魏彬彬 駱丹妮 秦松瑩 查 夢 張小飛 史亞軍 鄒俊波

陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室/陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是創(chuàng)傷修復(fù)的一種必然產(chǎn)物，嚴重地影響了機體的正常功能及美觀，給患者的身體和心理都帶來了極大的疼痛。由于它們確切的發(fā)病原因和機制還不清楚，所以目前醫(yī)學(xué)研究中并無一種具有特殊性的根治途徑[1]。故從天然藥物中篩選出更為安全、有效的藥物治療顯得尤為迫切。

瘢痕被前人稱為“黃瓜癰”“肉龜”等。從中醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，認為疤痕和外邪、正虛有極大關(guān)系，其發(fā)生的原因在于“氣滯血瘀、余毒未清”，還有諸多表現(xiàn)如濕熱內(nèi)盛、氣虛、血虛及陰虛等；其治療方法通常是活血、散瘀、清熱、解毒[2]。美洲大蠊是傳統(tǒng)動物類藥材中“蜚蠊”的重要基源和藥材之一，傳統(tǒng)的功效主要包括通利血脈、斂瘡生肌等[3]，多用于癥瘕積聚、瘡癰腫毒。由于其療效確切，以其為主要原料的中成藥在臨床上廣泛使用，尤其在各種創(chuàng)面的修復(fù)上，療效顯著。紫草的藥理作用主要包括清熱、涼血、解毒以及解肌透疹等。其常用于治療瘡毒潰瘍、斑疹以及表皮顏色紫黑、水火及急性燒燙傷等[4]。由此可見，美洲大蠊和紫草治療增生性瘢痕具有中醫(yī)理論依據(jù)及臨床應(yīng)用支撐。另外，本次實驗制作兔耳增生性瘢痕模型[5]，探討紫蠊乳膏對增生性瘢痕的治療效果，為祛瘢痕藥的進一步研究提供新的思路。

1 材料

1.1 藥品及主要試劑 紫草(亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，批號: 20201108)；美洲大蠊干品(彌渡縣云峰美蠊養(yǎng)殖基地，批號:20201128)；硬脂酸(山東中旺油脂有限公司，批號：SA-1801)；三乙醇胺(山東鑫隆輝化工進出口有限公司，批號:20200806)；羊毛脂(宏尚生物科技有限公司，批號:20200514)；液體石蠟(中淼石油化工有限公司，批號:20181231)；吐溫-80(邢臺鑫藍科技有限公司，批號:20191008)；重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel,RBBFGFG，珠海億勝生物制藥有限公司，批號:20201024)；磷酸氫二鈉[福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司，批號: 20200507]；中性樹膠(Biosharp生物公司，批號: 70120150)；Annexin V-FITC雙染試劑盒(四川川柏生物科技有限公司，批號:P-CA-202)；(ALT/GPT)ELISA試劑盒(四川川柏生物科技有限公司，批號: CR20170604)。

1.2 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南華豐儀器有限公司)；RS36型全自動染色機(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)；數(shù)字切片掃描儀[Pannoramic 250，3DHISTECH(Hungary)]等。

2 紫蠊乳膏的制備及處方優(yōu)化

2.1 紫草和美洲大蠊的提取

2.1.1 紫草的提取 由于所需的活性成分紫草素在高溫下會被破壞，因此在該實驗中，通過冷浸法制備紫草油。制備方法如下：將紫草切碎并浸入菜籽油中，9 d后，將藥渣濾掉，剩余的紫草油可供后續(xù)實驗使用。

2.1.2 美洲大蠊的提取 取200 g美洲大蠊，加10倍量90%的乙醇，回流2 h，過濾，藥渣加8倍量水，提取兩次，每次提取1 h，收集水提液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至稠浸膏后備用。

2.2 制備 本品屬于O/W型乳膏劑，處方中的硬脂酸、液狀石蠟和羊毛脂均可作為乳化物的油相；紫草和美洲大蠊提取物、蒸餾水、三乙醇胺等均可以用作水相；羊毛脂作為保濕劑；尼泊金乙酯作為抗蝕性的防腐劑。如圖1所示。

圖1 紫蠊乳膏制備工藝流程圖

2.3 處方優(yōu)化

2.3.1 處方設(shè)計 紫蠊乳膏：紫草、美洲大蠊提取物適量、硬脂酸3.0、羊毛脂0.5g、 液體石蠟3.0 mL、吐溫-80 1.0mL、尼泊金乙酯0.5g、三乙醇胺適量、蒸餾水適量。

2.3.2 紫蠊乳膏最佳處方篩選 預(yù)實驗[6]發(fā)現(xiàn)處方優(yōu)化中的關(guān)鍵是三乙醇胺的用量，所以本實驗主要通過調(diào)整三乙醇胺的用量來選出紫蠊乳膏的最優(yōu)處方。見表1。

表1 紫蠊乳膏處方用量

表1(續(xù))

2.3.3 處方穩(wěn)定性評價 乳膏劑的測評方法可以參考2020年版《中國藥典》(四部)[7]。其評價指標主要包括：乳膏劑的外觀、性狀、離心穩(wěn)定性、耐寒性和耐熱性、pH 值等。各項考核指標的評分詳見表2(滿分:100分)。由3人以上對各個指標的平均得分進行疊加，作為最終的評分。

表2 各項考察指標評分表

2.3.4 處方穩(wěn)定性評價結(jié)果 通過比較，可以看出，方中主要藥物(紫草提取物、美洲大蠊提取物)的用量與三乙醇胺的用量在一定程度上有相關(guān)性。如表3所示，在改變兩者的比例的情況下，發(fā)現(xiàn)在各項內(nèi)容的測定結(jié)果中，處方4明顯優(yōu)于其他處方。因此，篩選得到的最佳處方是處方4。

表3 紫蠊乳膏穩(wěn)定性試驗評分

本次實驗以以上五項內(nèi)容為評價指標，優(yōu)化了紫蠊乳膏的處方。確定其最優(yōu)處方為處方4。即：紫草提取物2.5 mL(10%)，美洲大蠊提取物2.5 mL(10%)，硬脂酸3.0 g(12%)，三乙醇胺3.0 mL(12%)，羊毛脂0.5 g(2%)，液體石蠟3.0 mL(12%)，蒸餾水9.0 mL(36%)，吐溫-80 1.0 mL(4%)，尼泊金乙酯0.5 g(2%)。采用該處方及相應(yīng)的制備工藝可制備質(zhì)地均勻細膩、性狀和含量均穩(wěn)定的乳膏。

3 紫蠊乳膏對兔耳瘢痕模型的影響

3.1 兔耳增生性瘢痕模型制備 依據(jù)文獻復(fù)制兔耳增生性瘢痕模型[8]。在該實驗中，取4只新西蘭大白兔,體重介于2.0～2.5 kg之間，其中3只被固定在固定板上，并用75%的酒精對兔耳進行消毒。使用濃度為40 mg/kg的1%戊巴比妥鈉溶液，從兔耳緣靜脈注入，再將麻醉后的大白兔于兔耳腹側(cè)避開血管，制作直徑約為 0.8 cm的圓形創(chuàng)面，每只兔左右耳腹側(cè)分別制備3個創(chuàng)面，各個創(chuàng)面的間距約1.0 cm，完整地切除各創(chuàng)面全層皮膚，然后將其剝離并完全刮去軟骨膜，保留軟骨。手術(shù)工作完畢后把兔放在籠中喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

3.2 分組與給藥 將新西蘭大白兔隨機分為4組。分別為空白組 、模型組 、紫蠊乳膏組、重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠組(簡稱：RBBFGFG組)。除了空白組外，其余的各組處理方法為：模型組涂抹生理鹽水，紫蠊乳膏組涂抹紫蠊乳膏，RBBFGFG組涂抹陽性藥。連續(xù)用藥21 d后對各組瘢痕進行大體觀察。

表4 兔耳增生性瘢痕治療方案

3.4 給藥期間瘢痕面積變化 說明與模型組相比，紫蠊乳膏組和RBBFGFG組創(chuàng)面修復(fù)較快，瘢痕面積明顯減小，說明兩組數(shù)據(jù)差異有顯著性意義。

3.5 兔耳瘢痕對比圖 由表5、表6得：紫蠊乳膏組、RBBFGFG組這兩組與模型組比較，瘢痕體積明顯縮小，且據(jù)圖2觀察其質(zhì)地變軟，顏色變淺，有向空白組轉(zhuǎn)化的趨勢，證明紫蠊乳膏能有效改善瘢痕組織內(nèi)纖維過度沉積的現(xiàn)象。

表5 給藥21 d后兔耳增生性瘢痕厚度

表6 兔耳創(chuàng)面瘢痕面積

A：空白組；B：模型組；C：紫蠊乳膏組；D：RBBFGFG組

3.6 兔耳瘢痕病理切片

3.6.1 標本 將需檢測兔耳組織共4例，用10%中性甲醛固定，固定狀態(tài)良好。于2021-04-15送到成都里來生物科技有限公司進行檢測，于2021-04-26得到檢測結(jié)果。

3.6.2 方法 固定組織經(jīng)全自動脫水機脫水[9]，包埋，切片后如圖3所示。

圖3 兔耳瘢痕HE切片檢測流程圖

3.6.3 圖像采集 采用3DHISTECH(Hungary)生產(chǎn)的Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀對HE切片進行圖像采集[10]，每張切片先于40倍下觀察大體病變，而后選擇要觀察的具體區(qū)域，分別采集100倍和400倍的圖片，觀察具體的病變情況[11]，如圖4所示。

圖4 兔耳瘢痕HE切片檢查圖

3.6.4 結(jié)果 病理檢查顯示，空白組耳組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，耳廓外覆有皮膚組織，內(nèi)部由彈性軟骨作為支撐；皮膚組織表皮較薄，表面被覆角質(zhì)層，鱗狀上皮層內(nèi)細胞排列較為整齊，未見明顯變性壞死；真皮內(nèi)致密膠原交錯排列，紅染，膠原內(nèi)可見血管、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，未見明顯變性壞死；皮下可見疏松結(jié)締組織、脂肪組織和肌肉組織、血管和神經(jīng)等；未見明顯病理變化。模型組耳表面皮膚組織受損，表皮內(nèi)鱗狀上皮細胞變性壞死，見細胞胞核固縮，胞質(zhì)溶解，真皮內(nèi)膠原排列紊亂，少量膠原溶解壞死，壞死區(qū)域內(nèi)可見皮脂腺、毛囊等皮膚附屬器基本不見；表皮、真皮及皮下可見大量嗜酸性細胞及少量淋巴細胞聚集；未見其他明顯病理變化。RBBFGFG組耳表面皮膚組織受損，表皮及真皮溶解壞死，部分區(qū)域表皮壞死后缺失，表面可見痂皮形成，內(nèi)含大量壞死細胞碎皮、白細胞及粉染漿液；真皮及皮下大量膠原纖維溶解壞死，形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，壞死區(qū)域內(nèi)可見嗜酸性粒細胞及淋巴細胞浸潤；未見其他明顯病理變化。紫蠊乳膏組耳組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，耳廓外覆有皮膚組織，表皮較薄，表面被覆角質(zhì)層，鱗狀上皮層內(nèi)細胞排列較為整齊，真皮內(nèi)致密膠原交錯排列，紅染，膠原內(nèi)可見血管、皮脂腺和毛囊等皮膚附屬器，未見明顯變性壞死；皮下可見疏松結(jié)締組織、脂肪組織和肌肉組織、血管和神經(jīng)等；未見明顯病理變化。

4 討論

增生性瘢痕(HS)多發(fā)生于皮膚創(chuàng)傷的愈合過程[12]。迄今為止，尚無理想藥物治療。我國傳統(tǒng)中藥在治療瘢痕方面有著悠久歷史，如積雪草苷、苦參堿、丹參酮ⅡA、血竭素 B、地龍等均在治療瘢痕方面取得良好效果[13]。紫草和美洲大蠊是我國常見的一種中藥，紫草素是紫草中提取的主要活性成分，西醫(yī)學(xué)研究[14]發(fā)現(xiàn)：紫草素可以抗菌消炎，緩解創(chuàng)面造成的不適感，促進傷口快速愈合等作用。美洲大蠊始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有活血化瘀、解毒消積、生肌之功效，多用于癥瘕積聚、瘡癰腫毒，外用可消腫生肌[15]。另外，美洲大蠊治療增生性瘢痕具有中醫(yī)理論依據(jù)及臨床應(yīng)用支撐。因此紫蠊乳膏在抑制增生性瘢痕中具有潛在的應(yīng)用前景，有望成為治療HS的藥物之一。

由處方的優(yōu)化和實驗結(jié)果可知，紫蠊乳膏最佳處方為紫草提取物2.5 mL；美洲大蠊提取物2.5 mL；硬脂酸3.0 g；三乙醇胺3.0 mL；羊毛脂0.5 g；液體石蠟3.0 mL；蒸餾水9.0 mL；吐溫-80 1.0 mL；尼泊金乙酯0.5 g。在本實驗中，成功建立了兔耳瘢痕模型，每組獲得6個瘢痕創(chuàng)面，具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果表明: 紫蠊乳膏對兔耳瘢痕有明顯抑制作用，在藥物治療組中瘢痕體積均減小，差異有顯著性意義(P< 0.05)，且質(zhì)地變軟，顏色變淺，具有向正常皮膚(空白組)轉(zhuǎn)化的趨勢。藥物治療后HE切片顯示，與空白相比，模型動物耳表面皮膚組織壞死及炎細胞浸潤較為明顯，病變程度較重[16]；與模型組相比，RBBFGFG組未見明顯減輕，紫乳膏組耳表面皮膚組織結(jié)構(gòu)較為完整清晰，未見明顯病理變化。所以紫蠊乳膏抑制增生性瘢痕有一定療效。

本研究建立了紫蠊乳膏的最優(yōu)處方，并通過藥理實驗為祛瘢痕藥物的進一步研發(fā)提供參考。