田新岳，張 雯，馬春芳，吳春燕，邵 倩，崔生玲，楊 奇，余永濤*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750004)

酒石酸泰萬(wàn)菌素(tyvanillin tartrate)是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、豬丹毒絲菌、李斯特氏菌、腐敗梭菌、氣腫疽梭菌等均有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)雞毒支原體和滑液囊支原體也具有較強(qiáng)的抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于雞、豬支原體病，豬回腸炎和慢性肺阻塞豬藍(lán)耳病等的治療[1-5]。此外，酒石酸泰萬(wàn)菌素還具有抗炎作用[6]。

酒石酸泰萬(wàn)菌素是一種微生物發(fā)酵合成的抗生素，由酒石酸泰萬(wàn)菌素A、酒石酸泰萬(wàn)菌素B、酒石酸泰萬(wàn)菌素C和酒石酸泰萬(wàn)菌素D組成，其主要成分為酒石酸泰萬(wàn)菌素A。2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中收錄的酒石酸泰萬(wàn)菌素劑型有酒石酸泰萬(wàn)菌素可溶性粉、酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑[7]，其中酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑由酒石酸泰萬(wàn)菌素和脫脂米糠或脫脂大豆粉混合而成。各種劑型中酒石酸泰萬(wàn)菌素的含量測(cè)定方法是抗生素微生物檢定法(管碟法)。該方法操作步驟繁雜、影響因素較多，準(zhǔn)確度和重復(fù)性與高效液相色譜法(HPLC)等化學(xué)方法相比較差，近些年有逐漸被HPLC等其他方法替代的趨勢(shì)[8-9]。但是該法采用活菌檢測(cè)，靈敏度高，能直接顯示抗生素的抗菌活性[10]，特別是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的多種組分抗生素如酒石酸泰樂菌素、大觀霉素、慶大霉素等[11]，仍主要采用該法來測(cè)定其含量。酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑生產(chǎn)工藝和原輔料的差異會(huì)對(duì)酒石酸泰萬(wàn)菌素含量的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生重要影響，其影響因素有試驗(yàn)設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)品含量、稱樣量、稀釋步驟[12]，不同菌懸液濃度也會(huì)造成抑菌圈大小、形狀的改變，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。獸藥質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適用于檢測(cè)要求，只有經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證的檢測(cè)方法才能應(yīng)用于藥品含量檢測(cè)[11,13]。根據(jù)《中國(guó)獸藥典》(2025版)的修訂要求，需要對(duì)抗生素微生物檢定法測(cè)定酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑中酒石酸泰萬(wàn)菌素含量的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，從而為酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑的含量檢測(cè)提供可靠的技術(shù)保證。

因此，本研究采用抗生素微生物檢定法對(duì)預(yù)混劑中酒石酸泰萬(wàn)菌素含量測(cè)定方法進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、耐用性等方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)初始菌液濃度、超聲提取時(shí)間等影響因素進(jìn)行考察，最后應(yīng)用方法學(xué)驗(yàn)證過的方法對(duì)酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑樣品進(jìn)行含量測(cè)定，以期為酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑中酒石酸泰萬(wàn)菌素含量測(cè)定方法的修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑 泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品(822 IU/mg，批號(hào)k0691908)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；藤黃微球菌[CMCC28001]，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑(批號(hào)20200931)，湖北回盛生物科技有限公司產(chǎn)品；抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(pH7.8～8.0)，分別購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司、北京陸橋技術(shù)股份有限公司、北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 抑菌圈自動(dòng)測(cè)量分析儀(ZY-300IV)、牛津杯自動(dòng)放置器(ZY-300G)，購(gòu)自北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；電子天平(UAE100、AE240)，F(xiàn)28-pH計(jì)，購(gòu)自上海梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲清洗儀(KQ-250B)，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；電熱水浴鍋，購(gòu)自樹立儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液與雙碟的制備

1.2.1.1 泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品30.41 mg于25 mL容量瓶中，加700 mL/L甲醇制成1000 IU/mL的泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密量取5 mL泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液到50 mL容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖液(pH8.0)稀釋定容至刻度線，分別精密量取稀釋后的溶液5 mL，加入50 mL和100 mL容量瓶中，然后在容量瓶中加入磷酸鹽緩沖液稀釋并定容，制成5 IU/mL(SL)、10 IU/mL(SH)的泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.1.3 酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑供試品溶液的制備 精密稱取20%規(guī)格的酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑125 mg于25 mL容量瓶中，加入適量700 mL/L甲醇超聲，恢復(fù)室溫后定容離心，制成1000 IU/mL的溶液。精密量取5 mL 1000 IU/mL的溶液于50 mL容量瓶中，在容量瓶中加入磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)稀釋定容，分別精密量取5 mL稀釋后的溶液到50 mL和100 mL容量瓶中，在容量瓶中加入磷酸鹽緩沖液定容稀釋制成5 IU/mL(TL)、10 IU/mL(TH)的供試品溶液。

1.2.1.4 磷酸鹽緩沖液(pH8.0)的制備 取磷酸氫二鉀9.8 g、磷酸二氫鉀0.2 g，加水至1000 mL，過濾，115℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻備用。

1.2.1.5 雙碟的制備 取直徑約90 mm、高17 mm的一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿，注入115℃高壓蒸汽滅菌30 min的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(pH7.8～8.0)培養(yǎng)基20 mL，使其在培養(yǎng)皿內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)面上待其凝固，作為底層培養(yǎng)基。另取適量同種培養(yǎng)基115℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻至53℃后加入試驗(yàn)菌懸液并混勻，然后將含菌培養(yǎng)基在每個(gè)培養(yǎng)皿加入5 mL，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。用牛津杯自動(dòng)放置器在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置牛津杯，并用陶瓦圓蓋覆蓋備用。

1.2.2 菌懸液的制備和含菌培養(yǎng)基的制備 菌懸液的制備：取藤黃微球菌CMCC28001營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，將藤黃微球菌Ⅱ代甘油保存液接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于26℃培養(yǎng)24 h，用適量9 g/L生理鹽水將菌苔洗下，將其以1 mL/個(gè)的比例繼續(xù)接種于新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物繼續(xù)在26℃培養(yǎng)24 h,加入適9 g/L生理鹽水將菌苔洗下，置于4℃冰箱備用，儲(chǔ)存時(shí)間不得超過7 d。

含菌培養(yǎng)基的制備：取抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號(hào)(pH7.8～8.0)溶解，115℃高壓蒸汽滅菌30 min，在53℃左右加入適量菌懸液，振蕩搖勻備用。

1.2.3 最適菌液濃度的確定 分別以0.5、1、2、3、4、5、6 mL藤黃微球菌懸液加入100 mL培養(yǎng)基內(nèi)配制7種不同濃度的菌層培養(yǎng)基，配制高低濃度分別為10 IU/mL和5 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液，按照SH→TH→TL→SL的順序加入稀釋后的抗生素溶液，觀察形成抑菌圈的情況，用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌圈大小(應(yīng)在在18 mm～22 mm之間)。

1.2.4 線性考察 精密稱取泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用700 mL/L甲醇配制成1000 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取該溶液5 mL至100 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液(pH8.0)稀釋制成100 IU/mL的溶液。再分別精密吸取2.64、3.30、4.13、5.00、6.25、8.0、10.00、12.50 mL 100 IU/mL的溶液至100 mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH8.0)稀釋至刻度線，制成中間濃度為5 IU/mL及C1-8(2.64、3.30、4.13、5.00、6.25、8.05、10.00、12.05 IU/mL)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取雙碟24個(gè)，每碟中間隔的2管分別加入5 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，將每3個(gè)雙碟分成一組，共8組，依次加樣，置37℃培養(yǎng)16 h，測(cè)量抑菌圈直徑。以濃度(C，IU/mL)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，抑菌圈直徑相對(duì)應(yīng)各濃度的直徑與中心點(diǎn)濃度直徑的差值(D，mm)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，確定線性范圍。

1.2.5 超聲處理時(shí)間的確定 精密稱取20%規(guī)格的酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑125 mg于25 mL容量瓶中，加700 mL/L甲醇溶液適量，分別用超聲處理10、15、20 min，放冷，按照1.2.1.3配置供試品溶液，按照抗生素微生物檢定法[11]測(cè)定，對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，確定適宜的超聲處理時(shí)間。

1.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(回收率試驗(yàn)) 精密稱取泰萬(wàn)菌素標(biāo)準(zhǔn)品適量，按比例(每1 mg含有1000 IU酒石酸泰萬(wàn)菌素)加入輔料，制成濃度相當(dāng)于標(biāo)示量80%、100%、120%的供試品溶液。根據(jù)抗生素微生物檢定法方法進(jìn)行測(cè)定，比較結(jié)果，計(jì)算回收率。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 精密稱取相同質(zhì)量的供試品6份進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算RSD。

1.2.8 專屬性試驗(yàn) 用樣品中除酒石酸泰萬(wàn)菌素以外的輔料替代抗生素進(jìn)行試驗(yàn)，觀察測(cè)量是否出現(xiàn)抑菌圈。

1.2.9 耐用性 耐用性是采用單因素分析法對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間、不同廠家培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，比較測(cè)定結(jié)果，計(jì)算RSD。

培養(yǎng)時(shí)間的考察：分別培養(yǎng)14 h、16 h、20 h后，按照抗生素微生物檢定法對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，比較結(jié)果。

不同廠家培養(yǎng)基的考察：分別使用3個(gè)不同廠家相同類型的抗生素檢定培養(yǎng)基(Ⅱ號(hào)高pH)，按照抗生素微生物檢定法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，比較結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 最適菌液濃度

分別以0.5、1、2、3、4、5、6 mL藤黃微球菌懸液加入100 mL培養(yǎng)基內(nèi)配制7種不同濃度的菌層培養(yǎng)基，配制高低濃度分別為10 IU/mL和5 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液，觀察形成抑菌圈的情況，測(cè)量抑菌圈大小，結(jié)果見表1。

表1 加菌量與抑菌圈的關(guān)系Table 1 Relationship between adding amount of bacteria and inhibition zone

2020版《中國(guó)獸藥典》附錄1201抗生素微生物檢定法[11]規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液高劑量抑菌圈直徑需在18 mm～22 mm范圍內(nèi)，要保證每次高劑量的抑菌圈在20 mm左右，本試驗(yàn)選擇3 mL為加菌量。

2.2 線性

以各濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)各濃度的直徑與中心點(diǎn)濃度直徑的差值為縱坐標(biāo)作線性分析，得線性圖見圖1?；貧w方程y=0.760 8+0.159 5(x-16.927 5)，相關(guān)系數(shù)R2為0.996 6。當(dāng)酒石酸泰萬(wàn)菌素濃度在2 IU/mL～10 IU/mL的范圍時(shí)濃度對(duì)數(shù)值與直徑差值成良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=8)Fig.1 Standard curve (n=8)

2.3 最適超聲處理時(shí)間

不同超聲處理時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大(表2)。不同的超聲處理時(shí)間，對(duì)抗生素含量檢測(cè)影響較大，可能原因是當(dāng)超聲處理10 min時(shí)，藥品溶解不充分，供試品含量低于標(biāo)準(zhǔn)品溶液；當(dāng)超聲處理20 min時(shí)，由于處理時(shí)間過長(zhǎng)，藥品隨著甲醇蒸發(fā)，導(dǎo)致供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度差距大，偏離平行。所以，當(dāng)超聲處理15 min，測(cè)得結(jié)果最為準(zhǔn)確，可信限率不超過5%，標(biāo)示量在90%～110%之間，此時(shí)藥品溶解最也較為充分。

表2 不同超聲時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響Table 2 Influence of different ultrasonic time on the results

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(回收率試驗(yàn))

20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑含量測(cè)定的準(zhǔn)確度結(jié)果見表3，標(biāo)示量為80%、100%、120%的樣品回收率在98%～101%范圍內(nèi)，平均回收率為100.24%，RSD為1.21%，結(jié)果符合2020版《中國(guó)獸藥典》附錄9101獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[11]，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加樣回收率結(jié)果Table 3 Result of sample recovery

2.5 精密度試驗(yàn)

20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑含量測(cè)定的6次結(jié)果平均含量為標(biāo)示量的102.9%，RSD為1.15%，精密度良好，結(jié)果見表4。

表4 20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑含量測(cè)定的精密度結(jié)果Table 4 Precision result of the determination of 20% tylvalosin tartrate premix

2.6 專屬性試驗(yàn)

用輔料脫脂米糠代替酒石酸泰萬(wàn)菌素進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果未出現(xiàn)抑菌圈。結(jié)果表明，輔料對(duì)結(jié)果測(cè)定無(wú)影響，表明本方法專屬性良好。

2.7 耐用性

采用單因素分析法分析不同培養(yǎng)時(shí)間、不同廠家培養(yǎng)基對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。不同培養(yǎng)時(shí)間結(jié)果RSD為1.94%，表明不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小(表5)。3個(gè)廠家的培養(yǎng)基結(jié)果RSD為0.20%，表明不同廠家培養(yǎng)基對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小，見表6。這些數(shù)據(jù)表明本方法耐用性良好。

表5 20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑不同培養(yǎng)時(shí)間的含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Content determination results of 20% tylvalosin tartrate premix at different incubation times

表6 20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑不同培養(yǎng)基的含量測(cè)定結(jié)果Table 6 Content determination results of 20% tylvalosin tartrate premix in different culture media

2.8 樣品含量測(cè)定

對(duì)4個(gè)廠家5個(gè)批次的酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑，按上述方法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表7，標(biāo)示量在90%～110%之間，可信限率不得超過5%，均符合2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。

3 討論

本研究采用抗生素微生物檢定法對(duì)酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑的有效含量進(jìn)行測(cè)定，選擇菌液濃度為每100 mL培養(yǎng)基加3 mL菌懸液，超聲時(shí)間15 min時(shí)藥品溶解最好。酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑在2 IU/mL～10 IU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性，線性方程為y=0.760 8+0.159 5(x-16.927 5)，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 6，具有很高的顯著性，20%酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑含量測(cè)定的準(zhǔn)確度結(jié)果見表3，樣品回收率在98%～101%范圍內(nèi)，平均回收率為100.24%，RSD為1.21%，精密度結(jié)果平均含量為標(biāo)示量的102.9%，RSD為1.15%，結(jié)果見表4。專屬性試驗(yàn)結(jié)果未出現(xiàn)抑菌圈，表明輔料對(duì)抗生素微生物檢定法的結(jié)果測(cè)定無(wú)影響。不同培養(yǎng)時(shí)間含量測(cè)定結(jié)果RSD為1.94%，表明不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。3個(gè)廠家的培養(yǎng)基含量測(cè)定結(jié)果RSD為0.20%，表明不同廠家培養(yǎng)基對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響較小。由于不同培養(yǎng)時(shí)間和不同廠家的培養(yǎng)基對(duì)結(jié)果測(cè)定影響較小，所以該方法耐用良好。目前有關(guān)酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑的含量測(cè)定尚未見文獻(xiàn)，本研究對(duì)酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑的含量測(cè)定進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、方法耐用性等研究，以期為酒石酸泰萬(wàn)菌素預(yù)混劑的含量測(cè)定提供技術(shù)支持。

抗生素微生物檢定法操作復(fù)雜，耗時(shí)，易受環(huán)境影響，影響因素有很多，比如實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不水平[14]，如果臺(tái)面不水平會(huì)導(dǎo)致雙碟底層和菌層不平整，使得抑菌圈不完整；牛津杯[15]的重量大小也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，所以要選擇重量一致的牛津杯，避免牛津杯重量不一致使得抗生素在瓊脂中擴(kuò)散不均勻引起試驗(yàn)誤差。制備菌層時(shí)，菌層培養(yǎng)基溫度過高會(huì)導(dǎo)致加入的藤黃微球菌失活；如果溫度過低，又會(huì)導(dǎo)致菌層凝結(jié)成塊[16]，所以當(dāng)其培養(yǎng)基溫度在53℃時(shí)加入菌懸液制備菌層既保證了藤黃微球菌的生物活性，又防止了菌層凝結(jié)而影響試驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)品在稱量時(shí)要在室溫平衡半小時(shí)以保證稱量的準(zhǔn)確[17]。張文剛[12]對(duì)抗生素微生物檢定法測(cè)定酒石酸泰萬(wàn)菌素的不確定度進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)要盡可能減少稀釋步驟，三步稀釋最佳，所以我們?cè)谠囼?yàn)時(shí)采用三步稀釋并在稀釋過程中精密準(zhǔn)確?？股氐奈⑸餀z定法操作復(fù)雜，每一個(gè)因素都有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以我們?cè)谶M(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，要在水平的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上進(jìn)行操作，控制菌層溫度，精準(zhǔn)稱量標(biāo)準(zhǔn)品和供試品，稀釋時(shí)精密量取準(zhǔn)確定容以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。