測定土壤有機碳(SOM)含量，總氮(TN)含量采用半微量凱氏定氮法測定，速效氮含量采用堿解擴散法測定，陽離子交換量(CEC)采用EDTA-銨鹽快速法[15]測定。

土壤中性蛋白酶活性(SNPA)、堿性蛋白酶活性(SAPA)及土壤幾丁質(zhì)酶活性(SCA)分別采用試劑盒BC0275、BC0880及BC1935-100T/48S測定(Solarbio，北京)。

1.3.4 土壤酶活基因及功能基因豐度測定 稱取新鮮土壤樣品500 mg，采用FastDNA?SPIN土壤試劑盒(MP Biomedicals，USA)提取土壤DNA。并用NanoDrop ND-1000紫外-可見分光光度計(NanoDrop Technologies，Wilmington，簡稱DE)采用紫外分光光度法檢測DNA質(zhì)量和濃度，并將DNA 懸浮液保持在-20 ℃環(huán)境。采用實時熒光定量 PCR (RT-PCR) 測定土壤氮循環(huán)中關鍵酶基因的豐度，土壤酶活基因(nprA、aprA、chiA)引物參考Man[17]，AOA及AOB基因引物為常規(guī)(古)細菌氨氧化基因引物[18](表1)。使用SYBR GREEN PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96光學實時檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc. Hercules，CA)上進行RT-PCR反應。反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR? Premix ExTaqTM(TaKaRa Biotech，中國大連)、7.6 μL ddH2O、0.2 μL 正向引物(10 μmol/L)、0.2 μL反向引物(10 μmol/L)、2.0 μL模板DNA。qRT-PCR反應步驟為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。通過對含有評估基因的純化質(zhì)粒進行10倍連續(xù)倍比稀釋(101～108倍)獲得標準曲線。每個反應組都運行包含無菌ddH2O作為模板的空白對照，標準曲線的R2值范圍為0.991～0.999。

表1 實時定量 PCR的引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0進行檢驗分析(α=0.05)，采用Origin 9.1進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 鎘污染土壤中生物炭對紫花苜蓿生物量累積及鎘吸收的影響

由表2可知，紫花苜蓿地上部生物量、根系生物量及總生物量均表現(xiàn)為生物炭MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理皆顯著大于單一苜蓿種植處理(MX)，且生物炭處理中，皆表現(xiàn)為隨著生物炭用量增加生物量累積量降低，各處理生物量順序皆呈 MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4>MX處理，與 MX+BC1處理相比，地上部生物量、根系生物量及總生物量分別顯著降低27.24%～68.93%、29.12%～72.97%、27.77%～70.07%。在根系Cd濃度中，與MX處理相比，MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理分別顯著降低23.25%、27.33%、26.02%；地上部Cd濃度表現(xiàn)為MX+BC4>MX+BC1>MX>MX+BC2處理，但處理間無顯著差異。各處理植株Cd累積量與根系生物量累積規(guī)律基本一致。

表2 鎘污染土壤中生物炭對紫花苜蓿生物量累積及鎘吸收的影響

2.2 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤理化性質(zhì)的影響

由表3可知，pH值整體以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4大于CK、MX處理，其中MX+BC4處理顯著大于CK、MX處理。土壤有機質(zhì)中，不同處理呈MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，且較MX+BC4處理相比，MX+BC2、MX+BC1、MX、CK處理分別顯著降低9.87%、15.07%、17.35%、20.67%。陽離子交換量中，MX處理顯著大于CK，且生物炭處理均顯著高于CK、MX處理。各處理全氮含量、速效氮含量規(guī)律基本一致，即生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4皆顯著小于CK、MX處理，由于表現(xiàn)在速效氮指標中，且上述3個指標中生物炭處理間無顯著差異。土壤有效Cd濃度中，以苜蓿+生物炭處理MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4較低，皆顯著低于CK，同時生物炭處理間呈MX+BC4

表3 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤酶活性及基因豐度的影響

相關酶活性中，土壤幾丁質(zhì)酶以MX+BC1處理活力最大，MX+BC2處理其次，二者差異顯著且皆顯著大于其他處理，同時CK、MX+BC4這2個處理顯著低于MX處理(圖1-a)。由圖1-b可知，各處理中性蛋白酶活性表現(xiàn)為MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，較CK相比，苜蓿及生物炭處理MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4顯著提高31.69%～90.39%。土壤堿性蛋白酶活性仍以CK最低，MX+BC2、MX+BC4、MX+BC1、MX處理較其分別顯著提高267.79%、236.99%、213.50%、154.29%。

相關酶基因豐度中，chiA基因豐度以CK最高，其他處理較其顯著降低20.31%～51.81%，此外，MX、MX+BC4處理顯著低于MX+BC4、MX+BC4這2個處理(圖1-d)。nprA基因豐度中，整體以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4較高，均顯著高于CK，且MX+BC1、MX+BC2處理顯著大于MX處理(圖1-e)。aprA基因豐度中，各處理呈MX

2.4 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤氮轉化基因豐度的影響

由圖2-a可知，AOA-amoA基因中，以CK豐度最低，1.35×108拷貝數(shù)/g，MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理較其顯著增加31.85%、77.78%、104.44%、51.11%，其中CK與MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4均存在顯著差異。AOB-amoA基因中，以CK豐度最低，顯著低于其他處理，且各處理呈MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，MX+BC4處理顯著高于其余各處理(圖2-b)。而在AOA-amoA/AOB-amoA中，CK、MX、MX+BC1、MX+BC2處理間差距較小，處理間無顯著差異；以MX+BC4處理比例最低，CK、MX、MX+BC1、MX+BC2較其分別顯著提高68.35%、49.89%、62.50%、76.02%。

2.5 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤氮礦化率的影響

由圖3可知，氮礦化率以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4大于CK、MX處理，且生物炭處理間表現(xiàn)為MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4處理，且MX+BC1處理顯著大于MX+BC4處理。以CK礦化率最低，MX處理較其顯著提高58.55%。與單一紫花苜蓿處理MX相比，MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理分別顯著提高270.62%、235.04%、182.75%。

2.6 氮礦化速率與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的關系

從表4可以看出，Rm與全氮(TN)、速效氮(AN)土壤有效Cd濃度(A-Cd)均呈極顯著負相關，Rm與pH值、有機質(zhì)(SOM)、堿性蛋白酶(SAPA)、nprA、AOB-amoA呈極顯著正相關，與AOA-amoA呈顯著正相關。A-Cd與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的相關性分析則和Rm相反。由表5可知，在Rm與相關功能基因的逐步回歸分析中，回歸模型為Rm=18.27×AOB-amoA+6.92×10-7×nprA-5.45，且P<0.01，同樣，Rm與有效Cd濃度的逐步回歸分析顯示Rm與A-Cd濃度存在對數(shù)關系，且P<0.01。

3 討論與結論

土壤Cd污染已成為制約農(nóng)業(yè)安全發(fā)展的重要因素，物理修復和植物修復已被證明可極大地作用于土壤Cd修復[19-20]。本研究中，在Cd污染土壤中，紫花苜蓿地上部生物量累積大于根系，而在Cd濃度分布趨勢則反之，且在植株Cd累積量中，表現(xiàn)為MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4>MX處理，這意味著紫花苜蓿的修復作用涉及根系的吸收富集，從而從根部轉移到地上部，然后在地上組織中積累，生物炭可進一步促進紫花苜蓿的修復效果。從植物吸收和土壤微生物的利用角度來看，有效重金屬含量是決定植物組織中重金屬的吸收和累積的重要因素[21]。本研究結果表明，紫花苜蓿植物修復處理均顯著降低了土壤有效鎘含量，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：(1)苜蓿根系分泌物與Cd絡合，降低了有效Cd含量[22]；(2)紫花苜蓿根系可以吸附金屬離子，且改變土壤微生物群落，從而進一步固定更多的重金屬Cd[23]。

表4 氮礦化速率與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的相關性分析

表5 氮礦化速率與功能基因豐度、有效鎘(A-Cd)之間的逐步回歸分析

土壤氮含量、有機質(zhì)及陽離子交換性能等土壤特性會顯著影響土壤氮素代謝微生物活性、生物量和群落結構，從而影響氮素礦化等過程[7]。本研究中，單一紫花苜蓿種植或與生物炭組合施用均改變了一系列土壤特性，即苜蓿種植顯著增加了SOM、CEC含量，并且相對于苜蓿單一種植，應用生物炭進一步提高了SOM、CEC含量。然而，生物炭及紫花苜蓿提高SOM的機制可能不同，前人研究表明，苜蓿具有廣泛的主根系統(tǒng)，苜蓿根系分泌物(碳水化合物、酚酸和脂質(zhì))有利于根際微生物的建立，具有促進土壤微生物生物量和活性的潛力[22]，因此苜蓿種植可通過功能性微生物(如根瘤菌和叢枝菌根真菌)作用的生物效應增加SOM含量[24]，而生物炭則主要通過非生物功能增加SOM含量。

作為N礦化的重要表征，蛋白酶在分解土壤蛋白質(zhì)以提供礦物質(zhì)氮方面發(fā)揮著關鍵作用[25]。本研究中，紫花苜蓿處理的蛋白酶(中性、堿性)和幾丁質(zhì)酶活性高于對照，這可能是由于土壤蛋白酶和幾丁質(zhì)酶由土壤細菌和真菌活動所介導[4]，在植物修復后細菌和真菌的生物量增加[21]，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶因此增加。另一方面，紫花苜蓿生長需要從試驗土壤中攝取礦質(zhì)N并降低有效N含量[23]，這可能對土壤N礦化產(chǎn)生正反饋效應并進一步刺激酶活性[11，25]。土壤酶的整個生物學過程包括DNA復制、mRNA轉錄和蛋白質(zhì)表達[17]。重金屬Cd可能對mRNA 轉錄產(chǎn)生有害影響并下調(diào)功能基因表達[26]。本研究結果表明，CK土壤有效Cd濃度最高，各處理的相關土壤酶基因的絕對豐度波動不大。然而，盡管CK中aprA和chiA基因豐度與單一苜蓿處理(MX)中的差距不大，但CK的酶活性更低，這意味著蛋白質(zhì)轉錄過程受到Cd抑制。本研究中，添加生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4對3種酶活性和相應的酶功能基因豐度整體提高，這與前人的研究結果[27]趨于一致。原因可能是添加生物炭后改變了土壤特性如土壤持水能力、pH值和SOM含量，從而影響mRNA轉錄和蛋白質(zhì)表達[28]。

氨氧化古菌基因(AOA-amoA)和細菌功能基因(AOB-amoA)是反映土壤微生物性N轉化的重要表征。Ribbons等研究表明，土壤氮轉化尤其是氮礦化過程受AOA-amoA、AOB-amoA介導[29]。相關研究表明，土壤氮礦化率活性主要與AOA-amoA相關[23]。本研究結果表明，苜蓿種植處理的AOA-amoA、AOB-amoA豐度皆整體高于CK，且AOA-amoA基因豐度始終高于AOB-amoA，這與之前的研究結果一致，即基于植物修復可以顯著刺激受污染土壤中AOA類固氮微生物的繁殖及其功能活性[30]。氮素礦化率單一苜蓿處理顯著高于CK，而生物炭處理顯著大于上述2個處理，表明生物炭在促進土壤氮礦化中具有顯著的促進作用。相關性分析表明，Rm與AOA-amoA、AOB-amoA皆呈明顯正相關，且與AOB-amoA關系更密切。此外，本研究結果表明，AOA-amoA/AOB-amoA的比值與土壤有效Cd含量之間存在正相關關系，表明土壤AOB對Cd的生物毒性比其古細菌更敏感。逐步回歸分析表明，AOB-amoA基因比其AOA-amoA更能影響Rm，表明AOB是影響農(nóng)業(yè)土壤中的土壤氮素轉化的主要功能菌類[23，31-32]。