姜 焱，李佳陽(yáng)，伍紅瑜，陳保林，程曉明，呂俊遠(yuǎn)

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a. 普通外科; b. 乳腺甲狀腺外科; c. 藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu), 貴州 遵義 563099; 2. 遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨民族藥教育部國(guó)際聯(lián)合研究實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563000)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤的23%，也是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)性死亡的主要原因，全球每年有超過(guò)60萬(wàn)人死于乳腺癌[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展通常是由遺傳易感性和環(huán)境暴露之間復(fù)雜的相互作用而引起的[2-3]。越來(lái)越多的研究表明，遺傳因素在癌癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且目前有許多基因已被鑒定為癌癥易感基因[4]。

鼠雙微體4(mouse double minute 4,MDM4)基因位于染色體1q32，該基因編碼一種核蛋白，在N端含有腫瘤抑制基因p53的結(jié)合域，其可通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活域抑制p53，進(jìn)而參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)可影響基因和蛋白水平的穩(wěn)定性[6]，rs424539是MDM4基因目前研究較多的SNP位點(diǎn)，許多研究已表明MDM4rs4245739的基因多態(tài)性可影響MDM4的表達(dá)進(jìn)而影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。Liu等[7]的研究發(fā)現(xiàn)MDM4rs4245739的基因多態(tài)性可降低乳腺癌發(fā)生的易感性；而相反地，Hashemi等[8]的研究表明乳腺癌易感性與MDM4rs4245739的基因多態(tài)性無(wú)關(guān)；而Wang等[9]通過(guò)meta分析發(fā)現(xiàn)，MDM4rs4245739的基因多態(tài)性與亞洲人乳腺癌易感性呈負(fù)相關(guān)，但該meta分析納入研究不全，未將Montserrat 等[10]的研究納入。因此，本研究通過(guò)meta分析現(xiàn)有研究，旨在探討MDM4rs4245739的基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1檢索策略 我們?cè)赑ubMed、EMBASE、Cochrane Library、中國(guó)知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)和萬(wàn)方電子數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)文獻(xiàn)。以下所有的關(guān)鍵詞均在各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索：“乳腺癌”、“乳腺腫瘤”、“breast cancer”、“breast tumor”、“breast malignance”、“鼠雙微體4”、“MDM4”、“HDMX”、“MDMX”、“MRP1”、“單核苷酸多態(tài)性”、“基因多態(tài)性”、“基因亞型”、“基因突變”、“基因變異”、“single nucleotide polymorphism”、“SNP”、“gene polymorphism”、“gene subtype”、“gene mutation”、“gene variation”。此外，還對(duì)合格文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)和相似文獻(xiàn)列表進(jìn)行了審查，以確保檢索到所有可能合格的文獻(xiàn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) (1)病例-對(duì)照研究； (2)關(guān)于MDM4基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的相關(guān)性研究；(3)可獲取全文； (4)有足夠的基因型分布數(shù)據(jù)，可用于計(jì)算OR和95%CI；(5)健康對(duì)照者人群的基因型分布必須符合Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE) 。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) (1)無(wú)健康對(duì)照者的研究；(2)無(wú)詳細(xì)乳腺癌患者數(shù)、健康對(duì)照者數(shù)和一些其他重要信息；(3)排除綜述和數(shù)據(jù)重復(fù)文獻(xiàn)。

1.4數(shù)據(jù)提取和質(zhì)量評(píng)估 對(duì)所有符合條件的納入文獻(xiàn)，提取了以下數(shù)據(jù)：作者、發(fā)表年份、地區(qū)、種族、樣本量以及病例和健康對(duì)照者的基因型頻率。兩位作者獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，并基于修正的紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)評(píng)估納入文獻(xiàn)的質(zhì)量[11]。NOS是一種半定量的評(píng)分表，總分從0分(最低質(zhì)量)到9分(最高質(zhì)量)，評(píng)分為5～9分表示高質(zhì)量。兩名獨(dú)立的作者對(duì)這些研究進(jìn)行了獨(dú)立的評(píng)分，如果對(duì)同一篇文章的評(píng)分結(jié)果不同，則通過(guò)討論解決評(píng)分的分歧。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Stata 15.1軟件(Stata Corporation, University Station, Texas, USA)對(duì)所有相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用卡方檢驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)病例和健康對(duì)照者的等位基因和基因型頻率，以評(píng)估HWE值。通過(guò)OR和95% CI估計(jì)在等位基因模型(C vs A)、顯性基因模型(AC+CC vs AA)、隱性基因模型(AC+AA vs CC)、雜合子基因模型(AC vs AA)、純合基因模型(CC vs AA)下的MDM4rs4245739基因多態(tài)性與乳腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。異質(zhì)性檢驗(yàn)采用Q檢驗(yàn)，用I2進(jìn)行量化，當(dāng)P>0.05或I2<50%時(shí)表示異質(zhì)性較小，則采用固定效應(yīng)模型。相反，則選擇隨機(jī)效應(yīng)模型[12]。當(dāng)發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的異質(zhì)性時(shí)，進(jìn)行亞組分析和meta回歸分析，探討研究中可能的異質(zhì)性來(lái)源。我們還通過(guò)逐一排除法進(jìn)行了敏感性分析，以確定每個(gè)研究對(duì)總體異質(zhì)性的影響，以評(píng)估總體結(jié)果的穩(wěn)定性。采用Begg's漏斗圖和Egger's線性回歸來(lái)評(píng)估可能的發(fā)表偏倚[13]。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1納入研究的特征 經(jīng)過(guò)初步檢索，總共確定了289篇文獻(xiàn)。通過(guò)剔除重復(fù)、篩選標(biāo)題和摘要后排除272篇文獻(xiàn)。其中保留了17項(xiàng)研究進(jìn)行全文閱讀和審查，另有12篇研究因下列原因被排除：系統(tǒng)性綜述文章4篇[9, 14-16]；關(guān)于非rs4245739位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究2篇[17-18]；無(wú)健康對(duì)照者6篇[19-24]。最后，有5篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)被納入本meta分析，涉及9 814名乳腺癌患者和45 202名健康對(duì)照者[7, 8, 10, 25-26]，見(jiàn)圖1。在健康對(duì)照者的基因型分布中，所有研究都與HWE一致。所有納入研究的特征見(jiàn)表1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

2.2Meta分析結(jié)果 本研究共納入5篇病例-對(duì)照文獻(xiàn)(含6項(xiàng)研究)來(lái)匯總數(shù)據(jù)分析MDM4rs4245739多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性。結(jié)果顯示，MDM4rs4245739基因多態(tài)性與乳腺癌易感性在任何遺傳模型中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性：等位基因模型 (C vs A:OR=0.84, 95%CI: 0.67-1.05,P=0.118)，顯性基因模型 (AC+CC vs AA:OR=0.86, 95%CI: 0.67-1.11,P=0.245)，隱性基因模型(AC+AA vs CC:OR=0.90, 95%CI: 0.61-1.32,P=0.585)，雜合子基因模型 (AC vs AA:OR=0.88, 95%CI: 0.69-1.12,P=0.305)，純合子基因模型(CC vs AA:OR=0.90, 95%CI: 0.59-1.39,P=0.649)，見(jiàn)圖2～6。

圖2 等位基因模型(C vs A)的森林圖

圖3 顯性基因模型(AC+CC vs AA)的森林圖

圖4 隱性基因模型(AC+AA vs CC)的森林圖

圖5 雜合子基因模型(AC vs AA)的森林圖

圖6 純合子基因模型(CC vs AA)的森林圖

2.3異質(zhì)性檢驗(yàn) 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示MDM4rs4245739 的5種基因模型間均存在顯著差異性：等位基因模型 (C vs A:I2=90.9%,P=0.000)，顯性基因模型 (AC+CC vs AA:I2=90.0%,P=0.000)，隱性基因模型 (AC+AA vs CC:I2=70.0%,P=0.005)，雜合子基因模型 (AC vs AA:I2=87.6%,P=0.000)，純合子基因模型 (CC vs AA:I2=75.2%,P=0.001)。因此，采用隨機(jī)效應(yīng)模型來(lái)分析數(shù)據(jù)。為了闡明異質(zhì)性的來(lái)源，我們進(jìn)行了亞組和meta回歸分析。亞組分析和meta回歸結(jié)果顯示，健康對(duì)照者的地區(qū)分布和來(lái)源可能是導(dǎo)致異質(zhì)性的主要來(lái)源，見(jiàn)圖2～6，表2～3。

表2 亞組分析結(jié)果

表3 Meta回歸結(jié)果

2.4敏感性分析 敏感性分析采用逐一排除法來(lái)評(píng)估每篇文獻(xiàn)對(duì)meta分析總體結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在排除Montserrat等[10]研究后結(jié)果發(fā)生了改變，提示研究結(jié)果會(huì)受到該研究的影響，見(jiàn)圖7。

圖7 5種基因模型的敏感性分析 a. C vs A; b. AC+CC vs AA; c. AC+AA vs CC; d. AC vs AA; e. CC vs AA

2.5發(fā)表偏倚 采用Begg’s漏斗圖和Egger’s線性回歸檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估發(fā)表偏倚。漏斗圖存在不對(duì)稱性，提示發(fā)表偏倚可能。為此我們進(jìn)一步使用Egger’s線性回歸檢驗(yàn)評(píng)估發(fā)表偏倚風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果提示：等位基因模型(C vs A: PBegg’s=0.260, PEgger’s=0.044)，顯性基因模型(AC+CC vs AA: PBegg’s=0.452, PEgger’s=0.100)，隱性基因模型(AC+AA vs CC: PBegg’s=0.707, PEgger’s=0. 069)，雜合子基因模型(AC vs AA: PBegg’s=0.452, PEgger’s=0.143) 和純合子基因模型(CC vs AA: PBegg’s=0.707, PEgger’s=0.090)，見(jiàn)圖8。

圖8 5種基因模型發(fā)表偏倚檢驗(yàn)的Begg's漏斗圖 a. C vs A; b. AC+CC vs AA; c. AC+AA vs CC; d. AC vs AA; e CC vs AA

2.6GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 本數(shù)據(jù)庫(kù)包含1 085例乳腺癌組織和291例正常乳腺組織樣本，分析結(jié)果顯示MDM4的表達(dá)水平與正常對(duì)照者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與乳腺癌的腫瘤分期和預(yù)后無(wú)關(guān)，見(jiàn)圖9。

圖9 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析圖 a. MDM4在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況; b. MDM4在乳腺癌不同臨床分期中的表達(dá)情況; c. 乳腺癌患者M(jìn)DM4表達(dá)與無(wú)病生存率的關(guān)系; d 乳腺癌患者M(jìn)DM4表達(dá)與總生存率的關(guān)系

3 討 論

盡管分子生物研究提示MDM4可以通過(guò)調(diào)控p53參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]，但通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的大樣本分析發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比乳腺癌組織中MDM4的表達(dá)量無(wú)顯著變化，提示在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中缺乏推動(dòng)MDM4表達(dá)量變化進(jìn)而參與乳腺癌的因素。進(jìn)一步從生物學(xué)機(jī)制而言，SNP是通過(guò)影響基因、蛋白的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)作用[6]，而meta分析發(fā)現(xiàn)MDM4rs4245739與乳腺癌無(wú)關(guān)，由此提示MDM4rs4245739這一SNP位點(diǎn)可能對(duì)MDM4表達(dá)無(wú)顯著影響。此外，從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析角度看，我們?cè)诩{入的文獻(xiàn)中觀察到顯著的異質(zhì)性，異質(zhì)性是指納入研究結(jié)果之間的差異程度。強(qiáng)異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致meta分析的匯總數(shù)據(jù)的評(píng)估效度降低。為了進(jìn)一步探討納入研究中異質(zhì)性的可能來(lái)源和其他影響異質(zhì)性的積極因素，我們根據(jù)種族、地區(qū)、樣本量、基因分型檢測(cè)方法和健康對(duì)照者的來(lái)源進(jìn)行了亞組分析和meta回歸分析。結(jié)果表明，健康對(duì)照者的地區(qū)分布和來(lái)源可能是異質(zhì)性的主要來(lái)源。值得注意的是，這一結(jié)論是納入Montserrat等[10]的研究而得出的?？紤]到這篇文章是異質(zhì)性的來(lái)源，為此我們刪除了該文獻(xiàn)[10]并重新合并，在移除該研究后確實(shí)改變了結(jié)論，即MDM4rs4245739等位基因模型、隱性基因模型、純合子基因模型均提示其基因多態(tài)性與乳腺癌易感性之間呈負(fù)相關(guān)，這與Wang等[9]的結(jié)論一致；但在移除該研究[10]后，在顯性基因模型和雜合子基因模型中，MDM4rs4245739基因多態(tài)性仍與乳腺癌易感性無(wú)關(guān)。為此，我們?cè)噲D通過(guò)敏感性分析來(lái)探索混雜因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Montserrat等[10]的研究對(duì)meta分析結(jié)論有影響，這可能與其樣本量大有關(guān)。而Begg’s漏斗圖和Egger’s線性回歸提示存在發(fā)表偏倚可能，由于納入研究數(shù)量少，有可能影響上述方法對(duì)發(fā)表偏倚的檢驗(yàn)效能。

當(dāng)然該meta分析也存在一些局限性：第一，分析的樣本量較少，有限的樣本量往往伴隨著選擇的偏差。第二，在整體的meta分析和亞組分析中都觀察到異質(zhì)性，這表明潛在的因素可能會(huì)導(dǎo)致研究之間的異質(zhì)性，我們利用隨機(jī)效應(yīng)模型最小化了這一問(wèn)題的可能性。第三，MDM4rs4245739位于一個(gè)約230kb的連鎖不平衡區(qū)，該區(qū)也包含tRNALys轉(zhuǎn)錄本和癌基因PIK3C2B[10]，MDM4基因多態(tài)性的基因-基因相互作用對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響未能闡明。第四，不同分子亞型乳腺癌具有不同的生物學(xué)、臨床和分子特征[27]，但由于納入研究數(shù)據(jù)有限，無(wú)法按照分子分型進(jìn)行亞組分析。

綜上所述，MDM4rs4245739基因多態(tài)性與乳腺癌易感性無(wú)相關(guān)性。考慮到上述局限性，未來(lái)需要按照乳腺癌分子分型進(jìn)行大規(guī)模的病例對(duì)照研究，以進(jìn)一步明確兩者之間的關(guān)系。