姜志平，李風(fēng)艷

0 引言

蛋白激酶(Protein kinases，PKs)占人類基因組所有基因的1.7%，通過改變底物活性或位置，與其他蛋白相互作用或通過控制代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡和分化來介導(dǎo)真核細(xì)胞中的大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[1]。PKs調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，特別是在檢查點(diǎn)過程中，是腫瘤中備受關(guān)注的治療標(biāo)靶。其中，永不參與有絲分裂蛋白(Never in mitosis gene A,NIMA)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的不同方面起著至關(guān)重要的作用。NIMA最初是在真菌曲霉中被發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸激酶(79kDa)，對(duì)進(jìn)入有絲分裂至關(guān)重要。研究表明，NIMA在細(xì)胞分裂的所有階段均發(fā)揮作用[2]。在哺乳動(dòng)物中，有11種PKs在其催化結(jié)構(gòu)域中與NIMA具有40%～50%的氨基酸序列同一性[3]，因此被稱為NEKs-NIMA相關(guān)激酶(NIMA related kinases，NEKs)。

中心體分離相關(guān)激酶(Never in mitosis gene A related kinase，NEKs)是代表NEK1-NEK11[4]的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，定位于纖毛、中心體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中[1]。大量研究表明，NEKs參與多種細(xì)胞功能，并且因與癌癥發(fā)展相關(guān)的靶標(biāo)通路相關(guān)，其家族內(nèi)成員成為備受關(guān)注的藥物靶標(biāo)[5]。其中，NEK2是由NEK2基因編碼的位于中心體的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞周期進(jìn)程中必不可少的酶，尤其是在通過磷酸化不同底物的有絲分裂調(diào)控中[6]。由于NEK2在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，通常在中心體分離、微管組織、染色質(zhì)凝結(jié)和紡錘體裝配檢查點(diǎn)中發(fā)揮重要作用，因此其上調(diào)直接導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)[7]。NEK2水平上調(diào)會(huì)導(dǎo)致中心體異常和單極紡錘體形成，并通過破壞有絲分裂檢查點(diǎn)的控制來促進(jìn)非整倍性[8]。越來越多的研究表明，NEK2在腫瘤中的表達(dá)增加，并且NEK2的上調(diào)與多種類型的腫瘤進(jìn)展、耐藥性、不良預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此，本文就NEK2在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性中的作用機(jī)制作一綜述。

1 NEK2的結(jié)構(gòu)及其剪接異構(gòu)體

人類的NEK2基因位于1號(hào)染色體上，由8個(gè)外顯子組成。NEK2是最接近NIMA的哺乳動(dòng)物同種型，其結(jié)構(gòu)具有位于氨基末端的絲氨酸-蘇氨酸結(jié)構(gòu)域和多個(gè)調(diào)節(jié)基序，如亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、中心體和微管定位位點(diǎn)、蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，PP1)結(jié)合位點(diǎn)、KEN-box、核仁定位位點(diǎn)、后期促進(jìn)復(fù)合物(Anaphase-promoting complex，APC)結(jié)合位點(diǎn)和位于羧基末端位點(diǎn)的破壞盒(Destruction box，D-box)[10]。哺乳動(dòng)物中的NEK2具有3個(gè)剪接異構(gòu)體：NEK2A、NEK2B和NEK2C。

NEK2A是研究最多的剪接異構(gòu)體，是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻分布[5]。其在催化結(jié)構(gòu)域上與NIMA的同一性為47%，與Aurora-A(一種參與正常細(xì)胞分裂的人絲氨酸/蘇氨酸激酶)在結(jié)構(gòu)上也有31%相同[11]。人NEK2A是由445個(gè)氨基酸(48 kDa)構(gòu)成的蛋白質(zhì)，包含N端激酶結(jié)構(gòu)域和C端非催化調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。NEK2A N末端激酶結(jié)構(gòu)域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的所有典型基序。C末端區(qū)域具有多個(gè)調(diào)節(jié)基序，調(diào)節(jié)NEK2A的活性、位置和穩(wěn)定性。有研究表明，NEK2A可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂中起作用，如紡錘體檢查點(diǎn)信號(hào)和染色體分離[12]。

NEK2B是長(zhǎng)度為384個(gè)氨基酸(44 kDa)的蛋白質(zhì)，通過使用末端內(nèi)含子內(nèi)的另一個(gè)聚腺苷酸化位點(diǎn)產(chǎn)生，與NEK2A的羧基末端不同，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中[5]，貫穿有絲分裂整個(gè)過程。它可以通過其底物的可逆磷酸化來調(diào)節(jié)有絲分裂中心體的分離，從而調(diào)節(jié)中心體的聚集和分離[13-14]。Fletcher等[12]證明,僅NEK2B的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂延遲，從而導(dǎo)致有絲分裂缺陷，如形成多核細(xì)胞。

NEK2C來自另一剪接事件，從全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的羧基末端結(jié)構(gòu)域中切除了8個(gè)氨基酸序列，與許多在有絲分裂中起作用的蛋白激酶相似，主要分布在細(xì)胞核中[5]。

2 NEK2在腫瘤中的作用

在細(xì)胞周期的G1期，NEK2表達(dá)較低，在S期和G2期升高，在G2/M后期達(dá)到峰值，并在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂時(shí)降低。與其他階段相比，S期和G2期的NEK2活性更強(qiáng)。NEK2在細(xì)胞周期的G2/M期開始中心體分離。NEK2過表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞中染色體不穩(wěn)定和非整倍性。此外，NEK2過表達(dá)激活了幾種致癌途徑和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而導(dǎo)致異常細(xì)胞分化、腫瘤增殖、耐藥性和預(yù)后不良[15]。有研究表明，NEK2耗竭影響了動(dòng)植物微管的附著，導(dǎo)致紡錘體檢查點(diǎn)失衡和著絲粒成分異常聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)靶向微管的抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的敏感性增加[16]。NEK2耗竭的細(xì)胞具有通過不同類別誘導(dǎo)異常有絲分裂的特征。首先，NEK2耗竭會(huì)干擾中心體復(fù)制或成熟以及包括γ-微管蛋白、P1k1(一種細(xì)胞周期激酶)和核磷素/B23在內(nèi)的蛋白質(zhì)在有絲分裂紡錘體極上的排列。其次，NEK2耗竭誘導(dǎo)人類細(xì)胞中異常的染色體分離。再次，NEK2耗竭干擾中心體分離的調(diào)控。最后，由于有絲分裂錯(cuò)誤，NEK2耗竭會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯并增加凋亡[17]。

3 NEK2與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性

3.1 NEK2與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性 乳腺癌(Breast cancer，BC)是女性第二大主要死因。根據(jù)雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)和ErbB-2/人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)的表達(dá)情況分成4種亞型，分別為：ER/PR+/Her2-、ER/PR/Her2+、ER/PR-/Her2+和ER/PR/Her2-(三陰性)。在所有乳腺癌類型中，平均復(fù)發(fā)時(shí)間為5年，而三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)的平均復(fù)發(fā)時(shí)間為2.6年，與患者生存不良有關(guān)[18]。與其他亞型相比，TNBC由于潛在靶向分子的缺乏，治療更加困難。PTX是單獨(dú)或與其他抗腫瘤藥如吉西他濱或蒽環(huán)類藥物聯(lián)合使用的、TNBC患者最常用的細(xì)胞毒性化療藥物之一。PTX最初對(duì)TNBC有效，但因劑量限制的毒性和耐藥性的迅速發(fā)展而受到抑制。Roberts等[19]以TNBC作為模型，對(duì)PTX抗藥性的可治療靶向介體進(jìn)行了研究。有報(bào)道，LIN9(細(xì)胞周期進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)的過表達(dá)與BC預(yù)后較差有關(guān)，而在TNBC病例中約65%的LIN9過表達(dá)[20]。Roberts等[19]發(fā)現(xiàn)，在TNBC PTX抗性細(xì)胞中，LIN9及其下游轉(zhuǎn)錄標(biāo)靶NEK2表達(dá)水平上調(diào)，通過藥理學(xué)抑制或通過遺傳抑制LIN9或NEK2可使細(xì)胞對(duì)PTX敏感并逆轉(zhuǎn)PTX耐藥性，表明LIN9/NEK2途徑是PTX抗藥性的可治療靶向介質(zhì)，可用于改善對(duì)該核心化學(xué)療法的反應(yīng)。

3.2 NEK2與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性 卵巢癌(Ovarian cancer，OC)因臨床表現(xiàn)晚、復(fù)發(fā)率高而被認(rèn)為是最致命的婦科惡性腫瘤[21]。晚期OC患者5年生存率低至25%，OC是女性死亡的第5大主要原因[22]。PCAT1是在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中高度表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)，在多種腫瘤中起上調(diào)癌基因的作用[23]。NEK2被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為PCAT1的潛在靶基因。Liu等[24]在OC細(xì)胞系OVCAR3、A2780中發(fā)現(xiàn)，PCAT1過表達(dá)后，NEK2的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)；siRNA轉(zhuǎn)染沉默NEK2的表達(dá)后，顯著抑制了OC細(xì)胞的遷移能力；在PCAT1轉(zhuǎn)染的OVCAR3、A2780中，Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和C-myc顯著上調(diào)，表明Wnt通路激活；而敲低NEK2的表達(dá)可以消除PCAT1誘導(dǎo)的Wnt通路的激活，表明NEK2可能通過PCAT1/Wnt/NEK2通路調(diào)節(jié)OC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Xia等[25]對(duì)PTX抗性O(shè)C組織(SKOV3/PTX)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NEK2明顯升高，當(dāng)circTNPO3(一種環(huán)狀RNA，circRNA)敲低或miR-1299過表達(dá)可使SKOV3/PTX的NEK2極大下降，添加miR-1299抑制劑后，NEK2下降程度明顯恢復(fù)，提示OC PTX抗性中可能存在circTNPO3/miR-1299/NEK2軸。Uddin等[26]對(duì)OC組織獲得性順鉑耐藥性(Development of acquired resistance to cisplatin，CDDP)的發(fā)展進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)基因ALDH1A1在耐藥(A2780-Cp)/超耐藥(SKOV3-Cp)細(xì)胞中均過表達(dá)，siRNA沉默A2780和A2780-Cp細(xì)胞中的ALDH1A1大大減少了干細(xì)胞的數(shù)量，并使細(xì)胞對(duì)CDDP敏感；ALDH1A1沉默降低了其下游目標(biāo)NEK2的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平；同時(shí)發(fā)現(xiàn)ALDH1A1或NEK2沉默導(dǎo)致ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCB1/MDR1、ABCG2和ABCC1/MRP1)的下調(diào)，NEK2過表達(dá)導(dǎo)致ABCB1/MDR1的上調(diào)，提示ALDH1A1-NEK2-ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑參與OC組織CDDP抗性。

3.3 NEK2與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率和死亡率較高，是全世界與腫瘤相關(guān)死亡的第三大主要原因[27]。早期HCC患者的5年生存率超過70%，而晚期HCC患者的5年生存率不到5%[28]。Lai等[29]通過免疫組化檢測(cè)了52個(gè)HCC組織中NEK2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)程度明顯上升；經(jīng)NEK2 siRNA轉(zhuǎn)染的人HCC細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖、集落形成及細(xì)胞活力顯著降低；細(xì)胞凋亡分析表明，NEK2 siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出比對(duì)照組高得多的凋亡指數(shù)；蛋白質(zhì)印跡分析表明，NEK2 siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，β-catenin、C-Myc、CycD1、CycB1、CDK1和CycE蛋白的表達(dá)減少，這些蛋白都參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)的β-catenin/Wnt途徑，表明NEK2通過調(diào)節(jié)β-catenin/Wnt途徑誘導(dǎo)HCC細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖。索拉非尼是晚期HCC患者的一線治療藥物，與總體生存獲益相關(guān)，但緩解率并不令人滿意[30]。Deng等[31]對(duì)與索拉非尼耐藥相關(guān)的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)NEK2過表達(dá)抑制了索拉非尼治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制，而沉默NEK2后顯著加強(qiáng)了索拉非尼治療效果；異種移植腫瘤模型顯示，與敲除NEK2或僅索拉非尼治療組相比，NEK2抑制和索拉非尼治療的組合可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)；發(fā)現(xiàn)NEK2可以結(jié)合索拉非尼治療的HCC細(xì)胞系中的β-catenin，并調(diào)節(jié)其泛素化，促進(jìn)其核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，并且證實(shí)NEK2/β-catenin可促進(jìn)HCC對(duì)索拉非尼的耐藥性。另一項(xiàng)關(guān)于HCC耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的NEK2在HCC中通過促進(jìn)PP1/Akt和Wnt途徑活化而促進(jìn)HCC的進(jìn)展和耐藥性[32]。

3.4 NEK2與其他腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性 NEK2還參與其他腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性。宮頸癌(Cervical cancer，CC)也是婦科常見惡性腫瘤之一，每年約有45萬新診斷病例[33]。Ji等[34]對(duì)72個(gè)CC組織、54個(gè)癌旁組織及CC細(xì)胞系HeLa進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NEK2可能通過lncRNA SNHG1/miR-195/NEK2軸參與CC的發(fā)生發(fā)展。目前，CC的主要診療方式是手術(shù)、放療、化療和免疫療法。對(duì)于局部晚期CC患者，同時(shí)放化療可明顯改善其生存。但癌細(xì)胞的抗輻射性被認(rèn)為是治療失敗的主要因素。Xu等[35]對(duì)CC放射線耐藥相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NEK2通過誘導(dǎo)Wnt1的表達(dá)以激活Wnt/β-catenin軸，從而導(dǎo)致CC的發(fā)生和放射抵抗。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是較為常見的腦腫瘤，主要治療方式包括：藥物治療、手術(shù)切除和放療。其中，放療是輔助治療方法，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存有利。但神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放射抗性使其治療效果大打折扣[36]。Guan等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中，circPITX1(一種circRNA)和NEK2的表達(dá)上調(diào)，而miR-329-3p的表達(dá)下降；雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定證實(shí)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在circPITX1/miR-329-3p/NEK2軸，并參與其放射抗性。胰腺癌由于其快速發(fā)展和對(duì)化療的耐藥性，是最難治的癌癥之一。Kokuryo等[38]在胰腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了NEK2的過表達(dá)，在胰腺癌異種移植小鼠模型中，使用熒光標(biāo)記的NEK2 siRNA和脂質(zhì)體混合物通過門靜脈導(dǎo)管系統(tǒng)給藥，1 h后在肝臟中鑒定出來熒光標(biāo)記的NEK2 siRNA，并且發(fā)現(xiàn)NEK2 siRNA抑制了腹膜擴(kuò)散中的腫瘤生長(zhǎng)，減少了肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量和面積，延長(zhǎng)了模型小鼠的存活時(shí)間，由此提出沉默NEK2有望成為具有肝轉(zhuǎn)移和腹膜擴(kuò)散的胰腺癌的一種新型治療策略。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌病例的85%[39]。表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的酪氨酸激酶(Tyrosine kinase，TK)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變，與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。EGFR的酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)已作為晚期EGFR突變型NSCLC的一線治療。接受EGFR-TKIs治療的大部分患者顯示出良好的治療反應(yīng)，與化療相比，其無進(jìn)展生存期和總生存期也大大提高，但大多數(shù)患者最終會(huì)產(chǎn)生耐藥性，這是治療失敗的主要原因[40]。Chen等[41]發(fā)現(xiàn)，EGFR突變通過激活ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NEK2表達(dá)，升高的NEK2促進(jìn)細(xì)胞周期快速發(fā)展、EGFR突變的NSCLC細(xì)胞快速增殖，并抑制細(xì)胞凋亡，從而削弱TKIs治療效果，而耗竭NEK2的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)，并提高EGFR-TKIs的功效，提示NEK2可能為克服耐藥性、改善EGFR突變的NSCLC患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

4 結(jié)語

NEK2可以通過多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與人類惡性腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥。惡性腫瘤治療效果常因耐藥性而不盡人意。因此，繼續(xù)深入研究NEK2在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性中的作用機(jī)制，對(duì)于惡性腫瘤靶向治療、克服耐藥性有重大意義。