劉愛瑜 田 軍 趙心念 李永亮 李曉宇 趙俐辰高玉紅* 康新陽 張會文

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定071000；2.豐寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，承德067000；3.承德市獸藥管理站，承德067000)

隨著我國“飼料全面禁抗”的實施，安全、無耐藥性且益生效果好的益生菌成為飼用抗生素的重要替代品。乳酸菌作為腸道中的原籍菌群，參與宿主正常的代謝生理活動，被公認(rèn)為是益生菌制劑的重要來源。理想的益生菌種往往來源于動物腸道[1-2]，例如，來源于兔腸道[3]和牦牛腸道[4]的乳酸片球菌和植物乳植桿菌可有效提高飼料利用率，來源于番鴨腸道[5]的唾液乳桿菌對Caco-2細(xì)胞有較高的黏附力。對于羊胃腸道益生菌的分離及應(yīng)用研究也有相關(guān)報道。湯凱等[6]、郝賀等[7]和何江波[8]已從健康成年的山羊胃腸道中分離出植物乳植桿菌、杜氏腸球菌、海氏腸球菌等益生菌。羊的消化道菌群往往隨著日齡的增長而發(fā)生變化，哺乳期羔羊消化道微生物區(qū)系不健全，隨著日齡的增長，微生物種類與數(shù)量逐漸增加，成年后微生物區(qū)系趨于穩(wěn)定[9]。徐鳳等[10]從不同日齡的山羊瘤胃和回腸中分離出不同種類的菌株，在2月齡瘤胃和回腸中分離的菌種分別為巴黎鏈球菌和屎腸球菌，而在8月齡瘤胃中分離的菌種增加了耐久腸球菌和彎曲乳桿菌，在回腸中分離出了腸膜明串珠菌；隨著年齡的增長，2歲山羊瘤胃中分離出的菌種又增加了戊糖片球菌、海氏腸球菌和鶉雞腸球菌，回腸中增加了糞腸球菌。

隨著肉羊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，高強度育肥引起的腸道健康問題已逐漸暴露，飼料利用率降低也是肉羊育肥期普遍存在的問題，有針對性的篩選并開發(fā)飼用益生菌尤為重要。目前從育肥后期綿羊的瘤胃和腸道同時分離乳酸菌并進(jìn)行比較分析的報道很少。本研究采用常規(guī)細(xì)菌分離篩選和鑒定技術(shù)，結(jié)合16S rRNA基因測序技術(shù)，擬從育肥期綿羊瘤胃和不同腸段內(nèi)容物中分離、篩選并鑒定以獲取安全、可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌、藥敏性較廣泛且耐受胃腸液的羊源乳酸菌菌株，以期為飼用益生菌的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

選擇10～14只8月齡的健康育肥羊[體重 (60±5) kg]，采集瘤胃和不同腸段(空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸)的內(nèi)容物放入滅菌管，密封，利用冰盒帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)操作。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒，青島海博生物有限公司；脫纖維羊血；北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片，常德比克曼生物科技有限公司；羊膽鹽、胃蛋白酶和胰蛋白酶，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

模擬人工胃液[11]：3.1 g/L NaCl，1.1 g/L KCl，0.15 g/L CaCl2·2H2O，0.6 g/L NaHCO3，調(diào)節(jié)pH為3.0，在超凈臺內(nèi)加入胃蛋白酶10 g/L。

模擬人工腸液[11]：稱取6.8 g KH2PO4溶解于500 mL水中，用NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH至6.8，在超凈臺內(nèi)加入胰蛋白酶10 g/L。

1.1.3 供試菌株

用于抑菌試驗的大腸桿菌(K88)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌分離純化

取消化道內(nèi)容物1 g，稀釋后恒溫振蕩1～2 h，靜置。選擇10-5、10-6、10-73個稀釋度的菌液各吸取50 μL均勻涂布于CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基平板，每個稀釋度2個平行，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)特征，選取有透明圈的單菌落劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中純化，重復(fù)純化，直至獲取純化菌落。

1.2.2 乳酸菌初篩

乳酸菌初篩采用過氧化氫酶試驗和產(chǎn)硫化氫試驗。挑取分離純化后的單菌落置于載玻片上，滴加1～2滴3%過氧化氫，靜置0.5 min，篩選不產(chǎn)氣泡的細(xì)菌(陰性)，用接種針穿刺接種于硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，篩選接種針通過處未出現(xiàn)黑色的細(xì)菌(陰性)。

1.2.3 乳酸菌復(fù)篩

將初篩后的菌落再次純化劃線，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行溶血試驗，使用移液槍點種于血瓊脂培養(yǎng)基上，每種菌在同一個平板上點種3次，然后37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察，篩選出無溶血現(xiàn)象的安全菌株。

1.2.4 乳酸菌形態(tài)學(xué)鑒定

采用革蘭氏染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。挑取生長良好的復(fù)篩菌落，進(jìn)行革蘭染色，然后鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.2.5 乳酸菌生化鑒定

對分離菌株按細(xì)菌微量生化鑒定管使用說明書進(jìn)行糖(醇)類發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗等各項生化鑒定，并記錄試驗結(jié)果。

1.2.6 16S rRNA基因序列的測定

提取菌液DNA，以通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′TACGGYTACCTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴增，擴增體系為25 μL，包括：上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(稀釋20倍)1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，回收的PCR產(chǎn)物送至北京志超偉業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA測序鑒定，測序結(jié)果通過NCBI中的BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.2.7 抑菌試驗

將鑒定的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的吸光度(OD)值。將2種典型致病菌(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)的濃度控制于106～107CFU，采用稀釋涂布平板法，將病原菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，并在平板上均勻打孔(φ 0.6 cm)，每孔加入100 μL乳酸菌懸液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.2.8 藥敏試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)，將乳酸菌液均勻涂布至MRS瓊脂培養(yǎng)基中，按照梅花狀放置藥敏紙片，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。10種抗生素的種類及含量如表1所示，試驗菌株對10種抗生素的藥敏性參照NCCLS[12]對腸球菌的耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)和Charteris[13]對植物乳植桿菌的耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)。

表1 10種抗生素的種類、含量及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.9 胃腸液耐受試驗

在人工胃液耐受試驗中，將乳酸菌菌液以2%的接種量接種到人工胃液和對照培養(yǎng)基(MRS液體)中，37 ℃培養(yǎng)3 h后進(jìn)行倍比稀釋，選擇10-6和10-72個稀釋度，吸取100 μL液體涂布平板，培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)活菌數(shù)。

在人工腸液耐受試驗中，將乳酸菌菌液以2%的接種量接種到人工腸液和對照培養(yǎng)基(MRS液體)中，其余步驟同人工胃液耐受試驗。

乳酸菌存活率(%)=(試驗組培養(yǎng)基活菌數(shù)/
對照組培養(yǎng)基中的活菌數(shù))×100。

1.2.10 生長曲線的測定

將乳酸菌菌液按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)，每隔2 h測定菌液吸光度(OD)600 nm值，繪制生長曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS 20.0和GraphPad Prism軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和圖表繪制，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離結(jié)果

利用CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基分離純化的部分菌株菌落特征如圖1所示。菌落周圍產(chǎn)生了明顯的溶鈣圈(圖1-A)，說明該菌株具產(chǎn)酸能力，從不同胃腸道共分離獲取產(chǎn)酸的菌株22株，平板觀察菌株形態(tài)均為乳白色，邊緣整齊，表面光滑，不透明。

2.2 乳酸菌的篩選結(jié)果

通過過氧化氫酶和產(chǎn)硫化氫試驗結(jié)果獲取18株陰性的菌株，再通過溶血試驗復(fù)篩獲取12株安全菌株，其中空腸4株(K1、K2、K3、K4)、回腸6株(H1、H2、H3、H4、H5、H6)、直腸1株(Z1)和瘤胃1株(L1)，菌株溶血試驗結(jié)果如圖2所示，其中，圖2-A中的菌株產(chǎn)生明顯的透明圈，具溶血性，圖2-B中的菌株無溶血現(xiàn)象，為安全菌株。

圖2 菌株溶血試驗結(jié)果

2.3 乳酸菌的形態(tài)學(xué)觀察

對12株安全菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察，菌株鏡檢結(jié)果如圖3所示。12株安全菌株染色后鏡檢顏色均為藍(lán)紫色，形態(tài)為球狀，均為革蘭氏陽性菌。

2.4 乳酸菌的生化鑒定結(jié)果

本試驗分離出的12株安全菌株均可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等多種糖類，也可發(fā)酵甘露醇和山梨醇，且精氨酸雙水解酶、膽汁七葉苷試驗和甲基紅試驗均為陽性，而接觸酶試驗均為陰性。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察以及生化試驗試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn)，初步判定本試驗分離出的菌株均為腸球菌。

圖3 安全菌株的革蘭氏染色結(jié)果

2.5 乳酸菌的16S rRNA測序結(jié)果

分別提取上述12株疑似腸球菌的DNA，16S rRNA擴增后獲取的片段均在1 500 bp處出現(xiàn)無拖尾的單一條帶(圖4)，符合測序要求，將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(NCBI網(wǎng)站)，確定上述的12株菌株為腸球菌屬的海氏腸球菌(表3)。

2.6 海氏腸球菌的抑菌性

海氏腸球菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制能力(抑菌圈直徑)如表4所示。上述12株海氏腸球菌對2種典型致病菌具不同程度的抑制性。12株海氏腸球菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為7.30 ～12.30 mm(平均為9.90 mm)，以從空腸分離出的K2菌株的抑菌圈直徑最大，達(dá)(12.30±0.07) mm，顯著或極顯著高于K1、K3、K4、H1、H3、H4、H5和H6菌株(P<0.05或P<0.01)。12株海氏腸球菌對大腸桿菌的抑菌圈直徑為 6.90～9.47 mm(平均為8.43 mm)，以來自空腸的K2和K4菌株的抑菌圈直徑較大，分別為(9.43±0.04) mm和(9.47±0.10) mm，均顯著高于K3、H2和Z1菌株(P<0.05)。從表4還可看出，12株海氏腸球菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于大腸桿菌，說明這些菌株對金黃色葡萄球菌的抑制效果好于大腸桿菌。部分菌株對2種致病菌的抑菌效果如圖5所示。

2.7 海氏腸球菌的抗生素敏感性

海氏腸球菌對抗生素敏感性結(jié)果如表5所示。本試驗分離出的12株海氏腸球菌中，除了從瘤胃中分離出的L1菌株，其余11株菌株對5種抗生素(紅霉素、恩諾沙星、青霉素、強力霉菌素和環(huán)丙沙星)均具敏感性，其中對紅霉素呈高度敏感性，對強力霉菌素呈中度敏感性。另外，K2和H5菌株對新霉素也具一定的敏感性，而L1菌株只對4種抗生素(恩諾沙星、青霉素、環(huán)丙沙星、強力霉菌素)具敏感性。部分菌株對抗生素的敏感性如圖6所示。

表2 12株安全菌株的生化鑒定結(jié)果

M：DL2000DNA標(biāo)記物；1～12依次是菌株K1、K2、K3、K4、H1、H2、H3、H4、H5、H6、Z1、L1的PCR擴增產(chǎn)物。

2.8 海氏腸球的耐受性

12株海氏腸球菌在人工胃液中的存活率如圖7所示，存活率排序為：L1>K2>Z1>H5>H4>H6>K3>H2>H3>H1>K4>K1。將其存活率分為高、中、低3個水平，從瘤胃中分離出的L1菌株和從空腸中分離出的K2菌株存活率較高，分別達(dá)175.6%和173.7%，極顯著高于其他株菌(P<0.01)；中等存活率菌株為K3、H2、H3、H4、H5、H6和Z1菌株，存活率處于82.3%～123.5%，極顯著高于3株低存活率菌株(K1、K4和H1)(P<0.01)，其中K1和K4存活率未超過50%。

12株海氏腸球菌在人工腸液中的存活率如圖8所示，存活率排序為：K2>H5>K1>Z1>H6>H3>H1>L1>K4>H2>H4>K3。從空腸中分離出的K2菌株存活率最高，高達(dá)143.68%，極顯著高于其他11株菌株(P<0.01)；K1、H3、H5、H6和Z1菌株存活率處于26.25%～47.62%，極顯著高于6株低存活率菌株(H1、H2、H4、K3、K4和L1)(P<0.01)，6株低存活率菌株的存活率范圍僅為5.26%～14.17%，其中以從空腸中分離出的K3菌株存活率最低，僅為5.26%。

表3 12株安全菌株的16S rRNA序列相似性比對

表4 海氏腸球菌對致病菌的抑菌圈直徑

2.9 海氏腸球菌的生長曲線

12株海氏腸球菌的生長對數(shù)期均為2～14 h，生長2 h后繁殖速度最快，14 h后進(jìn)入生長平緩期。其中抑菌效果最強、抗生素敏感性相對另外11株菌株較廣泛且在胃腸液中存活率較高的K2菌株的生長曲線如圖9所示。

3 討 論

優(yōu)良的菌種是益生菌生產(chǎn)的先決條件，乳酸菌是重要的益生菌來源。據(jù)報道，有些乳酸菌來源于自然環(huán)境，如葡萄枝葉、高原燕麥和谷物，但由于體內(nèi)外的環(huán)境差異，這些外環(huán)境來源的益生菌在內(nèi)環(huán)境中并不能表現(xiàn)出令人滿意的效果[14-15]。也有學(xué)者認(rèn)為，理想的益生菌種常來源于動物腸道，寄主與腸道微生物長期相互適應(yīng)和選擇，使對某類動物適用的微生態(tài)制劑可能對另一類動物不產(chǎn)生效果[16-18]。本試驗從育肥后期綿羊的不同腸段和瘤胃中分離獲取益生效果好的乳酸菌，可為飼用益生菌的開發(fā)提供借鑒，但仍需后續(xù)的生產(chǎn)試驗驗證。

圖5 部分海氏腸球菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果

表5 海氏腸球菌對抗生素的抑菌圈直徑

圖6 部分海氏腸球菌對抗生素的敏感性

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

本試驗通過16S rRNA同源性分析，從育肥綿羊消化道中分離鑒定出12株乳酸菌，該菌株與海氏腸球菌參考菌株MT473361.1、LC119115.1、MT457687.1等基因相似性達(dá)99%以上，說明分離菌株為海氏腸球菌，屬于乳酸菌中的腸球菌屬，是動物胃腸道的正常菌群[19]。近幾年來，關(guān)于海氏腸球菌的報道國外多集中于細(xì)菌素的研究[19-21]，細(xì)菌素可抑制有害菌繁殖，改善腸道環(huán)境，提高動物的消化機能。

圖8 12株海氏腸球菌在人工腸液中的存活率

圖9 K2菌株的生長曲線

國內(nèi)研究多集中于該菌的發(fā)酵特性和抗衰老、降解吲哚等功能[22-25]。目前關(guān)于海氏腸球菌益生作用的研究已有文獻(xiàn)報道。張旭等[26]從野鳥中篩選出1株對多種常用抗生素敏感且具耐受性的海氏腸球菌；王佳慧等[27]從牛糞中篩選出2株具抑菌特性的海氏腸球菌；石磊等[28]從牦牛糞便中分離出1株具抗腹瀉功能的海氏腸球菌。也有研究認(rèn)為，雖然多數(shù)腸球菌可能會引起尿路、腹腔和盆腔感染[29]，但海氏腸球菌在腸球菌感染病例中僅占0.40%～3.03%[30]，為感染率最低的一種腸球菌，現(xiàn)已被國家微生物資源平臺收錄并定義為潛在益生菌。張浩[31]曾從生長期羔羊消化道分離出2株乳酸菌，分別為植物乳植桿菌和乳酸乳球菌，而本試驗從育肥后期綿羊消化道分離出的乳酸菌為海氏腸球菌，雖然不同試驗篩出的細(xì)菌種類不同，但均來自綿羊消化道主要優(yōu)勢菌門的厚壁菌門。Zhang等[32]研究表明，綿羊腸道中乳酸菌的動態(tài)分布明顯，空腸、回腸定植的菌群較為豐富。本試驗也證明，分離的12株乳酸菌中4株來自空腸，6株來自回腸。由于益生菌的功能具有菌株特異性，且效果受多種因素的影響，本試驗篩選的12株海氏腸球菌益生效果各不相同。賀曦等[33]研究認(rèn)為，從成年藏羊腸道中分離出的海氏腸球菌對紅霉素、恩諾沙星、青霉素等多種抗生素敏感，對新霉素不敏感，而本研究中源自空腸的K2菌株具有較廣泛的抗生素敏感性，對紅霉素、恩諾沙星、青霉素、強力霉菌素、環(huán)丙沙星和新霉素均具一定的敏感性，耐藥性弱，可降低耐藥基因傳播風(fēng)險。另外，海氏腸球菌能抑制多種致病菌。Arokiyaraj等[34]從水牛瘤胃分離出的海氏腸球菌能抑制銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌等多種胃腸道常見致病菌。來源于面糊[20]和貽貝[35]的海氏腸球菌可通過產(chǎn)生細(xì)菌素對致病菌產(chǎn)生較高的抑制能力。本試驗中，從育肥后期綿羊空腸內(nèi)容物中分離出的K2菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)12.30和9.47 mm，且對金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，這與賀曦等[33]從成年羊腸道中篩選出乳酸菌的抑菌效果一致。而張浩[28]從羔羊腸道篩選的乳酸菌對大腸桿菌的抑菌效果較好，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不佳，這說明不同生理階段綿羊消化道分離的益生菌益生效果不同。本試驗中分離出的K2菌株在人工腸液和人工胃液中均具較高的存活率，這與Arokiyaraj等[34]和朱惠[36]的研究結(jié)果基本一致，說明該菌株具備在宿主腸道定植的基本條件。此外，從瘤胃中分離出的L1菌株耐受人工胃液的效果較好，存活率達(dá)到了175.61%，可能是因為L1菌株來源于瘤胃液，所以能在人工胃液中較好的存活。由此可見，本試驗從育肥后期綿羊的消化道篩選出的海氏腸球菌相對哺乳期或生長前期可能具有一定的優(yōu)勢，作為飼用益生菌具有較大的潛力，但仍需進(jìn)一步研究。在我們后續(xù)的研究中將明確其是否含有毒力因子，并通過小鼠試驗開展該類菌株的體內(nèi)安全性探究，為益生菌的開發(fā)提供借鑒。

4 結(jié) 論

本試驗從育肥期綿羊胃腸道中篩選出12株安全、抑菌能力強、具有一定抗生素敏感性且能耐受胃腸液的海氏腸球菌，尤其是來源于空腸的K2菌株，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，對70%的抗生素敏感以及在胃腸液中存活率最高，其益生效果最佳，可為飼用益生菌劑的開發(fā)提供參考菌種。