楊王浩，趙淑琴，閆美淋，雍 芳，陳華濤，郜 原*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

1 褪黑素的發(fā)現(xiàn)

1958年，Lerner[1]首先發(fā)現(xiàn)動(dòng)物松果體分泌的褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)可以控制晝夜節(jié)律和其他周期性節(jié)律(包括季節(jié)性繁殖)[2]。之后的許多年里，研究人員認(rèn)為只有松果體可以分泌褪黑素。但在研究松果體褪黑素的合成途徑中，研究人員發(fā)現(xiàn)大部分動(dòng)物的視網(wǎng)膜和小腦中也存在褪黑素合成的相關(guān)酶。此后，在許多其他組織中也發(fā)現(xiàn)了褪黑素合成的關(guān)鍵酶。

最初的研究表明存在于松果體外的褪黑素與視網(wǎng)膜有關(guān)，在視網(wǎng)膜組織中鑒定出羥辛醇-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(hydroxindole-O-methyltransferase)，也叫N-乙酰血清素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin-O-methyltransferase，ASMT)[3]。進(jìn)一步研究表明，視網(wǎng)膜和切除松果體的大鼠的小腦中可能存在褪黑素。在上述組織中檢測(cè)到芳胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(aralkylamine-N-acetyltransferase，AANAT)和ASMT，表明這些組織有能力不依賴松果體獨(dú)立合成褪黑素。此外，1975年Raikhlin等人采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定了腸黏膜腸嗜鉻細(xì)胞中的褪黑素，他們發(fā)現(xiàn)胃腸道中的褪黑素含量約是松果體中的400倍，是血漿中的10～100倍。研究人員還發(fā)現(xiàn)胃腸部位產(chǎn)生的褪黑素不受光周期控制，而是受食物攝入的節(jié)律所控制。同時(shí)，人們?cè)谇谐怂晒w的大鼠的血漿和尿液中也檢測(cè)到褪黑素。在切除了大鼠松果體的這項(xiàng)研究中，褪黑素的每日尿排泄量在松果體切除后下降了80%，并且沒(méi)有表現(xiàn)出晝夜變化。這些研究結(jié)果使“松果體褪黑素”轉(zhuǎn)向“松果體外褪黑素”的研究。隨著包括PCR在內(nèi)的更為具體的分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，AANAT和ASMT mRNA已在多種組織和器官中檢測(cè)到，其中包括胸腺、脾臟、心臟、骨骼肌、肝臟、胃、腸道、胎盤、睪丸、卵巢、大腦皮層和紋狀體等。由于這些組織同時(shí)表達(dá)AANAT和ASMT，因此它們很有可能從血清素合成褪黑素。

有一些組織在白天通常不產(chǎn)生吲哚胺，例如視網(wǎng)膜。夜晚松果體外褪黑素合成的變化表明吲哚胺的產(chǎn)生是由信號(hào)通路調(diào)節(jié)而不是受光周期調(diào)節(jié)的。此外，在每天24 h中，松果體外的許多組織中的褪黑素含量比血漿中的高，這些組織的胞內(nèi)褪黑素將會(huì)釋放到循環(huán)中。上述結(jié)果表明，褪黑素可能在局部發(fā)揮作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化和炎癥損傷。據(jù)此可推測(cè)褪黑素是一種高效的抗氧化劑，褪黑素可能在非松果體細(xì)胞中合成，它可用于對(duì)抗有氧過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物來(lái)保護(hù)細(xì)胞。

1.1 褪黑素受體

褪黑素在體內(nèi)發(fā)揮作用主要通過(guò)兩種途徑介導(dǎo)，一種是通過(guò)受體介導(dǎo)，另一種是通過(guò)非受體介導(dǎo)[4]。這里主要介紹細(xì)胞膜上的褪黑素受體[5]，也就是受體介導(dǎo)的途徑。在受體介導(dǎo)途徑中，褪黑素受體MT1和MT2均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[6，7]。MT1褪黑素受體與生殖、代謝以及血管收縮等功能有關(guān)[8]，而MT2受體則起控制晝夜節(jié)律、視網(wǎng)膜多巴胺釋放和血管擴(kuò)張等作用。然而，另一種褪黑素結(jié)合位點(diǎn)MT3，現(xiàn)已被鑒定為醌還原酶2，它與細(xì)胞的異源代謝有關(guān)，MT3并不完全符合褪黑素受體的標(biāo)準(zhǔn)，因此在文中暫不討論。

1.2 褪黑素合成途徑

松果體和腸外組織中均有褪黑素的合成。在所有組織中，褪黑素都由色氨酸通過(guò)血清素途徑產(chǎn)生的。其中在松果體內(nèi)，褪黑素的產(chǎn)生受視交叉上核(SCN)的晝夜節(jié)律信號(hào)控制，而視交叉上核又與光周期有關(guān)。褪黑素一旦形成，不會(huì)儲(chǔ)存在松果體中，而是迅速分泌到脊髓液和血液中，并以游離和蛋白結(jié)合的形式出現(xiàn)。除了視網(wǎng)膜等一些組織與松果體中的褪黑素代謝途徑不同外，其他組織中的褪黑素的合成是通過(guò)與松果體相同的代謝途徑產(chǎn)生的，不受光周期的調(diào)節(jié)。

動(dòng)物物種間褪黑素合成的調(diào)節(jié)存在顯著差異。與低等哺乳動(dòng)物相比，人類松果體組成性地表達(dá)AANAT mRNA、ASMT mRNA和蛋白質(zhì)，表明在褪黑素節(jié)律性合成中起主要作用的是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)表明，與褪黑素合成有關(guān)的酶活性受蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)。盡管AANAT和ASMT的mRNAs已經(jīng)在大多數(shù)檢測(cè)組織中(包括人類在內(nèi))確定存在，但這些酶是否通過(guò)形成復(fù)合物來(lái)合成褪黑素尚不清楚。

1.3 褪黑素劑量與作用的關(guān)系

除其他作用外，松果體中的褪黑素與松果體外組織產(chǎn)生的褪黑素共同參與維持體內(nèi)平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。哺乳動(dòng)物血液中的循環(huán)褪黑素濃度高達(dá)0.5 nmol/L，而松果體外的濃度則因組織而異，但可以達(dá)到微摩爾水平。松果體中的褪黑素和胞外褪黑素都能對(duì)抗自由基損傷，但它們的作用機(jī)制不同，即分別通過(guò)抗氧化和清除自由基的活性來(lái)達(dá)到對(duì)抗自由基損傷的作用。循環(huán)褪黑素結(jié)合并激活MT1/MT2膜受體，通過(guò)Gi蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低cAMP含量。因此，蛋白激酶A和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白或激活轉(zhuǎn)錄因子受到抑制。通過(guò)這一途徑，褪黑素可以調(diào)節(jié)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。褪黑素激活MT1/MT2受體也觸發(fā)其他信號(hào)途徑，包括磷脂酶C/蛋白激酶C(PLC/PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)等途徑。褪黑素的作用取決于其劑量和細(xì)胞中MT1、MT2兩種受體的存在[9]。對(duì)可變天然MT1和MT2受體的研究表明，在MT1/MT2受體存在下，納摩爾濃度的褪黑素濃度即可降低ERK活性。MT1和MT2的缺陷會(huì)使ERK途徑的褪黑素活化。因此，不同腦區(qū)和不同組織中的MT1/MT2相對(duì)分布和褪黑素劑量水平會(huì)驅(qū)動(dòng)其不同的信號(hào)通路[10]。

在體內(nèi)多種試驗(yàn)中使用高濃度的褪黑素，褪黑素始終表現(xiàn)出抗氧化活性。褪黑素的抗氧化活性主要涉及兩個(gè)機(jī)制：一種是直接的自由基清除劑活性，在與ROS和氮物種相互作用期間產(chǎn)生一系列中間體，所有這些中間體都是自由基清除劑。將這種反應(yīng)定義為褪黑素家族的自由基清除級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一種是間接的抗氧化活性，該機(jī)制導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化酶的表達(dá)和活性增加。這種機(jī)制最初與褪黑素通過(guò)核RORα受體的作用有關(guān)，也可能取決于褪黑素膜受體的激活，因?yàn)樽罱芯勘砻鞲邉┝康耐屎谒卦黾恿舜笫蟾闻K中mRNA的表達(dá)和MT1/MT2受體蛋白質(zhì)的含量。此外，一些控制褪黑素細(xì)胞內(nèi)分布機(jī)制的存在允許其到達(dá)靶標(biāo)(包括細(xì)胞核和線粒體)，該現(xiàn)象可以用來(lái)解釋大劑量褪黑素在多種疾病模型中抵消高氧化狀態(tài)的原因。

1.4 褪黑素抗氧化與促氧化作用

大多數(shù)研究報(bào)道了褪黑素的抗氧化作用[11]，但在某些情況下褪黑素也可能誘導(dǎo)促氧化活性。促氧化活性主要發(fā)生在嚴(yán)重受損的細(xì)胞和癌細(xì)胞中[12]。褪黑素在癌細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)促氧化活性取決于NF-κB的激活，而NF-κB的激活又驅(qū)動(dòng)褪黑素的合成，將褪黑素轉(zhuǎn)化為促凋亡分子。褪黑素在不同類型的癌癥中誘導(dǎo)產(chǎn)生的瞬時(shí)ROS會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物比率的變化。當(dāng)谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物比例降低時(shí)，褪黑素驅(qū)動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)至細(xì)胞凋亡；而當(dāng)谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物比例增加時(shí)，褪黑素對(duì)細(xì)胞命運(yùn)則具有相反的作用。褪黑素抗氧化劑/促氧化劑的平衡可能取決于細(xì)胞的氧化還原環(huán)境，但其促氧化劑活性可解釋其對(duì)瘤細(xì)胞的抑制作用[13]。促氧化劑可用于控制細(xì)胞的命運(yùn)，減少細(xì)胞對(duì)生物體的潛在危險(xiǎn)。細(xì)胞的褪黑素依賴性氧化還原狀態(tài)可能具有其他的后果。眾所周知，過(guò)氧化物酶是一種將過(guò)氧化氫降解為水的硫醇過(guò)氧化物酶，參與細(xì)胞的氧化還原途徑。在真核細(xì)胞中，晝夜節(jié)律計(jì)時(shí)涉及轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄機(jī)制，非轉(zhuǎn)錄機(jī)制則涉及過(guò)氧化物酶的氧化還原循環(huán)。褪黑素影響過(guò)氧化物酶的表達(dá)，并可能影響其氧化還原循環(huán)[14]，從而改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。

2 外源性褪黑素的來(lái)源

通過(guò)使用高度敏感的褪黑素抗體，在大腦、視網(wǎng)膜、皮膚、肝、腎、甲狀腺、胰腺、胸腺、脾臟、生殖道等組織中分別鑒定出松果體外褪黑素。褪黑素的物理化學(xué)性質(zhì)使其具有兩親性質(zhì)，能夠跨越所有形態(tài)的生理障礙，包括細(xì)胞膜和血腦屏障。雖然外周褪黑素通常不能進(jìn)入體循環(huán)，但這種結(jié)論有幾個(gè)例外，主要是存在于低等脊椎動(dòng)物中，如小雞、大鼠等。在試驗(yàn)中，給大鼠和小雞口服過(guò)量的色氨酸可誘導(dǎo)血清褪黑素的劑量呈依賴性增加。

雖然已知一些哺乳動(dòng)物激素是由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生的，但這些分子都沒(méi)有褪黑素那樣具有廣譜的來(lái)源。因此，褪黑素在已鑒定的信號(hào)分子中具有獨(dú)特的位置。這反映了它在穩(wěn)態(tài)控制和細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。

2.1 大腦中的褪黑素

人們懷疑大腦中也存在褪黑素，因?yàn)橥屎谒乜梢詮捏w循環(huán)和松果體釋放到腦室。腦部褪黑素除了來(lái)自其他部位外，Jiménez-Jorge等還提出了腦產(chǎn)生褪黑素的可能性。這些研究人員測(cè)量了胎兒期和胎兒出生后發(fā)育階段的大腦中褪黑素含量以及AANAT和ASMT的表達(dá)和活性，發(fā)現(xiàn)大腦組織中AANAT和ASMT顯著變化以及褪黑素含量的波動(dòng)。由于大鼠松果體在胎兒出生后2周才開始產(chǎn)生褪黑素，因此可以得出結(jié)論：大鼠腦部在胎兒發(fā)育早期階段可合成褪黑素。松果體切除術(shù)在此期間不影響腦部褪黑素水平，這一現(xiàn)象也表明腦部可以合成褪黑素。

但是目前尚不清楚哪種類型的細(xì)胞負(fù)責(zé)合成大腦中的褪黑素。研究人員培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞均產(chǎn)生褪黑素。當(dāng)這些細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元時(shí)，褪黑素的產(chǎn)生進(jìn)一步增加。但是這些培養(yǎng)物中幾乎沒(méi)有膠質(zhì)細(xì)胞，這表明神經(jīng)元自身可以合成褪黑素。褪黑素在神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的合成和存在表明局部產(chǎn)生的褪黑素可以在腦中發(fā)揮內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌作用，通過(guò)控制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)發(fā)生來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)[15]。

2.2 視網(wǎng)膜中的褪黑素

視網(wǎng)膜是許多脊椎動(dòng)物形成褪黑素的另一個(gè)主要部位，它發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能[16]。Bubenik等使用特異性褪黑素抗體首次在2日齡大鼠幼仔視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)了褪黑素的存在，其濃度隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，一直維持到20日齡。外源性褪黑素給藥或松果體切除術(shù)可以增加大鼠視網(wǎng)膜中褪黑素的含量，前者依賴于視網(wǎng)膜對(duì)循環(huán)褪黑素的攝取[17]。

在檢測(cè)獼猴視網(wǎng)膜中褪黑素的合成試驗(yàn)中，通過(guò)PCR和Northern blot檢測(cè)AANAT和ASMT在恒河猴視網(wǎng)膜中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASMT表達(dá)量極低，僅在夜間可以檢測(cè)到。反過(guò)來(lái)，AANAT mRNA水平在24 h內(nèi)相似，無(wú)較大的波動(dòng)，但AANAT的活性卻在夜間增加了4倍。這些結(jié)果與之前對(duì)Y79人視網(wǎng)膜母細(xì)胞的研究結(jié)果一致，與嚙齒動(dòng)物相比，獼猴和人類只需要激活A(yù)ANAT，而不需要改變基因表達(dá)，就能快速合成褪黑素。

2.3 免疫系統(tǒng)中的褪黑素

一些與免疫系統(tǒng)相關(guān)的細(xì)胞和組織也可以產(chǎn)生褪黑素[18,19]。其中，胸腺、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞分別含有不同濃度的褪黑素。人類淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生大量的褪黑素，其含量是夜間血漿濃度的5倍。人和大鼠胸腺都可以合成褪黑素。18日齡胎鼠胸腺含褪黑素，表達(dá)AANAT和ASMT的活性。這些酶表現(xiàn)出明顯的晝夜差異，白天水平很高，夜間降低；相反，胸腺的褪黑素含量也表現(xiàn)出一種晝夜節(jié)律，在夜間達(dá)到高峰，所以褪黑素的周期與AANAT和ASMT的周期不同步。褪黑素可以通過(guò)血胎屏障從母體轉(zhuǎn)移到胎兒，這種明顯的差異可能與胸腺?gòu)奶貉褐袛z取循環(huán)母體褪黑素有關(guān)。胸腺褪黑素的最大活性是成年期達(dá)到的。然而，成年大鼠的胸腺在夜間的褪黑素含量較低，推測(cè)來(lái)源于松果體的夜間高濃度褪黑素抑制了胸腺褪黑素的合成。松果體切除后影響松果體外褪黑素的合成與含量。

在大鼠腹腔分離的巨噬細(xì)胞中已經(jīng)確認(rèn)存在褪黑素和5-羥色胺。在色氨酸存在下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出較高的AANAT活性和較高的褪黑素生成量。骨髓是另一個(gè)含有大量褪黑素的組織，為了證明這一觀點(diǎn)，Tan等人首先通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、放射免疫分析、高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)和質(zhì)譜分析確定了大鼠骨髓中存在褪黑素。夜間大鼠骨髓中褪黑素的含量幾乎比血漿濃度高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。松果體切除術(shù)后殘留在該組織中的大量褪黑素支持了大鼠骨髓中褪黑素合成的猜想。外源性褪黑素給藥后，骨髓中檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)褪黑素濃度增加，這表明骨髓細(xì)胞可以從血液中汲取部分褪黑素。隨后在小鼠和人骨髓細(xì)胞中都證實(shí)了存在大量的褪黑素。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)均表明骨髓中的細(xì)胞可以合成褪黑素。

2.4 皮膚中的褪黑素

1993年，Slominski的研究小組在敘利亞倉(cāng)鼠皮膚中鑒定出2種NAT異構(gòu)體。試驗(yàn)表明，人類黑色素瘤細(xì)胞將l-色氨酸轉(zhuǎn)化為血清素和褪黑素，并表達(dá)色氨酸羥化酶和ASMT。這些結(jié)論證明黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的褪黑素可能與抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。嚙齒動(dòng)物和人類皮膚中存在MT1/MT2褪黑素受體和5HT2B和5HT7血清素受體，表明人類皮膚不僅合成褪黑素，而且也是這種吲哚胺的作用靶點(diǎn)。其中一些作用涉及MT1/MT2和RORα受體的存在，包括調(diào)節(jié)毛發(fā)生長(zhǎng)、色素沉著、抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖以及其他皮膚細(xì)胞的有絲分裂活性。其他文獻(xiàn)中報(bào)道的褪黑素的抗氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)在皮膚中也是有效的。因此，皮膚作為一種能夠產(chǎn)生褪黑素的組織代表，同時(shí)也是多種具有保護(hù)性褪黑素作用的靶點(diǎn)，通過(guò)內(nèi)部或局部機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

褪黑素還可能對(duì)皮膚有額外的作用。哺乳動(dòng)物的毛發(fā)密度可以抵御極端的氣溫；毛發(fā)厚度的季節(jié)變化受光周期的控制。因此，我們可以合理地假設(shè)褪黑素的季節(jié)性變化影響全年毛發(fā)的生長(zhǎng)規(guī)律。

2.5 胃腸道中的褪黑素

早在1975年就有人提出，胃腸道嗜鉻細(xì)胞(GIT)可能會(huì)合成褪黑素[20]。GIT局部產(chǎn)生褪黑素的現(xiàn)象來(lái)源于對(duì)出生后大鼠的研究。雖然松果體在出生后第2周才產(chǎn)生褪黑素，但在2日齡大的大鼠的GIT組織中即可檢測(cè)到褪黑素，而且，幾十年前人們發(fā)現(xiàn)松果體切除術(shù)后GIT中褪黑素的合成保持不變。同時(shí)使用多種方法進(jìn)行研究證實(shí)了不同物種的GIT中存在褪黑素[21]。這些結(jié)論以及GIT中AANAT和ASMT活性的檢測(cè)，進(jìn)一步證明GIT可以不依賴于松果體合成褪黑素[22]。并且研究人員發(fā)現(xiàn)GIT中的褪黑素水平是血清的10～100倍，GIT中的褪黑素總量是松果體的400倍，由此進(jìn)一步證明GIT中有自己獨(dú)特的褪黑素生產(chǎn)方式。外源性褪黑素給藥會(huì)增加GIT中褪黑素的含量，而且大多數(shù)食物都含有褪黑素，食用后，這種吲哚胺會(huì)被腸道吸收進(jìn)入循環(huán)。

GIT中褪黑素的來(lái)源仍然是一個(gè)值得討論的問(wèn)題。在出生后不久的小鼠中可檢測(cè)到GIT褪黑素，其在空腸、回腸和結(jié)腸中的濃度存在區(qū)域性差異，但是每種水平都高于胃中的水平。腸腔液也含有褪黑素，它可能來(lái)自黏膜和膽汁。由于微生物也大量產(chǎn)生褪黑素，腸道菌群也可能是褪黑素的另一種來(lái)源。很明顯，GIT褪黑素可能有多種來(lái)源，包括其他組織、膽汁、腸道菌群或食物等。由于消化道中褪黑素的含量通常不會(huì)出現(xiàn)每日波動(dòng)，因此光周期對(duì)GIT褪黑素的含量幾乎沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。因?yàn)樵S多食物都含有褪黑素，所以GIT中的褪黑素含量至少有一部分可能來(lái)自進(jìn)食。這也可以部分解釋白天動(dòng)物進(jìn)食時(shí)GIT中褪黑素含量高的原因。

2.6 生殖道中的褪黑素

松果體與生殖系統(tǒng)之間的潛在聯(lián)系早在1898年就已經(jīng)被確定，當(dāng)時(shí)有報(bào)道稱人類松果體腫瘤與青春期松果體外褪黑素致畸之間存在關(guān)系。然而，相關(guān)文獻(xiàn)指出，報(bào)道中所描述的松果體腫瘤不是松果體，而是絨毛膜癌，它產(chǎn)生于人絨毛膜促性腺激素，導(dǎo)致假性早熟。在褪黑素被鑒定以后，Hoffman和Reiter發(fā)現(xiàn)雄性倉(cāng)鼠在短時(shí)間內(nèi)暴露于光照下會(huì)導(dǎo)致性腺萎縮，手術(shù)切除松果體可以阻止性腺萎縮。這些發(fā)現(xiàn)指出了光周期、松果體活動(dòng)和生殖之間的關(guān)系。隨后的幾年中，在與生殖有關(guān)的代謝中均發(fā)現(xiàn)褪黑素，證明了褪黑素可能具有控制季節(jié)性生殖的復(fù)雜作用。

通過(guò)對(duì)收集的人卵巢排卵前的卵巢液進(jìn)行分析得知，卵巢液中褪黑素的含量明顯高于血清中的含量，兩者之間呈正相關(guān)。卵泡液中的褪黑素具有晝夜節(jié)律和年節(jié)律，這可能與人類的生育特性有關(guān)[23]。人類的卵泡細(xì)胞中含有褪黑素和MT1，MT2 mRNA則存在于人類的顆粒細(xì)胞中。與未成熟卵泡相比，成熟卵泡中含有大量褪黑素，褪黑素含量與孕酮的產(chǎn)生呈正相關(guān)，表明褪黑素對(duì)人類生殖和局部類固醇生成具有調(diào)節(jié)作用。褪黑素可能在顆粒細(xì)胞中合成并釋放到卵泡液中，在卵泡液中濃縮，在卵巢中沒(méi)有檢測(cè)到AANAT mRNA，表明卵巢褪黑素來(lái)自血液。但是，隨后報(bào)道的大鼠卵巢中AANAT和ASMT活性的存在，表明卵巢中也可以產(chǎn)生褪黑素。AANAT和ASMT的動(dòng)力學(xué)分析的數(shù)據(jù)與松果腺Kms的數(shù)據(jù)相近，表明卵巢確實(shí)可以合成褪黑素。AANAT和ASMT的活性也在大鼠睪丸中檢測(cè)到，在間質(zhì)細(xì)胞的活性最高，在曲細(xì)精管的活性最低。睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的高水平血清素，以及在這些細(xì)胞中存在的褪黑素結(jié)合位點(diǎn)，都與睪丸中褪黑素的合成以及在睪丸中發(fā)揮的特定作用一致。褪黑素在卵巢和睪丸的多個(gè)部位的合成和表達(dá)反映了其潛在的生殖生理內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)，從而保證了卵子和精子的質(zhì)量?，F(xiàn)在已經(jīng)確定褪黑素是由卵巢產(chǎn)生并作用于卵巢，從而控制其功能，在這種情況下，推測(cè)褪黑素有助于提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而提高生物繁衍后代的能力。

3 體液中的褪黑素

生物體液中也存在褪黑素，其濃度很高，有時(shí)甚至高于血清中的濃度。現(xiàn)在可以檢測(cè)到褪黑素的體液包括腦脊液、唾液、膽汁、母乳和羊水等，但是這些體液中褪黑素的來(lái)源及其功能仍不清楚。

3.1 腦脊液中的褪黑素

腦脊液中的褪黑素可能主要來(lái)源于松果體。腦脊液中褪黑素的晝夜節(jié)律與血液中的晝夜節(jié)律一致，這支持了褪黑素直接釋放到第三靜脈并同步進(jìn)入大腦，影響神經(jīng)結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)。在綿羊和人類的第三腦室液體中檢測(cè)到的褪黑素含量最高，而側(cè)腦室中的濃度較低。腦脊液中至少有一部分褪黑素是從松果體隱窩直接排入綿羊的第三腦室。人類研究也顯示褪黑素可能通過(guò)松果體隱窩直接進(jìn)入腦脊液。腦脊液中的褪黑素水平隨著血液的波動(dòng)而波動(dòng)，晝夜節(jié)律在夜間達(dá)到高峰，白天達(dá)到最低水平。據(jù)報(bào)道，綿羊腦脊液中夜間褪黑素水平比血漿高幾百倍，因?yàn)樗鼪](méi)有在腦脊液中代謝，所以它保持在更高的水平。然而，在人類身上，由于晝夜采集腦脊液樣本的困難，沒(méi)有明確的數(shù)據(jù)可供分析。

3.2 膽汁中的褪黑素

目前清楚的是，一部分循環(huán)的褪黑素來(lái)自肝門脈肝內(nèi)腸上皮細(xì)胞，它保護(hù)肝臟和膽道免受各種刺激，輸送到膽道系統(tǒng)的褪黑素的數(shù)量取決于肝臟褪黑素的含量及其在肝臟內(nèi)的分解代謝[24]。雖然褪黑素通過(guò)肝臟代謝的確切比例尚不清楚，但有研究表明這取決于血液中褪黑素的濃度。因此，肝臟內(nèi)褪黑素濃度低于白天的褪黑素濃度，肝臟不會(huì)代謝褪黑素。反之，隨著濃度的升高，分解代謝會(huì)增加。除了已知的肝臟分解代謝活動(dòng)外，肝臟褪黑素分解代謝的意義還有待討論。大部分褪黑素從肝臟代謝中滲出，通過(guò)膽汁排出體外。許多物種，包括大鼠、豚鼠、兔子、豬、猴和人類，其膽汁中都含有高達(dá)11 000 pg/mL的褪黑素。這些值比GIT中高40倍，比白天血清中褪黑素濃度高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。Messner等人也檢測(cè)到人通過(guò)膽汁排出的大量褪黑素(51 ng/24 h)。同時(shí)，有新的數(shù)據(jù)表明肝臟也可以合成褪黑素，因?yàn)楦渭?xì)胞中含有AANAT和ASMT，并且它們還能與色氨酸或其他褪黑素的代謝前體相接觸。

3.3 唾液中的褪黑素

許多激素、肽和其他分子會(huì)從血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到唾液中。唾液腺也能轉(zhuǎn)化或激活不活躍的激素。唾液中的褪黑素是血漿經(jīng)唾液腺超濾后，從而進(jìn)入口腔的，也可以說(shuō)，這些腺體可以產(chǎn)生褪黑素。通過(guò)免疫組化分析顯示大鼠唾液腺內(nèi)存在褪黑素,以及這種吲哚胺在唾液中的累積情況。

AANAT存在于大鼠腮腺、頜下腺和舌下腺的橫紋管上皮細(xì)胞中，也存在于人類頜下腺。此外，大鼠口腔黏膜和腮腺也表達(dá)MT1和MT2受體，褪黑素的合成可能發(fā)生在唾液腺，在那里它可能有旁分泌或自分泌的作用。

褪黑素通過(guò)唾液分泌，其濃度約為血清濃度的30%，這與血液中游離的褪黑素濃度相對(duì)應(yīng)。因此，唾液中的褪黑素取決于血清水平，它的晝夜節(jié)律與血清中的晝夜節(jié)律非常相似。關(guān)于唾液中褪黑素的功能，有觀點(diǎn)認(rèn)為它可能通過(guò)一種與nNOS依賴機(jī)制有關(guān)的機(jī)制來(lái)控制大鼠腮腺蛋白質(zhì)的合成。雖然這些蛋白質(zhì)的具體性質(zhì)尚未確定，但褪黑素在口腔中的保護(hù)作用表明，它可能參與誘導(dǎo)口腔防御蛋白質(zhì)的合成。

3.4 羊水中的褪黑素

懷孕和分娩期間，羊水中的褪黑素含量很低。在人類生育過(guò)程中，血清褪黑素與羊水褪黑素呈正相關(guān)，雖然褪黑素水平低于血清，但也存在晝夜節(jié)律[25]。褪黑素的濃度與分娩時(shí)的生理壓力或其他與之相關(guān)的內(nèi)分泌變化是無(wú)關(guān)的。研究人員認(rèn)為羊水中褪黑素濃度升高是胎兒出現(xiàn)致畸的內(nèi)分泌標(biāo)志物。此外，在妊娠小鼠中，褪黑素給藥可顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的宮內(nèi)胎兒死亡和生長(zhǎng)遲緩的作用，而不改變羊水中TNF-α和IL-1β的水平。與此同時(shí)，給孕婦服用褪黑素沒(méi)有副作用，反而起改善和保護(hù)胎兒的作用。盡管如此，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估褪黑素在羊水中的作用。

3.5 母乳中的褪黑素

母親分娩后，3 d～4 d的母乳中能夠鑒定出褪黑素。雖然在白天沒(méi)有檢測(cè)到褪黑素，但晚上可以測(cè)量，其值比血清低3倍。因?yàn)樾律鷥旱乃晒w不會(huì)有節(jié)奏地產(chǎn)生褪黑素,母乳中的褪黑素晝夜節(jié)律可能對(duì)新生兒起到時(shí)間生物調(diào)節(jié)作用[26]。Cubero等人驗(yàn)證了這一假設(shè)。他們測(cè)定了16名12周大的嬰兒所食用的母乳中色氨酸的含量。這些嬰兒被分為兩組，分別為自然喂養(yǎng)和人工喂養(yǎng)。母乳中的色氨酸含量在凌晨3點(diǎn)達(dá)到晝夜節(jié)律峰值，這與母乳喂養(yǎng)的這些嬰兒尿中6-硫氧基褪黑素的排泄相一致。人工喂養(yǎng)的新生兒睡眠質(zhì)量顯著下降，說(shuō)明母乳中色氨酸的變化與新生兒睡眠效率有關(guān)。因此，母乳中的褪黑素、色氨酸的變化均可作為時(shí)間生物信號(hào)，可以向母乳喂養(yǎng)的嬰兒傳達(dá)一天中的時(shí)間信息，從而鞏固睡眠-覺(jué)醒節(jié)律。一旦新生兒晝夜節(jié)律系統(tǒng)成熟，就會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性褪黑素，并提供自體時(shí)間生物學(xué)信息。

牛奶中的褪黑素可能對(duì)新生兒的健康有其他重要影響。在一項(xiàng)調(diào)查嬰兒絞痛和睡眠障礙的病因的研究中，發(fā)現(xiàn)純母乳喂養(yǎng)的嬰兒發(fā)生絞痛的可能性明顯低于人工母乳喂養(yǎng)的嬰兒，夜間睡眠時(shí)間有延長(zhǎng)的趨勢(shì)。顯然，母乳中的褪黑素是一種潛在的時(shí)間生物品。因此母乳喂養(yǎng)為新生兒提供了一個(gè)與外界時(shí)間同步的介質(zhì)。

4 褪黑素的安全性及毒性研究

褪黑素是一種非常安全的分子[27]。生物體內(nèi)的內(nèi)源性生理褪黑素水平降低比其過(guò)量或長(zhǎng)期使用會(huì)造成更大的機(jī)體損害。Jahnke等人的一項(xiàng)深入研究揭示了高劑量褪黑素的低毒性。在這項(xiàng)研究中，這些異常大量的褪黑素沒(méi)有以任何明顯的方式影響妊娠。這些劑量的褪黑素超過(guò)了睡眠誘導(dǎo)推薦劑量的7萬(wàn)倍。對(duì)于使用了最高劑量的動(dòng)物，所產(chǎn)生的負(fù)面影響是輕微的[28,29]。

褪黑素給人注射1個(gè)月，注射劑量相對(duì)較高，在研究結(jié)束時(shí)，他們測(cè)量了一些血液和內(nèi)分泌參數(shù)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)并報(bào)告任何異常情況[30]。受試者有一些嗜睡的癥狀，但是對(duì)眼睛、肝臟、腎臟和骨髓的全面檢查中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性的產(chǎn)生。但是每天急性服用1 g褪黑素肯定會(huì)導(dǎo)致血液中這種吲哚胺的藥理濃度極高。

褪黑素在一些國(guó)家被廣泛作為非處方藥使用，在另一些國(guó)家則被作為處方藥使用。另外，暫時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有相關(guān)疾病與長(zhǎng)期使用褪黑素有關(guān)。

短期使用褪黑素也會(huì)發(fā)生一些副作用，這些反應(yīng)在人們的意料之中，因?yàn)樵谀承┣闆r下，每一種分子偶爾都會(huì)發(fā)生一種副作用。

5 結(jié)論

褪黑素在體內(nèi)多個(gè)合成位點(diǎn)可能反映了一種適應(yīng)機(jī)制，貫穿整個(gè)進(jìn)化過(guò)程。身體的正常生理功能需要所有器官和組織之間的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。時(shí)間生物系統(tǒng)的工作是維持這些功能，并使褪黑素作為主要的內(nèi)源性同步器。褪黑素由色氨酸通過(guò)血清素產(chǎn)生，在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上是在非常古老的單細(xì)胞生物中合成，包括藍(lán)細(xì)菌、藻類和錐蟲。褪黑素在進(jìn)化早期就存在，這表明它對(duì)細(xì)胞生理的重要性。原始細(xì)胞可能形成了一種防御機(jī)制，以對(duì)抗紫外線誘導(dǎo)的自由基生成，將色氨酸分解成一系列具有抗氧化特性的代謝物。其中，褪黑素可能是最有效的抗氧化劑，因?yàn)樗梢源x到其他抗氧化代謝物AFMK和AMK中，所以原始細(xì)胞利用褪黑素抗氧化劑會(huì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)。如果這些細(xì)胞以恒定的速率產(chǎn)生褪黑素，當(dāng)白天大部分紫外線照射發(fā)生時(shí)，由于褪黑素的清除活性，其細(xì)胞內(nèi)濃度可能會(huì)下降，這可能是褪黑素晝夜節(jié)律的起源。時(shí)間生物和清除自由基這兩種作用，在進(jìn)化過(guò)程中與褪黑素有關(guān)。褪黑素在機(jī)體適應(yīng)環(huán)境方面的功效可能是因?yàn)橥屎谒啬壳罢趫?zhí)行相似的功能，而且它的化學(xué)結(jié)構(gòu)在數(shù)十億年的進(jìn)化過(guò)程中一直沒(méi)有改變。

基于這些考慮，我們可以假設(shè)褪黑素在體內(nèi)具有雙重作用，同步機(jī)體功能和保護(hù)細(xì)胞免受氧化或抗炎癥損傷。這就解釋了為什么松果體外的褪黑素與松果體的作用方式不同，并且具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。雖然松果體產(chǎn)生的褪黑素可能在一定程度上調(diào)節(jié)松果體外褪黑素的合成，但后者可能還受到其他機(jī)制的控制，包括細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)等。此外，褪黑素的抗氧化和抗炎特性需要比松果體產(chǎn)生和釋放更高濃度的吲哚胺，這也解釋了與血清水平相比，為什么組織和器官水平中褪黑素的濃度更高。

另一個(gè)重要的考慮因素是褪黑素的臨床相關(guān)性。由于細(xì)胞中需要高含量的褪黑素來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用，因此，為了治療目的，可能需要高劑量褪黑素在血液中產(chǎn)生藥理水平，在亞細(xì)胞組分中產(chǎn)生生理相關(guān)水平。這些劑量是褪黑素細(xì)胞內(nèi)治療靶點(diǎn)飽和所必需的。研究褪黑素在不同亞細(xì)胞水平上的合成、代謝和作用的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于更好地理解其臨床應(yīng)用是有必要的?？紤]到在給予高劑量的褪黑素時(shí)可能會(huì)造成一些晝夜節(jié)律的破壞，所以必須選擇正確的給藥時(shí)間。此外，當(dāng)使用高治療劑量的褪黑素時(shí)，首先考慮的是抵消氧化或炎癥應(yīng)激。一旦達(dá)到正常狀態(tài)，就需要減少褪黑素的劑量來(lái)恢復(fù)晝夜節(jié)律紊亂。