王為東，陳文芳，張 禎

（1 山東省蒙陰縣人民醫(yī)院病理科 山東 臨沂 276200）

（2 山東省蒙陰縣人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科 山東 臨沂 276200）

乳腺癌是全世界女性癌癥死亡的重要原因之一，其病死率占所有惡性腫瘤的15%[1]。腫瘤微環(huán)境作為腫瘤賴以生存的基礎(chǔ)，越來越受到該領(lǐng)域?qū)W者的重視。其中CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中的重要淋巴細(xì)胞，對(duì)腫瘤的預(yù)后的評(píng)估和治療方法的制定都有重要的意義。本文旨在探討乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)及其臨床意義。

1.資料與方法

1.1 一般資料

分析2015 年1 月—2021年12 月于山東省蒙陰縣人民醫(yī)院行手術(shù)切除的136 例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本，所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林、石蠟包埋處理。采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)腫瘤組織中的CD4+、CD8+水平。所有患者均為女性，中位年齡52 歲，組織病理學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)4 例，Ⅱ級(jí)90 例，Ⅲ級(jí)42 例；國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期：Ⅰ期46 例，Ⅱ期51 例，Ⅲ、Ⅳ期39 例。

1.2 方法

①組織芯片構(gòu)建：根據(jù)HE 染色切片選取組織典型部分，選用遼寧朝陽恒泰公司生產(chǎn)的恒泰組織芯片制備系統(tǒng)HT-1 制備蠟塊，取樣針直徑2.0 mm，組織芯片間距1.5 mm。②免疫組織化學(xué)染色：采用免疫組化SP 法和羅氏BenchMark GX 全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，CD4+、CD8+鼠抗人單克隆抗體北京中杉金橋公司，二抗采用羅氏公司全自動(dòng)染色機(jī)封閉抗體，對(duì)比實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性和陽性對(duì)照，按說明書操作。

1.3 觀察指標(biāo)

應(yīng)用組織芯片及免疫組化技術(shù)檢測(cè)136 例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)部位為胞質(zhì)或包膜，挑選腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)密集區(qū)，采用視場(chǎng)數(shù)22，物鏡倍數(shù)為×40 倍的奧林巴斯BX41 顯微鏡進(jìn)行觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)40倍視野中CD4+淋巴細(xì)胞≥20 個(gè)為陽性，＜20 個(gè)為陰性；CD8+淋巴細(xì)胞≥40 個(gè)為陽性，＜40 個(gè)為陰性。將不同臨床病理指標(biāo)與患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及癌細(xì)胞的雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER-2）、P53 及Ki-67 等指標(biāo)進(jìn)行分析，隨訪時(shí)間為24 ～72 個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分率[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用Z檢驗(yàn)。經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

CD4+T 淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的表達(dá)與患者的臨床分期之間差異顯著（χ2= 6.880，P= 0.032），與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的大小無顯著差異（P＞0.05）；CD8+T 淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期之間差異顯著（χ2= 4.248、7.496，P= 0.039、0.024），與患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞在IDC 微環(huán)境中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中ER、PR、HER-2 及Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性

CD4+淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的浸潤(rùn)與ER 呈負(fù)相關(guān)（r= -0.173，P= 0.045），與HER-2 及Ki-67 呈正相關(guān)（r= 0.178、247，P= 0.039、0.004），與PR 無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。CD8+淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的浸潤(rùn)與ER、PR、HER-2 及Ki-67的表達(dá)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3 CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與術(shù)后無瘤生存和總生存的關(guān)系

Log-rank 檢驗(yàn)顯示，CD4+淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的浸潤(rùn)有延長(zhǎng)患者的無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 3.05、2.598，P= 0.081、0.089），見圖1、2。CD4+淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的浸潤(rùn)可延長(zhǎng)患者的無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 5.26、4.445，P= 0.022、0.035），見圖3、圖4。

圖1 CD4+淋巴細(xì)胞表達(dá)患者無瘤生存時(shí)間

圖2 CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)患者無瘤生存時(shí)間

圖3 CD4+淋巴細(xì)胞表達(dá)患者總生存時(shí)間

圖4 CD8+淋巴細(xì)胞表達(dá)患者總生存時(shí)間

3.討論

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞周圍的生長(zhǎng)環(huán)境，是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的土壤，包括基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞及其分泌因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)[2]。免疫微環(huán)境是指腫瘤局部浸潤(rùn)各種免疫細(xì)胞亞群，包括不同效應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，初始和記憶性CD8+T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及其分泌因子。腫瘤免疫微環(huán)境已經(jīng)被列為腫瘤的十大特征之一[3]。免疫細(xì)胞亞群的密度不同，患者的預(yù)后也不同。CD3+T 淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性性T 細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞的密度越高，患者的無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間均顯著延長(zhǎng)[4]。在腫瘤生長(zhǎng)早期，腫瘤免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞及其基質(zhì)成分形成的炎性微環(huán)境有抑瘤作用，可阻礙腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。但經(jīng)過持續(xù)的免疫激活反應(yīng)，微環(huán)境中的相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞處于耗竭或重塑狀態(tài)，不能發(fā)揮正常的功能，甚至?xí)龠M(jìn)腫瘤的惡性表征，繼而改變免疫抑制性微環(huán)境[5]。

乳腺浸潤(rùn)性癌中的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)與臨床關(guān)系日益密切。淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)程度可通過HE 染色及免疫組化染色進(jìn)行評(píng)估[6]。浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞具有潛在的評(píng)估治療效果和預(yù)后的價(jià)值。早期檢測(cè)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況適用于患者治療方案的評(píng)估和制定，有助于提高治療的針對(duì)性、降低復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后[7]。

機(jī)體免疫監(jiān)視機(jī)能的缺失使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視是腫瘤的發(fā)生基礎(chǔ)，其中由T 細(xì)胞和B 細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫是有效且持續(xù)的抗腫瘤應(yīng)答的關(guān)鍵基礎(chǔ)。在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中，T 淋巴細(xì)胞的作用尤為重要。CD4+T 淋巴細(xì)胞為輔助性淋巴細(xì)胞，雖不能直接識(shí)別和殺傷腫瘤，但對(duì)細(xì)胞性T 細(xì)胞的活化具有輔助放大效應(yīng)，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。CD8+T 淋巴細(xì)胞屬于抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞[8]。腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷主要有2 種途徑：①通過分泌穿孔素和顆粒酶等致使腫瘤細(xì)胞自溶的分泌途徑。②通過淋巴細(xì)胞的配體與腫瘤細(xì)胞的受體結(jié)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的非分泌途徑。

相關(guān)研究表明，在胃癌結(jié)腸癌患者外周血中CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞明顯降低顯示預(yù)后不佳[9-11]。另有研究表明，CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞越少，腫瘤間質(zhì)血管的新生能力越強(qiáng)[12]。本文腫瘤微環(huán)境中CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞越多，患者的臨床分期越低，CD8+T 淋巴細(xì)胞還與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。即腫瘤微環(huán)境中CD8+T 淋巴細(xì)胞越多，腫瘤腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越低。另外，隨著CD8+T 淋巴細(xì)胞的增多，患者的無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果均表明，腫瘤微環(huán)境中CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞能預(yù)測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的預(yù)后，這也是腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)之一。雖然隨著腫瘤微環(huán)境中CD4+T 淋巴細(xì)胞的增多，患者的無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間也有延長(zhǎng)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。考慮與樣本的數(shù)量較少有關(guān)，今后將繼續(xù)累積樣本進(jìn)行分析觀察，同時(shí)對(duì)CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞影響患者預(yù)后的機(jī)制進(jìn)行探討。

綜上所述，腫瘤微環(huán)境中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞越多，患者的臨床分期越低。腫瘤微環(huán)境中CD8+T淋巴細(xì)胞越多，腫瘤腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越低。隨著CD8+T淋巴細(xì)胞的增多，患者的無瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間均延長(zhǎng)?？梢?，CD4+及CD8+T 淋巴細(xì)胞在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌微環(huán)境中的表達(dá)能有效預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。