張沙沙 達(dá)娃卓瑪 蘭 鈞 達(dá)娃普尺 楊麗瓊

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院，西藏 拉薩 850000

八味秦皮丸(樣品如圖1所示)是由秦皮、針鐵礦、志達(dá)薩增、多刺綠絨蒿、寒水石(制)、風(fēng)毛菊、朱砂(制)粉碎成細(xì)粉，過篩，加入人工麝香細(xì)粉，混勻，制丸，干燥后所得，是藏區(qū)常用的藏藥制劑，具有接骨、消炎、止痛的藥效，臨床用于骨折、骨髓炎的治療[1]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為1995年版《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊》，其檢驗內(nèi)容僅為性狀描述和一項簡單的理化鑒別，過于簡單，不能滿足現(xiàn)代藏藥制劑的質(zhì)量控制要求。為研制一種八味秦皮丸現(xiàn)代化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，本研究在八味秦皮丸原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2-24]，結(jié)合現(xiàn)代化生產(chǎn)工藝和臨床用藥情況，通過一系列探索研究實驗，初步建立了秦皮、風(fēng)毛菊、多刺綠絨蒿、針鐵礦、寒水石、朱砂的顯微鑒別方法，秦皮甲素、秦皮乙素、7-羥基香豆素的薄層色譜鑒別方法，朱砂和秦皮乙素的含量測定方法，更為全面地建立了八味秦皮丸的質(zhì)控指標(biāo)，為老百姓的安全用藥奠定了基礎(chǔ)。

圖1 八味秦皮丸樣品圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器 正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse E1000)，103B型四兩裝高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)，電子天平(AL104，瑞士Metter Toledo有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)型超純水機(jī)(WP-UPT-10，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，SENCO W201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，ZF-I型紫外燈分析儀(上海顧村電光儀器廠)，SP-Ⅲ型薄層條帶點樣器(上?？普苌萍加邢薰?，薄層層析硅膠板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；硅膠G板、硅膠GF254(青島海洋化工廠分廠)，聚酰胺薄膜(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)，高效液相色譜儀(Waters 2695/2996)，0.45 μm微孔濾膜(上海泰坦科技有限公司)。

1.2 材料 八味秦皮丸(批號：17136A、16007A、16116A、16117A、16118A，來自西藏甘露藏藥有限公司；批號：20170801、20170801-1、20170801-2、20170801-3、20170801-4，西藏那曲地區(qū)藏藥廠)，秦皮、針鐵礦、志達(dá)薩增、多刺綠絨蒿、寒水石(制)、風(fēng)毛菊、朱砂(制)及人工麝香經(jīng)西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院中藏藥室副主任次旦多吉鑒定，處方中秦皮、朱砂符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部的要求，針鐵礦符合《德慶藏藥》的要求，寒水石和志達(dá)薩增符合《中華本草》藏藥卷和《新修晶珠本草》的要求，多刺綠絨蒿、風(fēng)毛菊符合《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》1995年版藏藥第一冊的要求。秦皮甲素(批號：110740-200405)和秦皮乙素(批號：110741-201708)購自中國食品藥品檢定研究院；7-羥基香豆素(批號：111739-200501，中國藥品生物制品檢定所)、木犀草苷(批號：2018012118)、木犀草素(批號：2017011016)和山奈酚(批號：2018050121)，均購自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、濃硫酸、高錳酸鉀(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司);氯仿、無水甲酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);硫氰酸銨(標(biāo)準(zhǔn)滴定液，批號：20200729D，深圳市博林達(dá)科技有限公司);甲醇(色譜級，Sigma-Adlrich公司);磷酸(AR級，成都市科隆化學(xué)品有限公司);超純水(由實驗室標(biāo)準(zhǔn)型超純水機(jī)制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 八味秦皮丸的顯微鑒別 秦皮：石細(xì)胞成群或單個散在，類圓形、類方形或不規(guī)則形，直徑20～45 μm，孔溝明顯[3-5]。鐵針礦：深紅色針狀物多見[2-3]。寒水石：不規(guī)則塊片無色[6]，有層層剝落痕跡。朱砂：不規(guī)則碎塊或顆粒，暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑，較為多見[7]。結(jié)果如圖2所示。

圖2 八味秦皮丸粉末顯微特征圖

2.2 秦皮的薄層色譜鑒別 取本品粉末3.0 g，加95%乙醇40 mL，密塞，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為供試品溶液。按照八味秦皮丸的處方比例稱取除秦皮外的其余藥材，同法制成缺秦皮的陰性對照溶液。另取秦皮甲素對照品、秦皮乙素對照品，加甲醇制成每1 mL含秦皮甲素0.25 mg、秦皮乙素0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、陰性對照溶液各2 μL,對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以氯仿-甲醇-甲酸(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果如圖3所示。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，斑點清晰，Rf值適中，分離度良好，且陰性對照在此位置無干擾。

從左到右依次為：陰性對照、自制樣品、混標(biāo)、供試品(16116A、16117A、16118A、17136A、16007A、20170801、20170801-1、20170801-2、20170801-3、20170801-4)

2.3 風(fēng)毛菊的薄層鑒別 取本品粉末3.0 g，加80%甲醇30 mL，加熱回流45 min，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取7-羥基香豆素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液，吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液1 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(9∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果如圖4所示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點，斑點清晰，Rf值適中，分離度良好。

圖4 風(fēng)毛菊的對照品、供試品薄層色譜鑒別圖

2.4 朱砂的含量測定 取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL小燒杯中，加入濃硫酸30 mL與硝酸鉀2.8 g，加熱使之消解，放冷，緩慢加水40 mL，冷卻至室溫，濾過，用約10 mL水沖洗燒杯與濾渣，合并濾液，并加1%高錳酸鉀溶液至濾液顯粉紅色，再滴加2% 硫酸亞鐵溶液至粉紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2 mL(加適量的硝酸使硫酸鐵銨指示液的顏色由紅褐色變?yōu)闇\黃色)，用硫氰酸銨滴定液(0.1 moL/L)滴定。每1 mL硫氰酸銨滴定液(0.1 moL/L)相當(dāng)于11.63 mg的硫化汞(HgS)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法簡便、易操作，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性佳，適用于八味秦皮丸中朱砂含量的測定。十批次樣品的測定結(jié)果如表1所示，樣品中HgS的含量均在70 mg/g以上，平均值為79 mg/g，占樣品中朱砂理論值的84%以上，表明該方法準(zhǔn)確度良好?；诎宋肚仄ね璧纳a(chǎn)投料和生產(chǎn)工藝，結(jié)合《中國藥典》中相關(guān)品種的HgS含量限值，最終，將八味秦皮丸中 HgS的含量下限定為75 mg/g，上限定為95 mg/g。

表1 10批次八味秦皮丸的朱砂含測結(jié)果

2.5 八味秦皮丸的定量測定

2.5.1 秦皮乙素對照品溶液的制備 取秦皮乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作為秦皮乙素對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 取八味秦皮丸樣品，研細(xì)，取約1.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，再稱定重量，用65%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5.3 陰性樣品溶液的制備 按照八味秦皮丸的處方比例稱取除秦皮外的其余藥材，按照“2.5.1.2”項下方法制備缺秦皮的陰性對照溶液。

2.5.4 色譜條件 色譜柱：Waters Sun FireTM C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器，流動相：甲醇(A)-0.5%磷酸溶液(B)以甲醇為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，按表2規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為345 nm，進(jìn)樣量10 μL。在上述條件下，秦皮乙素的保留時間為9.528 min，供試品中檢出與秦皮乙素對照品保留時間一致的色譜峰，目標(biāo)峰分離度均>1.5，且理論塔板數(shù)均>4000，且陰性樣品溶液對測定結(jié)果無干擾。結(jié)果如圖5所示。

表2 梯度洗脫程序

A.秦皮乙素對照品;B.供試品;C.缺秦皮陰性樣品

2.5.5 方法學(xué)驗證

2.5.5.1 線性關(guān)系考察 取秦皮乙素對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解制成每1 mL含秦皮乙素0.2 mg的對照品儲備溶液。精密吸取對照品儲備液適量，以甲醇逐級稀釋，得對照品溶液。上機(jī)后檢測，記錄HPLC色譜圖，以對照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表3和圖6可看出：秦皮乙素含量在0～0.04 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.9991。

表3 秦皮乙素線性關(guān)系考察

圖6 秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.5.2 精密度試驗 精密稱取八味秦皮丸粉末1.25 g(批號：16007A)，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流 1 h，提取完后冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄HPLC色譜圖，對秦皮乙素的峰面積進(jìn)行積分，結(jié)果顯示RSD小于2%，表明該方法精密度良好。

2.5.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取八味秦皮丸粉末1.25 g(批號：16007A)，平行制備6份樣品，分別置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，提取完成后冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，上機(jī)檢測。記錄HPLC色譜圖，對秦皮乙素峰面積進(jìn)行積分，并計算含量，結(jié)果顯示6份樣品秦皮乙素含量的RSD小于2%，表明本實驗建立的HPLC法重現(xiàn)性良好。

2.5.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取八味秦皮丸粉末1.25 g(批號：16007A)，置于50 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，提取操作完成后冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試溶液，分別在靜置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進(jìn)樣。記錄HPLC色譜圖，根據(jù)峰面積進(jìn)行積分計算，結(jié)果顯示秦皮乙素的分析結(jié)果RSD小于2%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.5.5.5 加標(biāo)回收試驗 精密稱取已知含量的八味秦皮丸粉末1.25 g，共稱取5份，分別置于50 mL圓底燒瓶中，每份精密加入秦皮乙素對照品溶液適量，按照“2.3”項下的方法制備供試品溶液，上機(jī)，測定。記錄HPLC色譜圖，對秦皮乙素峰面積進(jìn)行積分，以下列公式計算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表4。加標(biāo)回收實驗結(jié)果顯示，該方法平均回收率為96.8%，均高于95%，RSD為4.65%，小于5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 秦皮乙素加樣回收實驗結(jié)果 (n=5)

2.5.6 樣品中秦皮乙素含量測定 取10批(批號信息見表5)八味秦皮丸樣品，按照2.5.5項下的實驗方法測定樣品中秦皮乙素含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果

由上表可知，來自我區(qū)6家企業(yè)的10批八味秦皮丸樣品中秦皮乙素的含測結(jié)果在0.0213～0.4262 mg/g之間，平均值約為0.21 mg/g。但企業(yè)A的5批樣品中秦皮乙素含量較那區(qū)藏藥廠的高，平均值為0.38688 mg/g，企業(yè)B的5批樣品中秦皮乙素平均含量僅為0.025 mg/g。八味秦皮丸處方總量為1004 g，秦皮的處方量為200 g，為生粉入藥，每1 g八味秦皮丸中含秦皮約為0.2 g?！吨袊幍洹?015年版一部秦皮項下規(guī)定，按干燥品計算，含秦皮甲素和秦皮乙素的總量，不得少于1.0%，若全換算為秦皮乙素，則每1 g八味秦皮丸中含秦皮乙素不得少于2 mg?？紤]到制劑生產(chǎn)過程中粉碎、烘干、泛丸等工序的損失，擬定從秦皮藥材到制劑中秦皮乙素的轉(zhuǎn)移率按80%計算，其限度理論值為0.16 mg/g。西藏B企業(yè)所生產(chǎn)的八味秦皮丸中秦皮乙素含量低于限度理論值近10倍，提示該企業(yè)秦皮的藥材質(zhì)量控制不嚴(yán)格或生產(chǎn)工藝存在問題，而西藏企業(yè)A所生產(chǎn)的八味秦皮丸中秦皮乙素含量均大于0.34 mg/g，為秦皮乙素限度理論值的2倍及以上，表明該家企業(yè)采用的藥材來源和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。目前，只有企業(yè)A生產(chǎn)的八味秦皮丸具有國藥準(zhǔn)字號，而且，近年市場統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，企業(yè)A的八味秦皮丸產(chǎn)品生產(chǎn)、流通批量較大，故制定限量時以企業(yè)A生產(chǎn)的八味秦皮丸中秦皮乙素含量作為主要參考依據(jù)，將其含量平均值(0.38688 mg/g)下調(diào)20%，即0.30 mg/g。

3 討論

3.1 TLC分析 風(fēng)毛菊的薄層色譜鑒別，相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]表明，7-羥基香豆素和東莨菪內(nèi)酯為風(fēng)毛菊的特征成分，故初步篩選上述兩種成分作為風(fēng)毛菊TLC分析的對照品，按照2.3項下的實驗方法對樣品中的風(fēng)毛菊進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果顯示，東莨菪內(nèi)酯雖斑點清晰，但八味秦皮丸陰性對照(不含風(fēng)毛菊)對其有明顯干擾，而7-羥基香豆素不僅斑點清晰，且陰性對照無干擾，故將7-羥基香豆素作為風(fēng)毛菊的TLC分析對照品。

1.陰性對照(不含風(fēng)毛菊)；2.風(fēng)毛菊對照藥材；3.自制八味秦皮丸樣品；4.供試品(批號：16118A)；5.7-羥基香豆素；6.東莨菪內(nèi)酯

3.2 朱砂的含量測定 朱砂的主要化學(xué)成分為HgS，在八味秦皮丸的處方中，所占比例接近10%。朱砂本身是具有毒性的，使用量在一定范圍內(nèi)，才能起到良好的藥效，而超過一定量后，會對人體產(chǎn)生毒副作用，造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷甚至導(dǎo)致死亡[21]，為保證八味秦皮丸的質(zhì)量安全，故需測定該產(chǎn)品中朱砂的含量(以HgS計)。在查閱有關(guān)文獻(xiàn)[22-24]的基礎(chǔ)上，初步確定了朱砂的含量測定方法，擬定硫酸加入量為20 mL、30 mL、40 mL，采用單因素對比實驗，以對樣品的消解程度作為評價指標(biāo)，從耗材節(jié)約和環(huán)保角度出發(fā)，確定硫酸加入量為30 mL，擬定硝酸鉀添加量為2.0 g、2.2 g、2.4 g、2.6 g、2.8 g、3.0 g，以最終含測結(jié)果和消解液過濾后的外觀為綜合評價指標(biāo)，最終確定硝酸鉀加入量為2.8 g。

3.3 HPLC分析

3.3.1 檢測波長的確定 通過DAD檢測器在紫外光波范圍內(nèi)掃描可知，秦皮乙素的最大吸收波長為344.5 nm，綜合考慮，將其檢測波長確定為345 nm。

3.3.2 流動相的選擇 在查閱有關(guān)文獻(xiàn)[13-14]的基礎(chǔ)上，結(jié)合《中國藥典》2015年版一部中“秦皮”項下的含測方法，選定甲醇-0.5%磷酸水溶液(20∶80)為流動相等度洗脫、甲醇-0.5%磷酸水溶液(27∶73)為流動相等度洗脫、甲醇-0.5%磷酸水溶液(30∶70)為流動相等度洗脫、乙腈-0.5%磷酸水溶液(30∶70)為流動相等度洗脫、乙腈-0.5%磷酸水溶液(50∶50)為流動相等度洗脫、甲醇-0.5%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，通過對比目標(biāo)峰的分離效果和峰面積大小，最終選定甲醇-0.5%磷酸溶液為最佳流動相，洗脫方式見表2。

3.3.3 樣品提取時間的選擇 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，確定以甲醇為提取溶劑，以加熱回流為提取方式，選定0.5 h、1 h、1.5 h、2.0 h四段加熱回流時間對樣品進(jìn)行提取，通過對比實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流1 h時，樣品中秦皮乙素的提取率較高，隨著加熱回流時間的持續(xù)增加，樣品中秦皮乙素的提取率幾乎無變化，表明樣品中的秦皮乙素已被完全提取出來，從節(jié)約試劑耗材角度出發(fā)，將樣品的提取時間定為1 h。

4 小結(jié)

本研究通過一系列探索實驗，結(jié)合八味秦皮丸功能主治及質(zhì)控需求、處方藥材的采收情況等因素，初步建立了秦皮、鐵針礦、寒水石、朱砂的顯微鑒別項、秦皮和風(fēng)毛菊的TLC鑒別項、朱砂(HgS)和秦皮乙素的含量測定項，并基于八味秦皮丸處方，結(jié)合生產(chǎn)工藝和藥材活性成分轉(zhuǎn)移率，初步制定了朱砂和秦皮乙素的含量限值。通過一系列方法學(xué)驗證實驗表明，該質(zhì)控方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，簡單易操作，可作為藏藥八味秦皮丸的質(zhì)量控制依據(jù)。