樊榮，李龍，喬中原，王俊平，張琪，馬磊

1西安市第一醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710002；2西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科

近年來隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，心肌梗死發(fā)生率逐年升高［1］。心肌梗死特別是急性心肌梗死多數(shù)需手術(shù)治療，而在溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療中患者有可能發(fā)生心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），這是導(dǎo)致患者發(fā)生死亡的原因之一，而減少M(fèi)IRI的發(fā)生是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界急需解決的問題［2］。白楊素學(xué)名5，7-二羥基黃酮，是蜂膠的主要有效成分，研究顯示［3］，白楊素具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性，此外還有研究報(bào)道［4］其對(duì)腦MIRI具有治療作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)黃酮類藥物在預(yù)防MIRI中具有良好療效［5］，但關(guān)于同樣為黃酮類藥物的白楊素對(duì)MIRI的研究國內(nèi)還沒有相關(guān)研究報(bào)道，為此本研究從環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達(dá)嘗試探討白楊素對(duì)MIRI的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物60只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（陜）2018-001，飼養(yǎng)環(huán)境：濕度40%～60%，溫度22～26℃，光照/黑暗=12 h/12 h。

1.2 藥物與試劑白楊素（純度98%，CAS編號(hào)：480-40-0，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司）；雷米普利（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030723，規(guī)格：1.25 mg×14片×2板/盒）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）試劑盒（武漢華美生物科技公司，貨號(hào)分別為：CSB-E11987r、CSBE08055r和CSB-E04595r）；環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab283593、ab236134和ab245355）；辣根酶標(biāo)記的二抗（武漢谷歌生物，貨號(hào)：G1213-100UL）；引物購于上海生物生工。

1.3 儀器C8000型全自動(dòng)生化分析儀（美國雅培公司）；Infinite F50型酶標(biāo)儀［勒菲生物科技（上海）有限公司］；TDL80型低溫高速離心機(jī)（德國BC公司）；DW-HL678型超攝氏度超低溫冰箱（美菱生物醫(yī)療）；BR型凝膠電泳儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；QuantStudio 3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（賽默飛世爾中國）。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 分組及治療按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、雷米普利組及白楊素低、中、高劑量組，每組10只。各組均預(yù)防治療1周，其中假手術(shù)組和模型組灌胃1.0 mL/（kg·d）生理鹽水，雷米普利組灌胃雷米普利1.0 mL/（kg·d），白楊素低、中、高劑量組分別灌胃白楊素10、20和40 mL/（kg·d）。

1.4.2 MIRI模型構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法［6］構(gòu)建MIRI動(dòng)物模型，大鼠于手術(shù)前日分批次禁食不禁水12 h，于次日9點(diǎn)到下午4點(diǎn)構(gòu)建模型。將大鼠采用5 mL/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，監(jiān)測心電圖；沿左側(cè)胸第三和第四肋骨間行開胸手術(shù)并暴露心臟，先在左心耳1～1.5 mm處進(jìn)針，左前降支后出針，拉緊結(jié)扎線，當(dāng)肉眼可見左心室蒼白明顯，心電圖ST段抬高即缺血造模成功。結(jié)扎30 min后恢復(fù)供血120 min，實(shí)現(xiàn)再灌注損傷。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.4.3 心肌組織和血液收集方法MIRI模型構(gòu)建成功后采用股動(dòng)脈取血法收集血液，置入抗凝管中保存?zhèn)溆?，后取出心臟，將心臟橫切成二部分，一部分置于組織固定液中用于檢測心肌組織病理學(xué)，一部分置于超低溫冰箱中用于蛋白和mRNA檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 生化指標(biāo)檢測由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院檢驗(yàn)科完成心肌酶譜指標(biāo)肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzymes，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血漿肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）及血清和心肌組織炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10水平檢測。

1.5.2 心肌組織病理學(xué)檢測采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin，HE）觀察心肌組織病理學(xué)，具體操作按照文獻(xiàn)報(bào)道［7］方法進(jìn)行，從固定液中取出心臟組織，依次經(jīng)自來水反復(fù)沖洗、石蠟包埋、切片（5 μm左右）、洗滌、蘇木精染色、伊紅復(fù)染、脫水、封片，圖片采集用熒光倒置顯微鏡，每張切片選取4個(gè)不同視野。

1.5.3 COX-2與NOS蛋白表達(dá)檢測采用蛋白印跡法（Western Blotting）觀察心肌組織COX-2和NOS蛋白表達(dá)，稱取100 mg心肌組織用組織裂解液裂解后提出上清BCA法定量后調(diào)平，每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，完成后裁剪目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，采用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入1抗孵育（COX-2為1∶1000，NOS為1∶2000；GAPDH為1∶3000），洗滌3次后加入2抗孵育（1∶3000），再次洗滌3次后暗室ECL法曝光洗片。以所測指標(biāo)條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 COX-2與NOS的mRNA檢測采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測心肌組織COX-2和NOS的mRNA表達(dá)，稱取20 mg心肌組織，總RNA提取試劑盒提取總RNA后每組各取2 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，以GAPDH作內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法比較分析。引物序列為COX-2上游引物：5'-CGTAGCTTGAGGCAGAGTGACTGC-3'，下 游 引物：5'-GATTTGGCGATT-GCTGCTCAGCT-3'，產(chǎn)物長度：102 bp；NOS上 游 引 物：5'-TCCATGGGTTTGCCACACTC-3'，下游引物：5'-AAGAGCCAAGCAAAGGCGA-3'，產(chǎn)物長度：94 bp；GAPDH上游引物：5'-GGACTAGCTACTGACCCTC-3'，下游引物：5'-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，產(chǎn)物長度：117 bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理學(xué)假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，纖維大小基本均一，模型組出現(xiàn)明顯心肌纖維斷裂，排列無次序，相較于模型組，各治療組心肌纖維均好轉(zhuǎn)，但較假手術(shù)組差。白楊素中、高劑量組效果好于雷米普利組。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×400）

2.2 心功能與假手術(shù)組相比，模型組CK、CK-MB、LDH和cTnl均升高（P＜0.05）；各治療組CK、CK-MB、LDH和cTnl較模型組降低（P＜0.05）。白楊素中、高劑量組與雷米普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），白楊素低劑量組差于雷米普利組，且除cTnl外，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌酶學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠血清心肌酶學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與雷米普利組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組雷米普利組白楊素低劑量組白楊素中劑量組白楊素高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 CK（U/L）315.21±37.83 1736.90±265.35*1267.26±165.38#1379.51±185.31#△1276.54±158.25#1242.68±148.68#CK-MB（U/L）204.74±18.48 1307.25±265.38*926.37±176.58#1034.51±135.86#△936.21±117.32#921.53±119.28#LDH（U/L）558.29±160.21 1704.18±369.13*1138.26±204.82#1283.24±189.31#△1205.33±147.35#1162.16±180.17#cTnl（ng/mL）0.83±0.08 1.36±0.20*1.02±0.08#1.07±0.11#1.05±0.12#1.04±0.08#

2.3 心肌和血清中炎性因子與假手術(shù)組比較，模型組血清和心肌組織TNF-α和IL-1β均升高（P＜0.05），IL-10降低（P＜0.05）；各治療組TNF-α和IL-1β低于模型組（P＜0.05），IL-10高于模型組（P＜0.05）；白楊素低劑量組對(duì)心肌組織TNF-α影響差于雷米普利組（P＞0.05）。見表2—3。

表2 各組大鼠血清炎性因子比較（±s） ng/mL

表2 各組大鼠血清炎性因子比較（±s） ng/mL

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組雷米普利組白楊素低劑量組白楊素中劑量組白楊素高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 TNF-α 0.14±0.02 0.42±0.01*0.27±0.02#0.28±0.01#0.25±0.01#0.25±0.01#IL-1β 0.25±0.03 0.82±0.05*0.51±0.04#0.56±0.04#0.54±0.01#0.52±0.05#IL-10 0.12±0.03 0.07±0.02*0.11±0.02#0.09±0.03#0.09±0.02#0.10±0.02#

2.4 相關(guān)酶蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組COX-2和NOS蛋白及mRNA表達(dá)均升高（P＜0.05），而各給藥組COX-2和NOS蛋白及mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05）；白楊素高劑量組COX-2蛋白及mRNA表達(dá)低于雷米普利組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4及圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織中COX-2和NOS蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠心肌組織中COX-2和NOS蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中COX-2和NOS蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果（±s）

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與雷米普利組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組雷米普利組白楊素低劑量組白楊素中劑量組白楊素高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 COX-2蛋白0.35±0.07 0.92±0.16*0.65±0.13#0.79±0.10#△0.61±0.15#0.45±0.11#△mRNA 1.00±0.00 2.87±0.37*1.74±0.21#1.92±0.25#△1.77±0.22#1.63±0.16#△NOS蛋白0.31±0.05 0.80±0.13*0.55±0.07#0.67±0.14#△0.61±0.12#△0.57±0.11#RNA 1.01±0.01 2.52±0.48*1.65±0.17#1.86±0.23#△1.82±0.18#△1.65±0.13#

表3 各組大鼠心肌組織中炎性因子比較（±s） ng/mL

表3 各組大鼠心肌組織中炎性因子比較（±s） ng/mL

注：*表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與雷米普利組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組雷米普利組白楊素低劑量組白楊素中劑量組白楊素高劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 TNF-α 0.58±0.06 1.27±0.16*0.71±0.09#0.82±0.12#△0.76±0.09#0.73±0.11#IL-1β 1.23±0.14 2.94±0.36*1.95±0.17#2.08±0.18#1.96±0.17#1.97±0.24#IL-10 0.36±0.07 0.20±0.12*0.28±0.06#0.26±0.08#0.26±0.07#0.25±0.06#

3 討論

對(duì)于急性心肌梗死患者及時(shí)進(jìn)行溶栓治療以實(shí)現(xiàn)血流恢復(fù)灌注是主要的治療手段，但手術(shù)中不可避免會(huì)出現(xiàn)再灌注損傷，嚴(yán)重影響患者預(yù)后［8］。再灌注過程中包括氧化應(yīng)激、炎癥刺激以及繼發(fā)性心肌細(xì)胞凋亡等均是本病進(jìn)展和發(fā)生的關(guān)鍵，為準(zhǔn)確模擬臨床中MIRI特點(diǎn)，本研究依據(jù)文獻(xiàn)［9］采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎方法構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，造模方法相對(duì)簡單，且成功率高，術(shù)中死亡率低，與臨床中MIRI有相似性。本研究病理學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，模型組出現(xiàn)明顯纖維斷裂，證實(shí)造模成功，白楊素預(yù)防治療組均好轉(zhuǎn)，白楊素中、高劑量組在改善心肌病理學(xué)方面優(yōu)于雷米普利組，提示白楊素預(yù)防給藥可改善MIRI帶來的心肌損害且相較于雷米普利有一定優(yōu)勢。

近年來植物被開發(fā)應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防［10］。大量研究證實(shí)黃酮類藥理活性極高，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性，對(duì)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝病等多種疾病有較好療效［11］。白楊素是天然黃酮類化合物的一種，其主要存在于西番蓮屬植物中，在蜂膠中大量存在。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白楊素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，保護(hù)糖尿病腎臟和心肌損傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有明顯作用［12-13］。本研究結(jié)果顯示與模型組相比，白楊素各劑量組心肌酶指標(biāo)CK、CK-MB、LDH和cTnl均降低，進(jìn)一步證實(shí)了白楊素對(duì)MIRI大鼠心肌的保護(hù)作用。

在介導(dǎo)MIRI的多種因子中，炎癥反應(yīng)是核心，而在MIRI炎癥反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞又在其中扮有重要角色［14］。在MIRI發(fā)生過程中，中性粒細(xì)胞可被激活并黏附于心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞水腫，發(fā)生功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15-16］。在這一過程中，中性粒細(xì)胞誘發(fā)的花生四烯酸大量產(chǎn)生，并參與炎癥過程，其中COX-2是主要限速酶，可控制花生四烯酸的產(chǎn)生量，而NOS主要參與炎癥產(chǎn)生后心肌的整個(gè)損傷過程［17-18］。此外一些炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-10也參與了炎癥反應(yīng)整個(gè)進(jìn)程，TNF-α是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其主要作用為心肌收縮，誘導(dǎo)多種炎癥因子產(chǎn)生，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。IL-1β主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，也可促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，最終加劇炎癥進(jìn)而促進(jìn)血管堵塞。細(xì)胞因子IL-10是一種抑制炎癥產(chǎn)生因子，其可在心肌損傷中降低炎癥因子產(chǎn)生［20-21］。本研究采用白楊素治療MIRI大鼠后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，白楊素各劑量組血清和心肌組織TNF-α和IL-1β降低，IL-10升高，COX-2和NOS蛋白及mRNA表達(dá)降低，提示白楊素對(duì)MIRI大鼠心肌組織炎性因子的產(chǎn)生具有抑制作用，低劑量組對(duì)TNF-α的影響差于雷米普利，其余相仿。

本研究結(jié)果顯示白楊素預(yù)防給藥可減弱MIRI大鼠心肌損傷，其保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制炎性因子的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)。