張 瑞 李榮榮 王臘梅 曹陽春

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌712100)

“健康”的氧化還原狀態(tài)對于維持細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OxS)是指機體產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)的量超過抗氧化劑解毒能力的一種特殊情況[1]，通俗地講，就是指體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡后，傾向于氧化的一種病理狀態(tài)。肝臟是許多物質(zhì)進行氧化代謝的中心，因此肝臟是OxS誘導(dǎo)機體損傷的主要靶標(biāo)[2]。誘導(dǎo)肝臟發(fā)生OxS的因素有很多，例如酒精、環(huán)境污染物、藥物、輻射和溫度等[3]，這些不利因素使機體的抗氧化系統(tǒng)失衡，引發(fā)OxS，加劇肝臟氧化性損傷，從而導(dǎo)致肝臟疾病的發(fā)生，如典型的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)。

NAFLD是一種在臨床上極為常見的病理性疾病，是其他慢性肝病的主要誘因[4]。其特征是在沒有過量飲酒(一般指女性<20 g/d，男性<30 g/d)、病毒感染或可誘導(dǎo)脂質(zhì)變性藥物存在的情況下，肝細胞中出現(xiàn)大量的脂質(zhì)堆積——主要為甘油三酯(TG)。通常在超過5%的肝細胞內(nèi)檢測到脂質(zhì)液滴，就定義為NAFLD[5-6]。NAFLD涵蓋的范圍較廣，從最初的脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatosis hepatitis，NASH)發(fā)展到肝纖維化，最后發(fā)展成肝硬化和肝細胞癌[1]。

在過去的40年里，NAFLD已經(jīng)發(fā)展成為全球最為常見的慢性肝病，發(fā)病率高達25.2%[7]；在全球的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者中，NASH的患病率就高達37.3%[8]，儼然已成為全球面臨的一個公共衛(wèi)生問題。NAFLD患者往往會伴隨肥胖、T2DM、高脂血癥以及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等代謝綜合征的出現(xiàn)[9-10]。在肝細胞中脂質(zhì)的過度積累會使機體自由基過飽和，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，進而引發(fā)肝細胞氧化損傷[11]、線粒體功能障礙并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，進一步加重肝臟炎癥和肝細胞纖維化[12]。本文重點綜述了OxS誘導(dǎo)NAFLD發(fā)病的作用機制、脂質(zhì)代謝紊亂與OxS之間的聯(lián)系以及一些治療NAFLD的新興藥物，并提出了防治NAFLD潛在的分子靶點，旨在為今后防控圍產(chǎn)期奶牛能量負(fù)平衡等特殊生理狀態(tài)引起的代謝疾病，以及為畜牧養(yǎng)殖及科學(xué)研究工作提供參考依據(jù)。

1 誘導(dǎo)肝臟發(fā)生OxS的因素

1.1 自由基

生物體內(nèi)的重要物質(zhì)均處于動態(tài)平衡之中，自由基也不例外。自由基本身是機體正常的代謝產(chǎn)物，并且是維持多種重要生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。在生理情況下，機體正常運作的關(guān)鍵就在于其強大的自由基動態(tài)穩(wěn)衡機制。該機制的主要任務(wù)是清除體內(nèi)過量的自由基，但不會消除其對機體的有益作用[15]。具體而言就是在需氧生物體內(nèi)，自由基的水平既要滿足自由基履行其基本生理功能的需要，又要能夠被抗氧化系統(tǒng)所清除，而未清除掉的自由基對重要生物分子的損傷又可以被修復(fù)，即使在細胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷的情況下，還可以通過凋亡途徑被清除，不會給機體造成較大的危害[16]。此外，由一系列酶和非酶物質(zhì)組成的抗氧化防御系統(tǒng)也在維持肝臟穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮了極為重要的作用，其酶系統(tǒng)主要包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)；非酶系統(tǒng)則包括α生育酚(維生素E)、抗壞血酸(維生素C)、谷胱甘肽(GSH)、類胡蘿卜素、類黃酮和其他類型的抗氧化劑，如血紅素加氧酶-1(HO-1)和氧化還原蛋白等。

1.2 NAFLD的ROS來源

1.2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個精細的小管網(wǎng)絡(luò)，在細胞中執(zhí)行多種生物功能[17]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1(Ero1)和NOX的過程會產(chǎn)生大量ROS[18]。有研究表明，患有高同型半胱氨酸血癥(HHcy)的小鼠，其脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1α(Ero1α)的表達被上調(diào)，并加速H2O2的積累，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[19]。NOX是機體產(chǎn)生ROS的主要酶，并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間，NOX產(chǎn)生的ROS含量會顯著增加[20]。其中NOX4已被證明是NAFLD中ROS的最主要來源[21]。

1.2.2 線粒體

線粒體是哺乳動物細胞中ROS的重要來源[22]。在線粒體電子傳遞鏈的氧化磷酸化過程中會產(chǎn)生大量的ROS[23]。細胞在出現(xiàn)缺氧或有毒素侵害時，會誘導(dǎo)應(yīng)激的發(fā)生，此時大量的ROS會被迅速釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)氧化損傷[24]。此外，鈣離子(Ca2+)超負(fù)荷也會導(dǎo)致線粒體ROS的產(chǎn)生。眾所周知，Ca2+是細胞內(nèi)重要的第2信使，細胞的多項生理功能都受到的Ca2+的調(diào)控。線粒體中的Ca2+還參與誘導(dǎo)生物體最直接的能量來源——ATP的生成，并且還能誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。但在Ca2+超載時會影響到線粒體功能的正常行使，使線粒體ROS含量上升[18]，從而促使NAFLD的發(fā)生。

1.2.3 過氧化物酶體

過氧化物酶體是一種細胞器，存在于一切真核細胞中，并含有豐富的酶類，在肝細胞中的數(shù)量較多[25]。過氧化物酶體可以參與脂肪酸的α氧化、超長鏈脂肪酸的β氧化、膽汁酸和TG的生物合成以及嘌呤的分解代謝[25]，與肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。過氧化物酶體通過脂肪酸β氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A，其在脂質(zhì)信號的傳導(dǎo)過程發(fā)揮作用來促進脂質(zhì)的自噬反應(yīng)[26]。據(jù)估計，過氧化物酶體貢獻了細胞中約35%的ROS[27]，產(chǎn)生的過量ROS有助于NAFLD的發(fā)展。

2 NAFLD中的抗氧化平衡機制

NAFLD能從簡單的脂肪變性發(fā)展到脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌等多種疾病，對人類的身體健康造成巨大威脅[28]。Day等[29]提出的“二次打擊”理論為NAFLD的發(fā)病機制提供了可靠的參考依據(jù)。Tilg等[30]指出，IR是引發(fā)NAFLD的首要因素，這是由于IR會引發(fā)肝臟的能量代謝障礙，尤其是影響脂肪酸的β氧化以及脂質(zhì)從頭合成和極低密度脂蛋白(VLDL)的合成，它們與過量的游離脂肪酸(FFA)一起運送到肝臟，致使肝臟出現(xiàn)大量的脂肪堆積和脂質(zhì)的過氧化[31](FFA輸送到肝臟的量幾乎占其脂質(zhì)積累的2/3)，從而導(dǎo)致脂肪變性[32]，這通常作為NAFLD發(fā)病的“第一擊”。而OxS通常作為NAFLD發(fā)病的“第二擊”[29]。OxS通常伴隨大量的ROS，ROS能夠使線粒體呼吸鏈酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)失活，抑制膜上的Ca2+通道，誘導(dǎo)肝細胞發(fā)生損傷；此外，ROS還能誘導(dǎo)細胞因子和Fas及其配體的產(chǎn)生，加重脂質(zhì)過氧化，從而加重肝臟炎癥和肝細胞纖維化[33]。近些年，人們在這些傳統(tǒng)理論的基礎(chǔ)上，針對NAFLD的發(fā)病機理進行了補充，提出了一種新的“多次平行命中”假說，該假說指出，除了IR和OxS之外，在NAFLD發(fā)展過程中還存在其他的一些致病因素，包括輕度的慢性炎癥、遺傳和表觀遺傳造成的突變以及可能來自腸道菌群等的影響因素，這些因素可能與NAFLD中代謝綜合征的出現(xiàn)有密切的關(guān)聯(lián)[30]。

2.1 核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)在NAFLD中的作用

2.1.1 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)-Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)抗氧化通路概述

當(dāng)肝臟暴露于高含量的ROS或親電試劑時，極易發(fā)生氧化損傷，此時機體不僅會啟動一系列抗氧化防御機制來清除雜物，還會誘導(dǎo)一系列抗氧化轉(zhuǎn)錄因子的激活[34]，其中，Nrf2在響應(yīng)細胞OxS時發(fā)揮了最關(guān)鍵的作用[35]。Nrf2含有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)[36]，通常與其負(fù)調(diào)控因子Keap1結(jié)合來發(fā)揮抗氧化功能[37]。Keap1是一種同源二聚體蛋白，存在于細胞質(zhì)中，富含高度保守的半胱氨酸序列，與哺乳動物的序列同源性高達92%[38]。同時Keap1還是E3泛素連接酶的底物銜接蛋白，在穩(wěn)態(tài)條件下，Keap1和E3泛素連接酶形成Keap1-E3復(fù)合物，Nrf2被該復(fù)合物錨定在細胞質(zhì)中，隨后該復(fù)合物靶向攻擊Nrf2 N端的多個賴氨酸殘基，接著E3泛素連接酶使Nrf2發(fā)生泛素化，被泛素化的Nrf2被26S蛋白酶體降解，使胞質(zhì)中的Nrf2始終處于一個較低的水平[39-41]。當(dāng)細胞內(nèi)ROS含量上升或有親電試劑進攻時，Keap1的半胱氨酸殘基會被氧化修飾，導(dǎo)致Keap1失活，Nrf2與Keap1發(fā)生解離，從而阻斷Nrf2的泛素化降解途徑，并使其易位至細胞核中[42-43]。在細胞核中Nrf2與小Maf(sMaf)蛋白家族的成員發(fā)生異源二聚化，形成的Nrf2-sMaf二聚體以序列特異性的方式，與Nrf2下游靶基因啟動區(qū)域的ARE結(jié)合，啟動一系列抗氧化和解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄[44-45]。Nrf2在細胞核中發(fā)揮其作用后，會被酪氨酸激酶磷酸化，促進Nrf2的核輸出和在胞質(zhì)中的降解[46]。

肝臟是負(fù)責(zé)機體解毒和異種生物代謝的重要器官，具有全面系統(tǒng)的抗氧化防御機制。Keap1-Nrf2-ARE通路是肝臟發(fā)生OxS時維持細胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑，其功能是保護細胞免受由OxS引起的內(nèi)源性和外源性損傷。當(dāng)Nrf2在細胞核中大量積累時，會導(dǎo)致大量的抗氧化和Ⅱ期解毒酶基因的上調(diào)。先前的研究鑒定出了在人類細胞中的200多個受Nrf2調(diào)控的下游靶基因[47]，例如NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)、HO-1、GST、GSH-Px、CAT、SOD及谷胱甘肽還原酶(GR)等[48]。Nrf2能夠通過控制谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)的表達來維持細胞內(nèi)適當(dāng)?shù)腉SH與氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值，這2種蛋白共同催化GSH合成途徑中的限速步驟[49]。除調(diào)節(jié)GSH的水平外，Nrf2還正向調(diào)控了一些肝臟解毒過程中相關(guān)酶基因的表達，包括硫氧還蛋白1(Txn1)、硫氧還蛋白還原酶1(Txnrd1)、磺胺毒素1(Srxn1)[50]、谷胱甘肽過氧化物酶2(Gpx2)和GST[51]，這些解毒酶可以消除細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體中的H2O2、氧化硫醇和過氧自由基[52]。在許多抗氧化系統(tǒng)中NADPH被用作輔助因子，它的產(chǎn)生也受到Nrf2的調(diào)控。磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway,PPP)是細胞中NADPH的主要來源[53]，多種PPP關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄都受到Nrf2的直接調(diào)控，包括氧化性的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和磷酸葡萄糖酸脫氫酶(PGD)，以及非氧化性的轉(zhuǎn)醛縮酶1(TALDO1)和轉(zhuǎn)酮醇酶(TKT)[54]。另外，Nrf2與核中sMaf形成的二聚體復(fù)合物還在調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)、細胞自噬以及蛋白酶體活性等方面發(fā)揮了重要作用[55]。

2.1.2 Nrf2是治療NAFLD的潛在靶點

NAFLD主要表現(xiàn)為肝臟中TG的過量積累。Nrf2可以通過參與脂質(zhì)代謝來減輕肝臟的氧化損傷[52]。Nrf2介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝與細胞所處的環(huán)境以及類型有關(guān)[56]。先前的一項微陣列研究的結(jié)果顯示，無論是從遺傳學(xué)還是藥理學(xué)途徑激活Nrf2，均會導(dǎo)致抗氧化和藥物代謝以外的途徑被激活，其中包括了脂質(zhì)代謝的途徑[56]。Shin等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在喂食了高脂飲食(HFD)12周的小鼠中，肝臟Nrf2的表達顯著升高；與野生型的HFD小鼠相比，Nrf2敲除小鼠的肝臟TG含量顯著上升。Tanaka等[58]研究發(fā)現(xiàn)，在喂食HFD的小鼠中，參與肝臟脂質(zhì)分解途徑的脂肪酸β氧化相關(guān)基因的表達顯著下調(diào)。Yates等[59]在肝臟特異性Keap1敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)肝臟的FFA和TG含量顯著降低。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的激活會抑制參與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶的表達，從而緩解肝臟脂肪變性[60]。這些結(jié)果都表明了Nrf2誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄與脂肪合成之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)，Nrf2的激活可能會減少FFA的合成和脂質(zhì)積累。Nrf2還可以激活細胞中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運受體蛋白——分化簇36(CD36)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[61]。

Nrf2的激活可以改善缺乏蛋氨酸和膽堿(MCD)飲食所誘導(dǎo)的脂肪肝，抑制小鼠肝臟中成纖維細胞生長因子21(FGF21)和過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)的表達[62]，而Nrf2敲除后顯著上調(diào)了PPARα的表達[63]，這表明小鼠肝臟中Nrf2的過表達可以防止由于長期暴露于MCD而引發(fā)的OxS。Nrf2還在預(yù)防NASH中發(fā)揮了重要作用，已有研究表明激活肝臟Nrf2會降低NASH的發(fā)生率。NASH患者的數(shù)據(jù)顯示，其肝臟中Nrf2的核蛋白豐度增加，并伴隨著HO-1、Gpx2和Txn1等抗氧化基因的表達上調(diào)[64]。Tang等[65]報道，Nrf2敲除的小鼠在喂食了HFD或MCD飲食后，患NASH的概率增加。綜上所述，Nrf2在抵御肝臟的氧化性損傷中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，可作為治療NAFLD的潛在靶點。目前，一些科學(xué)研究集中在激活Nrf2的新型化合物的開發(fā)上，這對于預(yù)防和治療NAFLD具有重大意義。

2.2 核因子-κB(NF-κB)在NAFLD中的作用

2.2.1 NF-κB炎癥反應(yīng)通路概述

NF-κB是一類蛋白質(zhì)家族，由一系列轉(zhuǎn)錄因子組成，可以調(diào)節(jié)大量與免疫和炎癥相關(guān)基因的表達[66]。大量研究表明，NF-κB可以在幾乎所有的細胞類型和組織中表達，以幫助細胞適應(yīng)外部環(huán)境的變化。在機體面臨不同的外部刺激，如細胞因子、病毒、重金屬、輻射和活性氧刺激時，NF-κB會被正向激活，它調(diào)控的基因在免疫和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，并且還對細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡的過程產(chǎn)生一定的影響[67]。

NF-κB蛋白家族由5個成員組成，它們相互關(guān)聯(lián)形成了具有不同轉(zhuǎn)錄活性的同源或異源二聚體復(fù)合物[68]。NF-κB抑制蛋白(IκB)是NF-κB的特異性抑制劑，在無外界刺激的情況下，IκB與NF-κB結(jié)合成二聚體，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)基質(zhì)中，從而阻斷了NF-κB的核易位[69]。當(dāng)細胞中出現(xiàn)大量自由基和炎癥因子后，會激活I(lǐng)κB激酶(IKK)復(fù)合物，隨后IκB被IKK磷酸化，進而被26S蛋白酶體降解，導(dǎo)致IκB對NF-κB的抑制作用解除，從而使NF-κB發(fā)生核易位并開啟下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致大量炎癥因子如白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(INF-γ)的產(chǎn)生和釋放[70]。

2.2.2 NF-κB是治療NAFLD的潛在靶點

NF-κB可以調(diào)控OxS和炎癥反應(yīng)中一些關(guān)鍵因子的表達，故可作為慢性肝病的潛在治療靶點。NF-κB可以抑制肝臟ROS的產(chǎn)生和促進細胞自噬來發(fā)揮抗氧化功能[71]。NF-κB是一種對OxS敏感的轉(zhuǎn)錄因子。在NAFLD中，ROS通過提高促炎細胞因子TNF-α的表達來促進NF-κB激活，而N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(GSH的合成前體)等抗氧化劑的存在則會抑制NF-κB的活性[72]。此外，激活NF-κB還可以上調(diào)一系列抗氧化劑的表達，如錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、鐵蛋白重鏈(FHC)、CAT、NQO1、GST、Txn1和硫氧還蛋白2(Txn2)，其中MnSOD受NF-κB的調(diào)控作用最為明顯[73]。故NF-κB可為NAFLD的治療提供一定的參考靶點。

NF-κB與Nrf2通路之間還存在相互影響和制約。一般情況下，NF-κB會與Nrf2競爭細胞核中環(huán)狀單磷酸腺苷反應(yīng)元件(CREB)結(jié)合蛋白(CBP)-p300復(fù)合物的結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄因子與該復(fù)合物的結(jié)合取決于易位到核中的NF-κB與Nrf2的相對含量[74]。若NF-κB與該復(fù)合物結(jié)合，則會抑制Nrf2途徑的激活[74]。Jin等[75]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型的Nrf2小鼠相比，Nrf2敲除的小鼠顯示出更高的NF-κB活性。此外，Zhang等[76]和Song等[77]通過添加不同的抗氧化劑，以體內(nèi)和體外的途徑激活Nrf2后，抑制了NF-κB信號通路的激活，以此緩解了由OxS引發(fā)的炎癥反應(yīng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，在喂食了HFD的大鼠中，添加抗氧化劑知母皂甙有助于激活Nrf2，抑制NF-κB通路，以此降低肝臟丙二醛(MDA)含量并提高GSH-Px活性，改善大鼠的OxS，從而緩解大鼠的肝損傷[78]。這些結(jié)果說明，在肝細胞發(fā)生氧化損傷時，NF-κB和Nrf2之間的相互串?dāng)_可以發(fā)揮緩解OxS的作用，因此可以作為治療NAFLD的潛在分子靶點。

2.3 NAFLD中OxS和脂質(zhì)代謝的相互作用機制

在正常的生理條件下，肝臟維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是通過攝取膳食來源的脂肪酸和合成TG來實現(xiàn)的。FFA不僅為肝臟提供能量，還可以酯化生成TG，用于脂質(zhì)儲備或合成VLDL并轉(zhuǎn)運至血液中。脂肪酸氧化主要發(fā)生在線粒體中，少部分發(fā)生在過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[79]。脂肪酸氧化過程由線粒體上不同的膜蛋白(肉堿?；D(zhuǎn)移酶、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶和肉堿?；鈮A轉(zhuǎn)移酶)和左旋肉堿介導(dǎo)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在NAFLD患者中左旋肉堿的水平有所降低，進而阻礙了脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)(TCA)，導(dǎo)致線粒體功能受損并伴隨大量ROS的產(chǎn)生[80]。有證據(jù)表明，給T2DM引起的NAFLD患者補充左旋肉堿后，可改善肝臟的脂肪變性，并通過促進脂肪酸氧化恢復(fù)了肝臟線粒體的功能[81]。

當(dāng)機體產(chǎn)生ROS的量超出人體正常需求時，就會引發(fā)OxS，從而加速NAFLD的發(fā)生。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)調(diào)節(jié)多種細胞代謝途徑，可以抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)酶如乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和轉(zhuǎn)錄因子如甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)、PPARα和過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的活性，有利于減輕肝脂質(zhì)積累并促進脂肪酸氧化[82]。過表達SREBP-1c也會提高肝細胞中的ROS含量，并激活NF-κB炎癥途徑，從而增加肝臟脂質(zhì)合成[83]。

ROS在機體肝臟大量積累時，會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)毒性的產(chǎn)生。ROS的毒性體現(xiàn)在其可以與肝細胞的脂質(zhì)相互作用形成大量的醛，尤其是MDA和4-羥基壬烯醛(HNE)。MDA和HNE與ROS相比，具有更長的半衰期，并且能夠破壞較遠端的細胞結(jié)構(gòu)和組織[84]。更確切地說，MDA和HNE可以靶向攻擊線粒體膜上的多不飽和脂肪酸(PUFA)[85-86]，而PUFA主要用于線粒體呼吸鏈上復(fù)合物的正確組裝。最終，大量醛的產(chǎn)生會導(dǎo)致線粒體功能紊亂，損害到細胞呼吸。此外，MDA和HNE還能夠促進載脂蛋白B(ApoB)的水解，減少VLDL的分泌，從而加重已經(jīng)存在的肝臟脂肪變性[86]。因此，線粒體功能的維持對于減少NAFLD患者的肝臟脂肪變性是至關(guān)重要的。

NAFLD發(fā)病過程伴隨著OxS和炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)，在此過程中，肝細胞是響應(yīng)OxS的主要實質(zhì)細胞。此外，肝臟中的一些非實質(zhì)細胞(NPC)，如肝星狀細胞(HSCs)、枯否細胞(KCs)和肝竇內(nèi)皮細胞(LSECs)也會響應(yīng)OxS，并與之發(fā)生作用[87]。OxS會激活KCs介導(dǎo)的炎癥通路，增加促炎細胞因子(如TNF-α)的釋放；OxS和脂質(zhì)過氧化可以激活HSCs，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生；此外，脂質(zhì)毒性誘導(dǎo)的OxS還可以直接殺死LSECs。這些NPC相互作用，共同促進肝細胞損傷和肝纖維化的發(fā)生[88]。

3 奶牛脂肪肝的形成與OxS的關(guān)系

在奶牛產(chǎn)業(yè)中，脂肪肝是一種常見的營養(yǎng)代謝性疾病，主要發(fā)生在高產(chǎn)奶牛的泌乳初期。在這期間，奶牛由于妊娠和泌乳的能量需求增加，但產(chǎn)后干物質(zhì)采食量相對不足，極易出現(xiàn)能量負(fù)平衡[89]。在這種狀態(tài)下，動員體脂是奶牛機體獲取能量的重要方式，此過程會產(chǎn)生大量的非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFA)進入肝臟，進行氧化代謝并供能。NEFA在肝臟中除了氧化成酮體外，還會生成大量的TG。TG積累過多不能及時被VLDL轉(zhuǎn)運出肝臟時，會導(dǎo)致肝臟被脂肪浸潤，嚴(yán)重時形成脂肪肝[90]。同時，動員體脂產(chǎn)生的NEFA經(jīng)過線粒體氧化后，會產(chǎn)生大量的自由基，打破機體自由基的動態(tài)穩(wěn)衡，使奶牛發(fā)生OxS。持續(xù)的OxS又會通過產(chǎn)生大量的ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，繼而引起線粒體損傷并誘發(fā)細胞凋亡。OxS還會對奶牛的免疫及其他細胞產(chǎn)生氧化性損傷，使其免疫功能降低，這也是圍產(chǎn)期奶牛易感染多種疾病的主要原因[91]。奶牛脂肪肝是典型的NAFLD，都伴隨著炎癥、OxS、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和糖脂代謝紊亂等問題，導(dǎo)致奶牛體況、繁殖能力以及產(chǎn)奶量的下降，極大制約了我國奶牛的高效生產(chǎn)。

孫菲菲[91]在NEFA誘導(dǎo)的LO2脂肪肝細胞模型中，通過添加膽堿和蛋氨酸，發(fā)現(xiàn)這2種營養(yǎng)素可以上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化酶的基因和蛋白表達量，減少TNF-α的含量及自由基的產(chǎn)生和積累，增強肝細胞的抗氧化和免疫能力并維持肝細胞的正常代謝。宋玉祥[92]也證明高濃度的NEFA可以造成奶牛肝臟的氧化性損傷，并通過線粒體誘導(dǎo)的ROS-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路誘導(dǎo)肝細胞凋亡。馬向明等[93]和朱勇[94]在奶牛飼糧中分別添加適量的維生素A和微生物源性的抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)二者都能顯著增強奶牛的抗氧化能力，并能提高奶牛的奶產(chǎn)量和乳品質(zhì)。綜上可知，在畜牧生產(chǎn)中可以通過靶向OxS潛在調(diào)控位點來治療圍產(chǎn)期奶牛的代謝性疾病。

4 抗氧化劑治療NAFLD

各種試驗和臨床的數(shù)據(jù)表明OxS與NAFLD密切相關(guān)，并且有證據(jù)表明抗氧化劑可以預(yù)防NAFLD或NASH的發(fā)生[95]。許多天然化合物都表現(xiàn)出或多或少的抗氧化功能，并且可以對一些慢性肝病起到防治的作用，包括NAFLD。

4.1 經(jīng)典的抗氧化劑——維生素C和維生素E

維生素C和維生素E是經(jīng)典的抗氧化分子，通過清除體內(nèi)過多的自由基來防止OxS的發(fā)生。近些年，維生素逐漸被建議作為NAFLD的潛在治療藥物，并且有研究發(fā)現(xiàn)，維生素C和維生素E的組合添加更有益于緩解NAFLD和NASH[95]。

維生素E是一種脂溶性維生素，在脂肪組織和肝臟中蓄積較多。Nan等[96]研究發(fā)現(xiàn)，維生素E通過緩解肝臟OxS和抑制肝細胞凋亡，達到預(yù)防NAFLD加重的效果。維生素E是生育酚類物質(zhì)的總稱，其中α生育酚的含量最高，生理活性也最高[97]。α生育酚可以直接清除機體多余的ROS，調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)并增強抗氧化酶的表達，如SOD、GSH-Px和CAT等[98]。Raso等[99]在HFD誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型中補充維生素E，能夠降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性，降低血清MDA含量，從而一定程度上緩解肝臟的脂質(zhì)積累和過氧化。

在不同的試驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，維生素E的抗氧化作用與Nrf2的活性調(diào)節(jié)有關(guān)[100]，但這一作用在NAFLD模型中尚未得到充分驗證。Fang等[101]研究發(fā)現(xiàn)，金屬鎘誘導(dǎo)小鼠發(fā)生氧化性肝損傷后，添加維生素E可減輕損傷癥狀，這種保護作用與OxS的抑制和Nrf2的激活有關(guān)。此外，添加維生素E還可以激活Nrf2/CRISPR相關(guān)蛋白1(Cas1)途徑，減少高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的脂肪變性[102]。在未來的研究中，還需要進一步探索維生素E對Nrf2的激活作用以及維生素E在NAFLD中的治療潛力。

維生素C又稱抗壞血酸，是一種水溶性維生素。人體不能合成維生素C，必須從飲食中才能獲取，膳食中攝入不足則會導(dǎo)致維生素C的缺乏[95]。目前，維生素C治療NAFLD的機制尚不完全明確。當(dāng)維生素C缺乏時，會導(dǎo)致各種抗氧化酶的活性和表達量降低，同時OxS的標(biāo)志物含量升高[95]。Valdecantos等[103]的試驗證明，維生素C可以減少離體的大鼠肝臟中線粒體ROS的產(chǎn)生，并增強線粒體中GSH-Px和MnSOD的活性。在HFD飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型中，補充抗壞血酸可以提高PPARα和調(diào)控脂肪酸β氧化相關(guān)酶的基因表達，減輕肝臟脂質(zhì)過氧化、炎癥和細胞凋亡等[95]。Rezazadeh等[104]通過給大鼠喂食MCD飲食10周后，再添加維生素C，發(fā)現(xiàn)肝細胞的腫脹情況和炎癥反應(yīng)以及OxS的標(biāo)志物有顯著減少，肝臟SOD和CAT等抗氧化酶活性提高，但對于肝臟脂肪變性卻沒有顯著的改善。并且在某些情況下，維生素C在NASH中不一定能發(fā)揮其療效[105]。故維生素C減緩NAFLD或NASH的具體機制，以及維生素C在NAFLD或NASH的治療潛力還有待進一步的探索和闡明。

4.2 二甲雙胍

二甲雙胍(N，N-二甲基雙胍)屬于雙胍類抗糖尿病藥物。在臨床上，二甲雙胍一直用于治療T2DM?；加蠺2DM的人往往也伴隨著NAFLD的發(fā)生。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可能有助于緩解NAFLD[106]。Zhou等[107]用二甲雙胍(50或100 mg/kg)治療肥胖小鼠4周后，下調(diào)了肝臟中載脂蛋白A5(ApoA5)的表達量，此類蛋白對調(diào)節(jié)肝臟脂滴的形成和TG代謝至關(guān)重要。此外，Zhang等[108]的試驗證明了二甲雙胍可以通過上調(diào)HO-1的表達和抑制JNK途徑，來保護大鼠肝細胞免受OxS誘導(dǎo)的細胞凋亡。Brandt等[109]的研究結(jié)果表明，二甲雙胍治療可以激活A(yù)MPK途徑來促進細胞自噬，并抑制SREBP-1c表達來調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，緩解肝臟脂肪變性。而且AMPK活化后，可以將Nrf2的抑制劑——糖原合酶激酶(GSK)磷酸化，以此來間接激活Nrf2[110]。用HFD喂養(yǎng)的小鼠用二甲雙胍治療后，可以降低肝臟低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)含量以及血清AST和ALT活性，緩解肝細胞的氧化損傷[111]。因此，二甲雙胍可能有助于預(yù)防和/或治療NAFLD，但對其具體的調(diào)節(jié)機制和分子靶點還需要進行進一步的研究。

4.3 姜黃素

姜黃素(二次異丙酰甲烷)是一種酚類化合物，來源于植物姜黃的根莖，是姜黃的主要活性成分。在食品和紡織工業(yè)中，姜黃素被廣泛用作著色劑和膳食香料。作為一種天然多酚，姜黃素具有很強的抗炎、抗氧化和抗癌特性[112]。姜黃素結(jié)構(gòu)中含有多種和抗氧化相關(guān)的功能基團，包括碳-碳雙鍵、β-二酮基團和苯基環(huán)，能夠清除細胞膜中的脂質(zhì)自由基，是很強的脂溶性抗氧化劑[113]。姜黃素對各種疾病和癌癥的預(yù)防和治療特性已在許多研究中得到證實。據(jù)報道，這種化合物還在NAFLD的治療和肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮了重要作用[114]。在用HFD喂養(yǎng)的肥胖小鼠中，加入膳食姜黃素，可以改善線粒體的生物合成，下調(diào)SREBP-1和羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶基因的表達，從而降低肝臟TG含量[103]。Ramirez-Tortosa等[115]研究發(fā)現(xiàn)，給用HFD飼喂的家兔補充膳食姜黃素后，減少了肝臟的炎癥、纖維化和脂肪變性，這歸因于姜黃素使線粒體產(chǎn)生的ROS下降并改善了線粒體的功能。這些結(jié)果說明了在大多數(shù)情況下，姜黃素治療NAFLD可能是通過恢復(fù)線粒體功能來實現(xiàn)的。Xiong等[116]指出，姜黃素能夠通過激活Nrf2和ERK/p38-MAPK等抗氧化信號通路，上調(diào)解毒酶(如NQO1、HO-1和GCLC)基因的表達，以此來緩解肝臟的OxS。此外姜黃素還可以抑制NF-κB的核易位，從而防止NASH和肝損傷的發(fā)生[117]。盡管有證據(jù)表明，姜黃素有巨大的潛力緩解肝氧化損傷，但這方面的研究仍然不夠全面和系統(tǒng)。因此，還需要進一步研究姜黃素在肝保護過程中的分子、細胞和生理機制，來確定其對NAFLD的治療潛力。

4.4 類黃酮

類黃酮是一組天然的膳食抗氧化劑，普遍存在于蔬菜、水果和一些植物中[118]。類黃酮結(jié)構(gòu)中的酚醛羥基是負(fù)責(zé)其抗氧化活性的主要功能基團。類黃酮家族通過多種機制發(fā)揮其抗氧化作用，可以幫助機體清除過多的ROS，例如超氧化物、H2O2、羥基自由基和過氧亞硝酸鹽等[119]。已經(jīng)鑒定出自然界中存在1 000多種天然的類黃酮，其中一些對人類健康能夠發(fā)揮有益作用。

槲皮素是一種典型的類黃酮。研究表明，槲皮素可以通過抑制脂肪合成基因如脂肪酸合酶(FAS)和SREBP-1c的表達水平來改善肝脂質(zhì)積累和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[120]。Jung等[121]的試驗結(jié)果顯示，在用HFD喂養(yǎng)的肥胖小鼠中，用槲皮素治療后許多與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達發(fā)生了改變。在T2DM誘導(dǎo)的NAFLD模型中，槲皮素治療降低了血清中AST、ALT等轉(zhuǎn)氨酶的活性，提高了肝臟中CAT、SOD活性以及GSH含量；此外，在用FFA和高水平D-葡萄糖聯(lián)合培養(yǎng)的人肝癌細胞HepG2模型中，槲皮素治療可以減少脂質(zhì)液滴并下調(diào)肝細胞中TG和總膽固醇水平，其機制主要涉及Nrf2下游抗氧化酶表達水平的上調(diào)、NF-κB的抑制和血清白細胞介素-18(IL-18)含量的降低[122]。此外，白藜蘆醇也是一種典型的類黃酮，研究已經(jīng)證明白藜蘆醇可以上調(diào)抗氧化酶的活性和減少OxS來預(yù)防肝臟脂肪變性，是良好的抗氧化劑[123]。白藜蘆醇可以上調(diào)肝線粒體內(nèi)膜上的陰離子轉(zhuǎn)運蛋白——解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)表達，而UCP-2能降低線粒體膜上的電化學(xué)梯度并增加線粒體數(shù)量，從而緩解HFD誘發(fā)的線粒體功能障礙[124]?？诜邹继J醇能夠通過調(diào)節(jié)Nrf2和抗氧化劑(包括GSH、SOD、CAT和維生素C)來減少脂質(zhì)過氧化，從而緩解肝臟的OxS[125]。總之，類黃酮等一系列多酚物質(zhì)可以作為肝臟代謝相關(guān)疾病的潛在治療藥物，應(yīng)在未來的科學(xué)研究和臨床治療上多加開發(fā)和利用。

5 小 結(jié)

NAFLD的發(fā)病過程涉及到幾種破壞肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機制，其中OxS在這種疾病的發(fā)病機制中起著核心作用。調(diào)節(jié)機體的氧化還原平衡對于維持肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是極為重要的。氧化還原平衡的改變會影響到一些與代謝相關(guān)的細胞器的功能，導(dǎo)致細胞脂質(zhì)毒性、脂質(zhì)過氧化、線粒體功能紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

近年來，越來越多的研究結(jié)果證明了抗氧化劑對NAFLD有潛在的治療效果，其機制主要涉及到Nrf2抗氧化通路的激活和NF-κB炎癥通路的抑制。此外，可能還存在一些未知的肝保護信號通路有待人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)和挖掘。天然的膳食化合物，如咖啡因和橙皮素等具有抗氧化性能，且不會對機體產(chǎn)生毒害作用，是治療NAFLD的潛力藥物。然而，相關(guān)的研究僅限于評估肝損傷水平和血液中的OxS、免疫等指標(biāo)和檢查肝臟的組織病理學(xué)或免疫組化結(jié)果，不夠系統(tǒng)和完善。這些天然化合物的具體調(diào)節(jié)機制和確切的分子靶標(biāo)仍有待進一步闡明，需要對其治療潛力進行更深層次的探究。在充分了解這些天然化合物的調(diào)節(jié)作用和機制的基礎(chǔ)上，進行模型動物添加或臨床試驗，將會更有助于探究其對預(yù)防和治療NAFLD的效果，進而為畜牧生產(chǎn)中防控圍產(chǎn)期奶牛能量負(fù)平衡等特殊生理狀態(tài)引起的代謝疾病提供相應(yīng)的防治措施和手段。