徐啟民，宋洪寧，曾思恒，何 娟，劉 軍，李 麗，王風(fēng)青

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.山東泰山生力源集團(tuán)股份有限公司，山東泰安 271000）

GABA 作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，被用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如癲癇、精神分裂癥和焦慮癥等，GABA 還具有降壓、利尿和鎮(zhèn)靜作用[1]，此外，口服GABA 可有效降低高血壓患者的血壓[2]。

目前生產(chǎn)γ -氨基丁酸的方法分為3 種：化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法[3]。其中，化學(xué)合成法是最早用于生產(chǎn)GABA 的方法，化學(xué)合成法生產(chǎn)過程中反應(yīng)條件劇烈、能耗大、副產(chǎn)物多，采用的試劑多具有毒性、腐蝕性[4]，不符合綠色環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展理念，特別是通過化學(xué)法合成的GABA不能應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)，因此化學(xué)法必將被取代。植物富集法植物在逆境的脅迫下體內(nèi)GABA 含量會顯著上升，可以在植物富集一定量的GABA。植物富集法安全環(huán)保，可以提高原材料的營養(yǎng)價值，但是生產(chǎn)效率低，所以分離提純非常困難，不足滿足市場的需求。例如，經(jīng)過富集處理的GABA茶中GABA 的含量約為0.4%[5]，而自然發(fā)芽的糙米種子中GABA 含量不到0.05%[6]，因此植物富集法不適合大規(guī)模生產(chǎn)GABA，只適合用于GABA 富集農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)。微生物合成是最為環(huán)保經(jīng)濟(jì)的合成途徑，相較于其他方法更有優(yōu)勢[7]。微生物合成GABA，在研究和生產(chǎn)中常選擇使用大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌等微生物進(jìn)行產(chǎn)GABA 的發(fā)酵。其中，乳酸菌是大量存在于人體腸道對人體有益無害的菌種，是常用的食品微生物，現(xiàn)在已經(jīng)非常廣泛地應(yīng)用在生物制品和各種食品的發(fā)酵生產(chǎn)中，是用于生產(chǎn)富含GABA 發(fā)酵食品的最優(yōu)菌種之一[8-9]。所以試驗致力于通過單因素試驗及響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化產(chǎn)GABA 植物乳桿菌LP-YX-1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，實現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)，添加合適凍干保護(hù)劑[10]凍干制備直投式發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

植物乳桿菌YX-1，實驗室分離純化并保存。

蛋白胨（發(fā)酵級），北京鴻潤寶順科技有限公司提供；吐溫80（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司提供；γ -氨基丁酸（分析純），酷爾化學(xué)科技北京有限公司提供；奶粉（食用級），澳大利亞施普特乳制品私有公司提供。

1.1.2 試驗儀器

UV752N 型紫外可見分光光度計，上海諾科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；H10-50133 型生化培養(yǎng)箱，天津宏諾儀器有限公司產(chǎn)品；R1-TGC-N50 型高速離心機(jī)，無錫市瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，聚山梨酯-80 1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L（pH 值調(diào)節(jié)至6.0～6.4），接種量2%（V/V），于37 ℃下靜置恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液制備

用接種環(huán)挑取斜面保藏菌種，接入50 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫箱中靜置培養(yǎng)16 h，得到活化后的種子液。

1.2.2 生長曲線的測定

將種子液以2%接種量接種于50 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)，每隔2 h 搖勻后取4 mL 菌液稀釋至適宜倍數(shù)測定其OD600nm值，以培養(yǎng)時間和OD600nm值關(guān)系得到植物乳桿菌YX-1 的生長曲線[11]。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗?；谠囼灳旮呙芏扰囵B(yǎng)的需求，對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳氮源種類、濃度和培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素試驗，試驗中均以菌體濃度（OD600nm值）為衡量指標(biāo)，具體單因素試驗設(shè)計如下：

植物乳桿菌YX-1 最適碳源的確定：分別選用蔗糖、乳糖、果糖、豆渣粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，將種子液以2%接種量接種到裝有10 mL 不同碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，保持其他件不變，進(jìn)行單因素試驗[12]確定最佳碳源后，分別調(diào)整碳源質(zhì)量濃度為15，20，25，30，35 g/L，以考查碳源質(zhì)量濃度對菌體增殖的影響[13]；

植物乳桿菌YX-1 最適氮源的確定：分別選用尿素、氯化銨、硫酸銨、豆餅粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，保持其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗[14]，以考查氮源種類對菌體增殖的影響；

植物乳桿菌YX-1 增殖最適酵母粉[15]質(zhì)量濃度的確定：分別調(diào)整基本培養(yǎng)基中酵母粉質(zhì)量濃度為3，6，9，12，15 g/L，進(jìn)行單因素試驗，以考查酵母浸粉對菌體增殖的影響；

植物乳桿菌YX-1 最適pH 值的確定：使用鹽酸和氫氧化鈉溶液分別調(diào)整培養(yǎng)基初始pH 值至6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，其他成分質(zhì)量濃度和培養(yǎng)條件不變，進(jìn)行單因素試驗以確定菌體增殖最適初始pH 值；

植物乳桿菌YX-1 最適接種量的確定：分別調(diào)整接種量為1%，2%，3%，4%，5%，其他成分質(zhì)量濃度和培養(yǎng)條件不變，進(jìn)行單因素試驗，以確定菌體增殖最佳接種量；

植物乳桿菌YX-1 最適培養(yǎng)時間的確定：保持培養(yǎng)基的其他成分質(zhì)量濃度和培養(yǎng)條件不變的情況下，分別培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，以確定最佳培養(yǎng)時間。

（2）Plackett-Burman 設(shè)計。利用軟件Minitab 19選擇N=12 的Plackett-Burman 設(shè)計進(jìn)行試驗，共考查6 個因素：氮源濃度、碳源質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度、接種量、pH 值和培養(yǎng)時間。每個因素取低水平和高水平，高水平質(zhì)量濃度取值為低水平的1.5～2.0 倍，以培養(yǎng)液OD600nm為響應(yīng)值。選擇置信度大于95%（p＜0.05）的因素進(jìn)行下一步試驗。

（3）最陡爬坡試驗。根據(jù)Plackett-Burman 設(shè)計的試驗結(jié)果，可以確定顯著因子的正負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)的爬坡試驗中，正效應(yīng)的因子取高水平以一定步長增大濃度，負(fù)效應(yīng)的因子取低水平以一定步長降低濃度。設(shè)置適宜步長后可得爬坡試驗設(shè)計，以培養(yǎng)液菌體濃度為響應(yīng)值，菌體濃度最大的一組確定為中心點(diǎn)，隨后進(jìn)行下一步試驗。

（4）響應(yīng)面設(shè)計。根據(jù)最陡爬坡試驗確定的中心點(diǎn)，利用軟件Minitab 19 設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，通過試驗結(jié)果可以擬合出描述自變量（各顯著因子）和響應(yīng)值（OD 值）關(guān)系的多項式回歸方程，對擬合方程進(jìn)行分析，即可得到響應(yīng)值（OD600nm值）最大時各顯著因素的水平。

1.2.4 植物乳桿菌YX-1 凍干菌粉的制備

利用上述試驗得出的最佳條件培養(yǎng)得到菌液，將菌液分裝至50 mL 離心管中常溫下以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心20 min。倒出上清液，加入適量無菌生理鹽水振蕩洗劑后，相同條件下再次離心得到菌泥。凍干保護(hù)劑和菌泥以3∶1 的比例充分混勻后得到菌懸液，將上述菌懸液平鋪于潔凈平板上用保鮮膜封口（每100 mL 菌液所得菌泥制作一個平板），放置在-20 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，再將平板放置在真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h 得到干燥菌粉。保護(hù)劑配方為奶粉15 g/L，蔗糖20 g/L，糊精25 g/L，甘油3 mL/L。

1.3 檢測方法

1.3.1 菌體密度測定

菌體密度測定利用分光光度計法，一定濃度的植物乳桿菌YX-1 發(fā)酵菌液在600 nm 下有一定的吸光度，發(fā)酵菌液菌體含量和吸光度呈正比關(guān)系，用紫外分光光度計作為檢測工具，檢測未知濃度菌液的OD 值，通過比較OD 值的大小就可以判斷該菌液中的菌體濃度大小。所以在培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)液稀釋合適的倍數(shù)（使得OD 值為0.2～0.8），測定其在600 nm[16]處的OD 值，每個樣品重復(fù)測定3 次，計算平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，即可判斷該培養(yǎng)液中植物乳桿菌YX-1 的菌體濃度大小。

1.3.2 活菌計數(shù)

活菌計數(shù)利用稀釋涂布平板法[17]，步驟如下：

（1）稀釋。用移液槍移取1 mL 菌液至9 mL 無菌生理鹽水中，充分振蕩后得到稀釋倍數(shù)為101的稀釋液，再從上一稀釋液中移取1 mL 菌液至9 mL 無菌生理鹽水中，得到102稀釋液。依次類推得到103，104，105，106，107，108稀釋倍數(shù)的系列稀釋菌液。

（2）平板涂布。選取適宜稀釋倍數(shù)的菌液，用移液槍移取100 uL 的稀釋菌液，轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基中，用潔凈無菌的涂布器將稀釋菌液均勻涂布（3 組對照），再將涂布好的平板倒置于適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

（3）菌落計數(shù)。①計數(shù)要求，計數(shù)要挑選菌落數(shù)在30～300 個的平板且菌落清晰分明，每個稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)為各平板菌落數(shù)的平均值。②計算方法，如果只有一個平板上的菌落數(shù)符合計數(shù)要求，就用該平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，作為該樣品g(mL)的活菌總數(shù)；如果2 個稀釋梯度的平板菌落數(shù)都符合計數(shù)要求，則根據(jù)公式（1）計算：

式中：n——樣品的活菌數(shù)；

c——符合計數(shù)要求的平板中菌落數(shù)；

X1——低稀釋倍數(shù)的平板個數(shù)；

X2——高稀釋倍數(shù)的平板個數(shù)；

d——低稀釋倍數(shù)。

每毫升菌液活菌數(shù)N=n×10 CFU/mL，凍干后菌粉加入凍干前等量無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋涂布平板法計數(shù)。凍干前后存活率根據(jù)公式（2）計算：

式中：N1——凍干后每毫升菌懸液的活菌數(shù)；

N2——凍干前每毫升菌液的活菌數(shù)。

每個樣品凍干后對凍干樣品進(jìn)行精確稱重，而每個平板的樣品對應(yīng)100 mL 發(fā)酵液，所以凍干后每克菌粉活菌數(shù)根據(jù)公式（3）計算：

式中：N1——凍干后每毫升菌懸液的活菌數(shù)；

N3——凍干后每克菌粉活菌數(shù)；

m——每100 mL 菌液對應(yīng)凍干菌粉質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有單因素試驗都進(jìn)行3 組平行試驗并重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)的處理及作圖用Office excel 工作表完成；響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，采用Minitab19 與Design Expert10 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌YX-1 生長曲線

植物乳桿菌YX-1 生長曲線見圖1。

圖1 植物乳桿菌YX-1 生長曲線

種子液的菌齡對微生物高密度培養(yǎng)的收獲量有著一定的影響[18]，由圖1 可知植物乳桿菌YX-1 從8 h開始進(jìn)入對數(shù)期，在約22 h 時進(jìn)入穩(wěn)定期。因此作為種子液的最佳靜止培養(yǎng)時間可以在18～22 h。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同碳源種類和濃度對菌體增殖的影響

不同碳源下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖2。

由圖2 可知，乳酸菌對單糖的利用效率更高，豆渣粉中碳源主要為纖維素不易被利用，所以菌體濃度低，以葡萄糖為碳源時OD600nm值最大，確定使用葡萄糖作為碳源進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 不同碳源下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

不同葡萄糖質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖3。

圖3 不同葡萄糖質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

由圖3 可知，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為25g/L 時，菌體OD600nm最大。楊加懷[19]研究植物乳桿菌299（L.pla-ntarum 299）優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，陳百瑩等人[20]研究植物乳桿菌ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。與該試驗結(jié)果相差不大。因此最適葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L。

2.2.2 不同氮源種類和濃度對菌體增殖的影響

不同氮源下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖4，不同氮源質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖5。

圖4 不同氮源下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

由圖4 可知，蛋白胨為氮源時OD600nm值最大，確定使用蛋白胨作為氮源進(jìn)行后續(xù)試驗。由圖5 可知，OD600nm值隨蛋白胨質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為35 g/L 時，OD 值最大，確定蛋白胨的最適質(zhì)量濃度為35 g/L。

圖5 不同氮源質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

2.2.3 不同酵母粉質(zhì)量濃度對菌體增殖的影響

不同酵母粉質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖6。

圖6 不同酵母粉質(zhì)量濃度下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

由于乳酸菌的生理結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)酶體系較為簡單，許多氨基酸不能自身合成，因此為滿足乳酸菌自身生長代謝需要從外界吸收氮源[21]。所以添加一種補(bǔ)充氮源很有必要。由圖6 可知，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為6 g/L 時，OD 值最大，確定植物乳桿菌YX-1高密度培養(yǎng)酵母粉的最適質(zhì)量濃度為6 g/L。

2.2.4 不同初始pH 值對菌體增殖的影響

不同初始pH 值下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖7。

由圖7 可知，培養(yǎng)液OD600nm值隨著初始pH 值升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)pH 值為8.0 時，OD600nm值最大，確定植物乳桿菌YX-1 高密度培養(yǎng)最適初始pH 值為8.0。

2.2.5 不同接種量對菌體增殖的影響

不同接種量下乳酸菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖8。

圖8 不同接種量下乳酸菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

接種量較低時，菌體生長繁殖空間相對較大，菌體密度較低。接種量過大，菌體在前期大量生長，產(chǎn)生乳酸，使pH 值迅速下降，從而抑制了菌體的生長增殖[22]。由圖8 可知，接種量為1%～5%時，植物乳桿菌YX-1 的OD600nm值隨接種量升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在接種量為3%時達(dá)到最大OD600nm值，而后隨著接種量的增加其OD600nm值呈下降趨勢。因此，植物乳桿菌YX-1 高密度培養(yǎng)的接種量為3%。

2.2.6 不同培養(yǎng)時間對菌體增殖的影響

不同培養(yǎng)時間下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度見圖9。

圖9 不同培養(yǎng)時間下植物乳桿菌YX-1 培養(yǎng)液吸光度

由圖9 可知，12～24 h 菌體快速增殖，OD600nm在24 h 達(dá)到最大，而24 h 后菌體OD600nm快速下降菌體衰亡速度較快，所以植物乳桿菌YX-1 最佳收獲期為24 h，這一結(jié)果也與生長曲線規(guī)律一致。

2.3 Plackett-burman 設(shè)計篩選對植物乳桿菌YX-1增殖有顯著影響的因素

為了進(jìn)一步篩選出對植物乳桿菌YX-1 菌體增殖影響最顯著的因子，試驗利用軟件Minitab 19 選擇N=12 的Plackett-Burman 設(shè)計，共考查6 個影響因素：碳源質(zhì)量濃度（A）、氮源濃度（B）、酵母粉質(zhì)量濃度（C）、pH 值（D），種子液接種量（E）和發(fā)酵時間（F）。每個因素取低水平和高水平，高水平濃度取低水平的1.5～2.0 倍，以培養(yǎng)液OD600nm值為響應(yīng)值，得出試驗數(shù)據(jù)后，通過軟件分析各個因素的效應(yīng)，選擇置信度滿足條件（p＜0.05）的因子作為顯著因子進(jìn)一步試驗。

Plackett-burman 設(shè) 計 結(jié)果（N=12）見 表1，Plackett-burman 設(shè)計的各因素的系數(shù)的估計及效應(yīng)評價（α=0.05，置信度95%）見表2。

表1 Plackett-burman 設(shè)計結(jié)果（N=12）

表2 Plackett-burman 設(shè)計的各因素的系數(shù)的估計及效應(yīng)評價（α=0.05，置信度95%）

由表2 可知，對植物乳桿菌YX-1 增殖有顯著影響（置信度＞95%）的因子有葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度，這3 個因素效應(yīng)值均為正值即為正效應(yīng)，其中葡萄糖質(zhì)量濃度正效應(yīng)十分顯著。由圖10 可知，各種因子對植物乳桿菌YX-1 生長影響的顯著程度。

標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto 圖見圖10。

圖10 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto 圖

2.4 最陡爬坡試驗確定中心點(diǎn)

根據(jù)Plackett-Burman 設(shè)計試驗結(jié)果[23]，確定了著因子的正負(fù)效應(yīng)，由表2 可知3 個影響顯著的因素都呈現(xiàn)正效應(yīng)，呈正效應(yīng)的因素應(yīng)取高水平且逐步增大，3 個因子分別設(shè)置步長：+5、+5、+3 以菌液OD600nm為響應(yīng)值，確定中心點(diǎn)。

最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

由表3 可知，最大的OD 值出現(xiàn)在試驗5，所以試驗5 的試驗條件就是響應(yīng)面設(shè)計的中心點(diǎn)，即為葡萄糖質(zhì)量濃度45 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度55 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度18 g/L。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2.5 響應(yīng)面設(shè)計確定最顯著因素的最優(yōu)水平

利用Minitab 19 軟件分別以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉3 種培養(yǎng)基成分的質(zhì)量濃度這3 個因素作為自變量，菌液OD600nm為響應(yīng)值，根據(jù)最陡爬坡試驗確定的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計選用15 組試驗的Boxbehnken 試驗設(shè)計。利用Design Expert 8.0 對試驗結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析[24]，擬合回歸方程如下：

Box-behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，響應(yīng)值的方差分析見表5。

表4 Box-behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果

由表5 可知，一次項C，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（p＜0.01）、交互項AC 對結(jié)果影響為顯著（p＜0.05）。該回歸模型的p=0.004（＜0.01），說明模型合理，可信度高；并且失擬誤差p=0.404（＞0.05），失擬誤差置信度低，說明模型選擇恰當(dāng)。模型的確定系數(shù)R2=0.964 0，校正系數(shù)R2Adj=0.899 3，說明模型的預(yù)測值與實際值契合度高，調(diào)整后的（R2）=89.93%，表明89.93%的菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化可以根據(jù)此模型解釋。

表5 響應(yīng)值的方差分析

葡萄糖質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖見圖11，葡萄糖質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖見圖12，酵母粉質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖見圖13。

圖11 葡萄糖質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖

圖12 葡萄糖質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖

圖13 酵母粉質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度的響應(yīng)圖及等高線圖

由響應(yīng)方程可以看出，響應(yīng)方程的二次項系數(shù)均為負(fù)數(shù)，所以響應(yīng)圖拋物面開口向下，響應(yīng)方程有最大值。利用Design Expert 8.0 分析計算得出，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為45.44 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為54.46 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為17.37 g/L 時，最大吸光度OD600nm為11.384 4?？紤]實際操作可行性，將上述最優(yōu)條件修正為葡萄糖質(zhì)量濃度45 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度54 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度17 g/L。以這個最優(yōu)條件進(jìn)行了3 次重復(fù)試驗，測得發(fā)酵液吸光度OD600nm平均值為11.953 7，與預(yù)測擬合度達(dá)到95%，表明優(yōu)化模型可靠；培養(yǎng)液活菌計數(shù)達(dá)到3×109CFU/mL，而初始培養(yǎng)基的培養(yǎng)液活菌數(shù)為1.29×109CFU/mL，通過優(yōu)化使得單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)增大了2.325 倍。陳百瑩等人[20]在對植物乳桿菌ZJ316（Lactobacillus plantarum ZJ316）的培養(yǎng)基配方優(yōu)化中，優(yōu)化后菌體數(shù)為9.28×109CFU/mL，數(shù)據(jù)與試驗結(jié)果在同一數(shù)量級，說明數(shù)據(jù)可靠。

2.6 植物乳桿菌YX-1 凍干菌粉的制備

利用以上系列試驗獲得的最佳培養(yǎng)基質(zhì)量濃度和培養(yǎng)條件，對植物乳桿菌YX-1 進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)液分裝至50 mL 離心管中，以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，加入20 mL 無菌生理鹽水振蕩洗滌，相同條件下再次離心得到菌泥。將凍干保護(hù)劑和菌泥以3∶1 的比例充分混勻后得到菌懸液。將菌懸液裝入潔凈平板保鮮膜封口，置于-20 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，再轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h得到干燥菌粉。再對凍干的菌粉進(jìn)行稀釋涂布，對凍干后菌粉進(jìn)行活菌計數(shù)，凍干菌粉活菌數(shù)達(dá)到9.74×1011CFU/g，楊加懷[19]在植物乳桿菌299（L.plantarum 299）的高密度培養(yǎng)及冷凍干燥保護(hù)的研究中，凍干菌粉中的活菌數(shù)為2.11×1011CFU/g，數(shù)據(jù)與試驗結(jié)果在同一數(shù)量級，說明數(shù)據(jù)可靠。凍干后菌體存活率達(dá)到83.33%，復(fù)合保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果較好。

凍干菌粉見圖14。

圖14 凍干菌粉

3 結(jié)論

通過單因素試驗確定了單個因素的最佳條件，再通過Plackett-Burman 設(shè)計，得出對植物乳桿菌YX-1 增殖影響最顯著的3 個因子分別為葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度。通過響應(yīng)面設(shè)計，對3 個最顯著因子進(jìn)行了優(yōu)化，得到最顯著因子的最佳條件為蛋白胨質(zhì)量濃度54.46 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度45.44 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度17.37 g/L，接種量3%，初始pH 值8.0，培養(yǎng)時間24 h。經(jīng)過試驗驗證，在最終優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液活菌計數(shù)達(dá)到3×109CFU/mL，而初始培養(yǎng)基的培養(yǎng)液活菌數(shù)為1.29×109CFU/mL，通過優(yōu)化使得單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)增大了2.325 倍。所以通過響應(yīng)面優(yōu)化得到植物乳桿菌YX-1 最優(yōu)培養(yǎng)基是合理且可行的。試驗還選擇了一個復(fù)合保護(hù)劑配方：奶粉質(zhì)量濃度15 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度20 g/L，糊精質(zhì)量濃度25 g/L，甘油含量3 mL/L 制備凍干菌粉，經(jīng)過計數(shù)凍干菌粉活菌數(shù)達(dá)到9.74×1011CFU/g，相較于凍干前存活率為83.33%，保護(hù)效果良好。該試驗僅使用單一配方制備了凍干菌粉，還可以設(shè)計試驗探究保護(hù)劑的最佳配方，以得到最佳的保護(hù)劑配方，進(jìn)一步提高存活。