崔百磊 王 麗 郭乾鵬 黃 怡* 胡勝蘭*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧530004；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣州510640)

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物[1-3]。對腸上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附力且定植后能大量繁殖成優(yōu)勢菌群是微生物作為益生菌的重要前提[4-5]。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是自然界中常見的一種益生菌，屬于腸球菌屬，革蘭氏陽性，兼性厭氧，一般呈圓形或者橢圓形，無鞭毛及芽孢[6-9]。由于屎腸球菌具有優(yōu)良的耐酸堿特性，并且可以定植于動物腸道內(nèi)，因此被作為益生菌廣泛用于飼料添加劑中[10-13]。在實(shí)際生產(chǎn)中添加適當(dāng)劑量的屎腸球菌往往可以改善機(jī)體健康狀態(tài)，提高生長性能[14-18]。屎腸球菌與腸道黏膜接觸后產(chǎn)生免疫應(yīng)答可以對動物機(jī)體產(chǎn)生免疫刺激作用，進(jìn)而影響免疫系統(tǒng)和宿主健康[19-21]。研究表明，新生仔豬灌服屎腸球菌EF1可有效抑制小腸黏膜腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-l(IL-1)等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，提高相關(guān)抗炎細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而促進(jìn)腸黏膜穩(wěn)態(tài)[19-20,22]。屎腸球菌HDRsEF1能保護(hù)豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)細(xì)胞膜的完整性，并且能降低IPEC-J2細(xì)胞白細(xì)胞介素-8(IL-8)的分泌[21,23]。研究發(fā)現(xiàn)，灌喂屎腸球菌能顯著提高結(jié)腸固有層中免疫球蛋白A(IgA)+細(xì)胞和CD11b+IgA+細(xì)胞的數(shù)量增加[24]。灌服屎腸球菌AL41可顯著緩解空腸彎曲桿菌CCM6191攻毒誘導(dǎo)的肉雞盲腸轉(zhuǎn)化生長因子-β4(TGF-β4)表達(dá)降低，同時提高IgA+細(xì)胞的免疫應(yīng)答[25]。

為了保證益生菌的安全使用，并避免造成公共污染，目前市場上使用的益生菌類制劑除了嚴(yán)格選用保證菌種質(zhì)量的活菌制劑外，也采用滅活菌制劑。滅活處理的益生菌制劑相較于活菌制劑不需要滿足數(shù)量的要求就能具有顯著的療效，并且便于運(yùn)輸和儲存[26]，也能很好解決活菌時會出現(xiàn)的公共安全問題。然而滅活處理的菌種會因理化特性的改變[27]，從而影響到其生物學(xué)功能，因此對活菌與滅活菌的益生特性進(jìn)行對比研究是非常有必要的[22]。本課題組前期研究結(jié)果表明，屎腸球菌EF1(EnterococcusfaeciumEF1)活菌和滅活菌均不影響0～21日齡仔豬的體重和平均日增重，活菌組可顯著降低仔豬腹瀉率[28-29]。因此，在此基礎(chǔ)上，本研究擬深入開展屎腸球菌EF1活菌和滅活菌對仔豬腸道緊密連接蛋白、細(xì)胞因子應(yīng)答以及Toll樣受體(TLR)基因表達(dá)的影響，對比活菌和滅活菌在仔豬體內(nèi)作用效果差異，以期更全面地了解益生屎腸球菌的益生作用，為屎腸球菌在仔豬養(yǎng)殖中的高效使用提供充分的科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

屎腸球菌EFI菌株來自浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)選用窩產(chǎn)仔數(shù)和體重相近且胎次和出生時間相同的杜×長×大新生健康仔豬9窩，每窩10～11頭，隨機(jī)分成3組，每組3窩仔豬。對照組(CON組)仔豬灌服10%脫脂乳溶液10 mL；活菌組(LB組)仔豬灌服含益生屎腸球菌活菌(1×108CFU/mL)的10%脫脂乳溶液10 mL；滅活菌組(HB組)仔豬灌服含熱滅活屎腸球菌(1×108CFU/mL)的10%脫脂乳溶液10 mL。每天定時灌服1次，持續(xù)6 d。7日齡時飼喂仔豬教槽料，至21日齡斷奶。飼養(yǎng)期間嚴(yán)格按照規(guī)定進(jìn)行仔豬的日常管理，仔豬和母豬飼糧均無抗生素。

1.3 樣品采集

在7和21日齡時，從每窩中選出1頭接近平均體重的仔豬屠宰，取空腸和回腸腸段，去除腸道內(nèi)容物后，用手術(shù)刀片刮取黏膜放入1.5 mL離心管內(nèi)，液氮暫存，之后放-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNA抽提、cDNA制備和實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測

選用RNAiso Plus試劑盒提取空腸、回腸黏膜組織總RNA，測定RNA濃度時吸光度(OD)260/OD280比值在1.8～2.2，表示RNA純度較高。參考TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書完成cDNA制備，-80 ℃保存，用于后續(xù)基因表達(dá)的檢測。根據(jù)TaKaRa相應(yīng)試劑盒說明配制反應(yīng)體系，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增基因，進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s→54 ℃ 10 s→72 ℃ 30 s(39個循環(huán))；熔解曲線95 ℃ 10 s→60 ℃ 5 s→95 ℃ 5 s，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 屎腸球菌對仔豬小腸緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

由表2可知，與CON組相比，LB組有提高7日齡仔豬空腸黏膜閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)基因相對表達(dá)量的趨勢(P=0.08)，且顯著提高回腸黏膜ZO-1基因相對表達(dá)量(P<0.05)。

由表3可知，21日齡時，與CON組相比，屎腸球菌活菌和滅活菌對空腸回腸黏膜咬合蛋白(Occludin)和ZO-1的基因相對表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)。

2.2 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

由表4可知，與CON組相比，屎腸球菌活菌處理有降低7日齡仔豬空腸黏膜IL-8基因相對表達(dá)量的趨勢(P=0.052)，白細(xì)胞介素-10(IL-10)基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)提高的趨勢(P=0.063)；與CON組相比，仔豬灌喂屎腸球菌后降低空腸IL-8基因相對表達(dá)量，其中HB組IL-8基因相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；屎腸球菌活菌和滅活菌對7日齡仔豬回腸黏膜各細(xì)胞因子基因相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

由表5可知，與CON組相比，21日齡仔豬灌喂屎腸球菌后，結(jié)果顯示活菌可顯著降低空腸和回腸黏膜IL-8基因相對表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高回腸黏膜IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)基因相對表達(dá)量(P<0.05)；滅活菌處理顯著降低空腸黏膜IL-8基因相對表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高TGF-β基因相對表達(dá)量(P<0.05)，對回腸黏膜的4種細(xì)胞因子基因相對表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

表2 屎腸球菌對7日齡仔豬空腸和回腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

表3 屎腸球菌對21日齡仔豬空腸和回腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

表4 屎腸球菌對7日齡仔豬空腸和回腸黏膜細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

2.3 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜細(xì)胞因子分泌量的影響

由表6可知，與CON組相比，7日齡仔豬灌服活菌顯著提高回腸黏膜IL-10的分泌量(P<0.05)，有降低空腸腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌量的趨勢(P=0.087)；與對照CON組相比，屎腸球菌活菌和滅活菌處理均降低了空腸和回腸黏膜的TNF-α分泌量(P>0.05)，提高了TGF-β分泌量(P>0.05)。

由表7可知，屎腸球菌處理后21日齡仔豬空腸和回腸黏膜的IL-8和TNF-α的分泌量均低于CON組，其中活菌處理顯著降低空腸黏膜的IL-8分泌量(P<0.05)；此外，屎腸球菌處理對腸道黏膜IL-10和TGF-β的分泌量均無顯著影響(P>0.05)。

表5 屎腸球菌對21日齡仔豬空腸和回腸黏膜細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

表6 屎腸球菌對7日齡仔豬空腸和回腸黏膜細(xì)胞因子分泌量的影響

表7 屎腸球菌對21日齡仔豬空腸和回腸黏膜細(xì)胞因子分泌量的影響

續(xù)表7項(xiàng)目 Items組別 GroupsCONLBHB腫瘤壞死因子-α TNF-α545.63±50.40477.27±31.03533.97±30.21白細(xì)胞介素-10 IL-10120.47±12.11127.60±5.67128.93±18.00轉(zhuǎn)化生長因子-β TGF-β194.92±66.05178.50±28.25184.95±72.53

2.4 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜TLR基因表達(dá)的影響

由表8和表9可知，屎腸球菌活菌和滅活菌對7和21日齡仔豬空腸和TLR基因相對表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)；屎腸球菌處理沒有顯著影響21日齡仔豬空腸TLR基因相對表達(dá)量(P>0.05)，但檢測回腸相關(guān)受體基因相對表達(dá)量時發(fā)現(xiàn)，滅活菌顯著提高回腸TLR-4基因相對表達(dá)量(P<0.05)。

表8 屎腸球菌對7日齡仔豬空腸和回腸黏膜Toll樣受體基因表達(dá)的影響

表9 屎腸球菌對21日齡仔豬空腸和回腸黏膜Toll樣受體基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

緊密連接蛋白主要包括ZOs、閉合蛋白(Claudin)和Occludin 3種跨膜蛋[30-31]。其中ZO-1分布于腸細(xì)胞內(nèi)，Claudin和Occludin為跨膜蛋白，3種跨膜蛋白彼此關(guān)聯(lián)，將相鄰的2個腸上皮細(xì)胞連接起來，形成1個結(jié)構(gòu)性屏障，將抗原物質(zhì)阻隔在腸上皮細(xì)胞之外[32]，這也是腸黏膜防御系統(tǒng)中的第1道防線，可見增強(qiáng)緊密連接蛋白的表達(dá)有利于維護(hù)腸上皮細(xì)胞對外界抗原物質(zhì)的屏障作用。已有研究表明，益生菌對動物腸道黏膜TLR具有調(diào)節(jié)作用[33-36]，孔雨昕等[37]在烏鱧飼料中分別添加108CFU/g乳酸乳球菌L21、植物乳桿菌W21、糞腸球菌L2飼喂8周后，檢測發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組烏鱧腸道Claudin-3及ZO-1的mRNA相對表達(dá)量顯著高于與對照組。研究發(fā)現(xiàn)，給仔豬飼喂羅伊氏乳桿菌I5007后，空腸和回腸上皮Occludin和ZO-1表達(dá)顯著提高[35]，另有研究發(fā)現(xiàn)，給斷奶仔豬灌服弗氏乳桿菌后，十二指腸、空腸和回腸黏膜的Occludin和ZO-1基因相對表達(dá)量也顯著提高[36]。本研究中，灌服屎腸球菌活菌有提高7日齡仔豬空腸黏膜ZO-1基因相對表達(dá)量的趨勢，并顯著提高回腸ZO-1基因相對表達(dá)量，與前人的研究結(jié)果相似。然而本研究中，屎腸球菌滅活菌對腸道緊密連接蛋白基因相對表達(dá)量無顯著影響。因此，屎腸球菌活菌在提高腸道緊密連接蛋白表達(dá)、維護(hù)腸道物理屏障完整性的方面優(yōu)于滅活菌的作用。

3.2 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜細(xì)胞因子基因表達(dá)和分泌的影響

細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)過刺激作用而生成的具有生物活性物質(zhì)的小分子蛋白[38]，細(xì)胞因子主要包含IL、IFN、TNF、TGF等[39]。相關(guān)研究表明，益生菌作用機(jī)體后，有利于促進(jìn)抗炎因子表達(dá)，抑制炎癥發(fā)生[22,40-43]。雙歧三聯(lián)活菌治療處理結(jié)腸炎的大鼠后，顯著降低脾細(xì)胞上清液中的TNF-α的表達(dá)水平，顯著提高IL-10的表達(dá)水平[40]。攻毒大腸桿菌O157∶H7的小鼠灌喂嗜酸乳桿菌和瑞士乳桿菌后，IL-2、IL-4和IL-6表達(dá)水平顯著提高，緩解了大腸桿菌的感染[41]。斷奶仔豬飼糧中添加丁酸梭菌后，血清中抗炎因子IL-2含量顯著提高，并且顯著降低血清促炎因子IL-6和TNF-α含量[42]，丁酸梭菌刺激人外周血單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞也同樣觀察到抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)上調(diào)[43]。此外，團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌活菌較滅活菌可顯著提高RAW264.7細(xì)胞TNF-α的分泌[22]。本研究中，7日齡仔豬灌服屎腸球菌活菌可在一定程度上降低空腸黏膜IL-8基因相對表達(dá)量，提高IL-10基因相對表達(dá)量，滅活菌處理后IL-8基因相對表達(dá)量顯著降低。21日齡仔豬空腸和回腸黏膜在屎腸球菌活菌作用后，IL-8基因相對表達(dá)量顯著降低，回腸黏膜IL-10和TGF-β基因相對表達(dá)量表達(dá)顯著提高；滅活菌顯著降低空腸黏膜IL-8基因相對表達(dá)量，同時提高TGF-β基因相對表達(dá)量，對回腸黏膜的4種細(xì)胞因子基因相對表達(dá)量無顯著影響。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)發(fā)現(xiàn)，活菌處理可降低7日齡仔豬空腸TNF-α的分泌量，提高其回腸黏膜IL-10的分泌量。屎腸球菌活菌處理后，21日齡仔豬空腸IL-8的分泌量顯著降低，滅活菌對于空腸和回腸黏膜因子分泌量無顯著影響，該結(jié)果與基因表達(dá)結(jié)果基本一致。因此，屎腸球菌的添加可以誘導(dǎo)仔豬腸道黏膜產(chǎn)生免疫應(yīng)答，提高抗炎因子表達(dá)，降低炎癥因子分泌，從而保護(hù)腸道健康，并且活菌效果優(yōu)于滅活菌。

3.3 屎腸球菌對仔豬小腸黏膜TLR基因表達(dá)的影響

TLR基因在非特異免疫中具有重要作用，可以精準(zhǔn)識別突破腸道黏膜屏障的微生物，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，激活免疫應(yīng)答[44]。研究表明，在飼糧中添加乳酸菌顯著提高雞腸道中TLR-2和TLR-4的表達(dá)[45]。健康小鼠灌服益生菌后，TLR基因的表達(dá)顯著提高[46-48]。斷奶仔豬飼喂鼠李糖乳桿菌LR6001達(dá)到108CFU/mL時可顯著提高腸道TLR-2和TLR-9的表達(dá)量[49]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌活菌和滅活菌對7日齡仔豬腸道TLR表達(dá)無顯著影響，在21日齡仔豬腸道中，活菌和滅活菌對于空腸黏膜TLR基因相對表達(dá)量無顯著影響，而滅活菌顯著提高回腸TLR-4的基因相對表達(dá)量，由此可見，屎腸球菌滅活菌對于腸道TLR基因調(diào)節(jié)作用優(yōu)于活菌，兩者對于TLR基因的分泌均有一定的促進(jìn)作用，表明益生菌屎腸球菌有利于調(diào)節(jié)仔豬腸黏膜屏障的應(yīng)答。

前期試驗(yàn)表明，給新生仔豬灌服屎腸球菌后，在整個哺乳期(1～21日齡)益生菌處理組均有效降低了仔豬腹瀉率，且活菌組效果更顯著[29]，表明屎腸球菌作用新生仔豬后影響了腸道的通透性，緩解了腸道的炎性癥狀，對于緊密連接蛋白、炎癥細(xì)胞因子及TLR基因表達(dá)測定結(jié)果進(jìn)一步表明，屎腸球菌通過提高腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)，抑制炎癥因子IL-8和TNF-α基因的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10和TGF-β基因的表達(dá)，有效改善了仔豬腸道健康狀況。相關(guān)研究表明，在受損的腸道上皮中，TLR-4和TLR-9具有拮抗作用，TLR-9的表達(dá)可以促進(jìn)分子抑制信號白細(xì)胞介素-1相關(guān)激酶M(IRAK-M)的產(chǎn)生，減輕由TLR-4表達(dá)后產(chǎn)生的一系列炎癥反應(yīng)的傷害[50-51]，本試驗(yàn)中，腸道TLR基因在屎腸球菌作用后幾乎沒有產(chǎn)生顯著影響，但滅活菌提高了TLR-4基因相對表達(dá)量，可能會誘發(fā)仔豬腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而體現(xiàn)了屎腸球菌活菌對仔豬腸道產(chǎn)生的健康保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

屎腸球菌活菌和滅活菌對仔豬均有益生作用。本研究使用濃度為1×108CFU/mL屎腸球菌活菌較其熱滅活菌更有利于促進(jìn)仔豬小腸緊密連接蛋白基因表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子并提高抗炎細(xì)胞因子表達(dá)和分泌，穩(wěn)定TLR基因的表達(dá)，從而改善仔豬腸道健康。