萬文斌，桑紹明，鐘春玖

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127；2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）退行性疾病，也是癡呆的最常見類型，其主要臨床表現(xiàn)有以記憶減退為主要表現(xiàn)的進行性認知功能障礙及其他神經(jīng)精神癥狀［1］，病理上以腦內(nèi) β-淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque， SP）、過度磷酸化Tau （hyperphosphorylated Tau）蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結（neurofibrillary tangles， NFT）及神經(jīng)突觸損傷、神經(jīng)元丟失為特征性改變［1］。

越來越多的基礎及臨床研究顯示，硫胺素代謝障礙與AD 發(fā)病關系密切［2-3］，但硫胺素代謝障礙對Tau病理形成的影響尚不清楚。 因此，本實驗通過構建硫胺素缺乏（thiamine deficiency， TD）小鼠模型，分析其腦內(nèi)Tau 蛋白病理改變特征。 從而為硫胺素代謝障礙致AD 相關病理產(chǎn)物的形成提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物3月齡 SPF 級 C57／BL6 小鼠由中國科學院上海斯萊克實驗動物中心提供，標準環(huán)境下飼養(yǎng)，自然照明，自由進食和飲水。 本實驗由復旦大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會審批同意，所有動物實驗相關操作符合動物實驗倫理要求。

1.2 主要設備與試劑硫胺素缺乏小鼠顆粒飼料及對照飼料（中國Trophic 公司訂制）、吡啶硫胺素（美國Sigma）、 Tau5 抗體（英國 Abcam）、 AT8 抗體（美國Pierce）、磷酸化 Tau S396 （p-Tau S396）抗體（德國CST）、磷酸化 Tau T181 （p-Tau T181）抗體（德國CST）、 IRDye? 680LT／800CW 二抗（美國 Li-Cor）、蛋白酶抑制劑（瑞士 Roche）、 BSA（美國 Amresco）、橫冷冰凍切片機（德國徠卡CM1950）。 垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad）、 Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國 Li-Cor）、 HPLC（美國 Agilent）、超純水凈化儀（美國 Millipore）、電子天平（美國 Mettler Toledo）。

1.3 動物分組及硫胺素缺乏小鼠模型構建將小鼠隨機分為2 組（正常對照組和硫胺素缺乏組），硫胺素缺乏組予硫胺素缺乏顆粒飼料聯(lián)合吡啶硫胺素（劑量500 μg／kg·d）腹腔注射，正常對照組予正常飲食聯(lián)合等體積生理鹽水腹腔注射。

1.4 標本采集與制備小鼠處理10 d 后取腦，分離海馬組織和稱定質(zhì)量記錄，在預冷的生理鹽水中漂洗1 次放入液氮中，再放入-80 ℃冰箱中保存。 用于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測硫胺素含量的標本經(jīng)KH2PO4處理后用研磨機震蕩預處理后凍存，用于Western Blot 檢測的標本加入含蛋白酶抑制劑的裂解液經(jīng)研磨震蕩、裂解提取組織蛋白，測定濃度后凍存。 用于免疫熒光染色的小鼠經(jīng)冰生理水心臟灌流后予以4% PFA 固定后按程序性脫水處理，橫冷切片機切片后置于凍存液中保存。

1.5 HPLC 檢測參照高效液相色譜法《中國藥典》2015年版四部通則0631，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-磷酸氫二鉀水溶液（25 mmol／L， pH值7.0）為流動相，梯度洗脫（參數(shù)如表1 所示），熒光檢測：激發(fā)波長為375 nm，吸收波長為435 nm。

表1 HPLC 檢測參數(shù)

1.6 Western Blot 蛋白檢測蛋白樣品加入上樣緩沖液后進行上樣電泳，積層膠電壓60 V，分離膠電壓100 V，轉(zhuǎn)膜采用電壓70 V 持續(xù)120 min，5%BSA 封閉后一抗孵育在4 ℃過夜，復溫后IRDye?680LT／800CW二抗孵育用Odyssey 近紅外成像系統(tǒng)掃膜。

1.7 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)采用經(jīng)SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理進行分析。 計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗后，正態(tài)分布且方差齊性的計量資料據(jù)均用均數(shù) ± 標準差（）表示， 2 組間比較行獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)硫胺素代謝產(chǎn)物含量降低體內(nèi)硫胺素主要包括游離硫胺素（free thiamine，fT）、一磷酸硫胺素（thiamine monophosphate， TMP）及二磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate， TDP）3 種衍生物，其中TDP 是硫胺素的主要儲存和轉(zhuǎn)運形式，也是執(zhí)行硫胺素參與線粒體能量代謝的主要成分。 為此，采用HPLC 對硫胺素缺乏小鼠腦組織中硫胺素的3 種成分進行測定。

與對照組比較，硫胺素缺乏小鼠全血TDP、 TMP及fT 水平均降低，定量分析顯示與對照小鼠比較分別減少82%、 80%及63%（P＜0.01）。 對腦組織的分析也觀察到一致的結果。 硫胺素缺乏小鼠大腦皮層TDP、 TMP 及fT 水平與對照小鼠比較分別降低86%、97%及94% （P＜0.01）；硫胺素缺乏小鼠海馬組織TDP、 TMP 及fT 水平與對照小鼠比較分別降低79%、95%及 96%（P＜0.01）。 見圖 1。

圖1 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)硫胺素代謝產(chǎn)物水平測定

2.2 硫胺素缺乏促進Tau 蛋白磷酸化Tau 蛋白是神經(jīng)元中含量豐富的微管相關蛋白，其功能在于促進微管組裝及維持微管的結構穩(wěn)定。 在AD 中， Tau 蛋白過度磷酸化是重要的特征性病理改變，其在認知功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4］。 既往前期已發(fā)表研究提示，硫胺素與Tau 蛋白病理形成關系密切［2］。

蛋白印跡檢測顯示硫胺素缺乏小鼠皮層及海馬中S202 和 T205 雙位點磷酸化 Tau（p-Tau S202，T205， AT8） 水平分別增加了 2 倍與 1. 2 倍 （P＜0.01）。 對經(jīng)典 Tau 蛋白磷酸化位點 T181、S396 進行了檢測顯示，在硫胺素缺乏小鼠皮層， pT181 及pS396蛋白水平分別增加了 1.3 倍及 2 倍（P＜ 0.01），在硫胺素缺乏小鼠海馬， pT181 及pS396 蛋白水平分別增加了 1 倍及 0.3 倍（P＜0.01）。 見圖 2。

圖2 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)過度磷酸Tau 蛋白水平增加

2.3 硫胺素缺乏引起Tau 蛋白異常聚集從蛋白印跡條帶分布可以看出，硫胺素缺乏小鼠存在Tau 蛋白出現(xiàn)條帶遷移（mobility shift），即膜上免疫印跡結果顯示硫胺素缺乏小鼠腦組織Tau 蛋白條帶向分子量大的位置遷移。 與對照組比較，硫胺素缺乏組Tau 蛋白分子量顯著增加。 蛋白條帶遷移意味著蛋白空間構象改變及翻譯后與其他蛋白耦合等可能。 然而由于含0.1% SDS、1% Triton X-100 的強效裂解液對總蛋白進行提取，在SDS 和Triton X-100 的作用下可破壞蛋白間相互作用，從而將翻譯后的蛋白耦合成分去除，推測可能存在Tau 蛋白異常聚集導致的蛋白條帶遷移。既往已有文獻報道AD 患者及動物模型中存在Tau 蛋白過度磷酸化聚集形成的空間構象改變，蛋白強變性劑尿素（Urea）可使聚集的 Tau 蛋白充分解螺旋［5］。 利用尿素處理后再次對Tau 蛋白進行電泳鑒定。 經(jīng)尿素處理后，硫胺素缺乏小鼠皮層及海馬組織Tau 蛋白磷酸化變化趨勢同前，然而通過蛋白條帶位置反映的Tau 蛋白分子量顯示硫胺素缺乏小鼠與正常對照小鼠基本一致，蛋白條帶遷移現(xiàn)象被尿素處理逆轉(zhuǎn)。 本結果也提示Tau 蛋白過度磷酸化可能是導致其在免疫印跡檢測時出現(xiàn)條帶遷移的原因，硫胺素缺乏使通過引起Tau 蛋白異常磷酸化，從而導致蛋白的異常聚集。 見圖3。

圖3 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)Tau 空間構象改變

2.4 硫胺素缺乏增加難溶性Tau 蛋白組分除過度磷酸化及蛋白異常聚集導致空間構象改變以外，難溶組分含量增加是AD 中Tau 蛋白變化的另一個重要病理表現(xiàn)形式［6-7］。 采用Sarkosyl 分離可溶性和難溶性Tau蛋白，結果顯示硫胺素缺乏小鼠腦組織中可溶組分Tau蛋白水平與正常對照組無顯著差異（P＞0.05），但難溶組分 Tau 蛋白水平顯著增加（P＜0.01）。 見圖 4。

圖4 硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)難溶性Tau 蛋白水平增加

3 討論

以Aβ 為核心的發(fā)病機制假說（Aβ 級聯(lián)假說）是目前AD 領域最廣為接受的病因假說。 Aβ 假說認為各種原因引起的Aβ 生成異常增加以及清除障礙，腦內(nèi)Aβ 過度沉積形成神經(jīng)毒性SP，繼而誘發(fā)包括Tau蛋白病理、線粒體功能障礙、氧化應激、神經(jīng)元損傷等一系列級聯(lián)效應，最終導致認知功能減退及AD 病程進展［8］。 因此清除腦內(nèi) Aβ 沉積是研究 AD 治療領域的重要課題。 然而研究表明，腦內(nèi)Aβ 沉積并不與AD病情成正相關，三分之一認知功能正常的77歲以上老年群體腦內(nèi)Aβ 沉積達到AD 診斷標準、約50%認知功能正常的82歲以上老年群體腦內(nèi)Aβ 沉積達到AD診斷標準［9-11］。 可見， Aβ 沉積過程可能獨立于 AD 認知功能損害的進展。 更重要的是，近十年來基于該假說的多項Aβ 相關臨床藥物試驗均宣告失?。?2-14］。 這提示可能存在腦糖代謝障礙是AD 病程中恒有的病理生理改變。 大量臨床與基礎研究證實AD 患者早期即存在大腦葡萄糖代謝異常，腦糖代謝障礙明顯早于臨床癥狀的出現(xiàn)，甚至有研究發(fā)現(xiàn)早于AD 發(fā)病數(shù)十年［15-17］，提示大腦葡萄糖代謝障礙在AD 發(fā)病中的關鍵作用。然而，對于腦糖代謝障礙的誘發(fā)因素學界仍未找到確切答案。

越來越多的基礎研究及臨床循證依據(jù)顯示硫胺素代謝障礙可能是AD 超早期的潛在病理改變［2-3］。AD 患者腦細胞中，以硫胺素作為輔酶的α-酮戊二酸脫氫酶（α-ketoglutarate dehydrogenase， KGDH）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase， PDH）和轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase， TK） 活性下降顯著［18-19］，且 PDH 和KGDH 與 AD 臨床病情評定等級高度相關［20］。

Tau 蛋白空間構建改變出現(xiàn)聚集繼而引起難溶性組分增加是 AD 中 Tau 蛋白病理的經(jīng)典類型［21］。 本研究利用硫胺素缺乏小鼠模型對Tau 蛋白病理進行的檢測分析，發(fā)現(xiàn)硫胺素缺乏不僅能顯著誘導Tau 蛋白過度磷酸化含量增加，還能可引起Tau 蛋白空間構建變化及難溶性Tau 蛋白組分增加。 因此，該結果也為硫胺素代謝障礙致AD 病變提供了實驗依據(jù)。

本研究首次闡述了硫胺素代謝障礙引起Tau 蛋白異常聚集及難溶性Tau 蛋白組分增加等AD 相關特征性病變，為硫胺素代謝障礙參與AD 發(fā)病的相關機制提供了實驗依據(jù)。 然而，本實驗未明確硫胺素代謝障礙致Tau 蛋白異常聚集的電鏡結構特征及難溶性Tau蛋白組分形成的內(nèi)在機制，這也是本實驗下一步的研究探索方向。