王玉婷，王成祥，趙世同

1北京市和平里醫(yī)院,北京 100013；2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是醫(yī)院常見(jiàn)的病原微生物，具有廣泛的致病性，是醫(yī)院獲得性感染中最常見(jiàn)的病原菌之一［1］。PA廣泛分布于自然界中［2］，具有可以獲得耐抗菌藥物基因的能力，因此能夠在醫(yī)院環(huán)境中存活，并且易于在患者之間傳播［3］。隨著臨床和農(nóng)業(yè)抗菌藥物的泛用和濫用，在自身固有和適應(yīng)性耐藥機(jī)制的作用下，部分PA對(duì)臨床多數(shù)常用抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性［4-5］。多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）的產(chǎn)生使臨床選擇抗菌藥物陷入困境，細(xì)菌感染相關(guān)性疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)抗菌藥物療效不顯著［6-7］。因此，充分發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)，探索出一種抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的中醫(yī)藥治療方案，可為治療耐藥菌感染提供新突破口。

扶正解毒化瘀方是基于耐藥菌肺炎“正氣虧虛、痰瘀互結(jié)”的基本病機(jī)擬定，前期研究證實(shí)其可改善患者臨床癥狀［8］。本研究運(yùn)用血清藥理學(xué)及微量稀釋法研究扶正解毒化瘀方含藥血清聯(lián)合抗菌藥物對(duì)PA和MDRPA的體外抑菌作用，以期為該方治療細(xì)菌性肺炎的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株實(shí)驗(yàn)菌株由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。分別從臨床診斷為PA和MDRPA所致肺部感染患者的深部呼吸道分泌物標(biāo)本中分離、培養(yǎng)、純化、鑒定所得，傳代后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)控菌株：ATCC27853。

1.2 藥物扶正解毒化瘀方（北京康仁堂藥業(yè)有限公司配方顆粒）藥物組成：黃芩15 g，連翹15 g，漏蘆15 g，赤芍15 g，瓜蔞30 g，西洋參6 g，敗醬草30 g，薏苡仁30 g等，以上藥物劑量為成人1日用藥劑量；注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉[特治星，Wyeth Lederle S.R.L.，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080077，規(guī)格：4.5 g(哌拉西林4.0 g與他唑巴坦0.5 g)]。

1.3 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量170～200 g，60只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.4 試劑與設(shè)備MH瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司）；營(yíng)養(yǎng)肉湯（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，OXOID CM1168，1377374）；BDPhoenix-100 System型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（美國(guó)BD公司，BD Phoenix）；LHS-250 HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DDHZ-300型恒溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；321A型臺(tái)式低溫離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清制備SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為中藥大、中、小劑量組和空白對(duì)照組，每組10只。中藥大、中、小劑量分別對(duì)應(yīng)人臨床等效劑量的8倍、4倍、2倍，連續(xù)給藥5天，每天2次，末次給藥后1 h將各組大鼠麻醉后予腹主動(dòng)脈采血，離心后獲得含藥血清，56℃水浴滅活后分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 菌懸液制備采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ瑢⒒罨腜A和MDRPA配制成1×107CFU/mL濃度的菌液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5.3 中藥含藥血清及其聯(lián)合特治星的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的抗菌藥物藥敏試驗(yàn)用微量肉湯稀釋法（M100-S24，USA，2014）［9］，分別測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)PA和MDRPA的MIC，并與特治星聯(lián)合使用測(cè)定MIC，同時(shí)與特治星的MIC進(jìn)行比較。

1.5.3.1 扶正解毒化瘀方含藥血清和空白血清體外抑菌實(shí)驗(yàn)分組：空白血清組及小、中、大劑量含藥血清組。取96孔板，用梯度稀釋法在每行1～8孔中分別加入含藥血清80、70、60、50、40、30、20、10 μL，再用營(yíng)養(yǎng)肉湯補(bǔ)齊至200 μL；在9、10孔中直接加入200 μL肉湯；將活化后的濃度為1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌懸液10 μL加入1～9孔中，最終接種菌量約為5×105CFU/mL；9孔為陽(yáng)性對(duì)照，10孔不加菌液，為陰性對(duì)照；上述操作重復(fù)3次，37℃恒溫恒濕靜置培養(yǎng)18～24 h，酶標(biāo)儀（single，570 nm）檢測(cè)相應(yīng)光密度（optical density，OD）值。

1.5.3.2 特治星及其聯(lián)合含藥血清對(duì)PA和MDRPA的體外抑菌實(shí)驗(yàn)配制4096 μg/mL（按照哌拉西林量計(jì)算）的特治星溶液備用；對(duì)特治星原液進(jìn)行對(duì)倍稀釋，第1孔初始濃度為2048 μg/mL，稀釋成11個(gè)濃度梯度；將上述稀釋后的特治星溶液分別加入到相應(yīng)96孔板的1～11孔中，每孔100 μL；1～11孔中再分別加入60 μL的肉湯及40 μL血清，12孔加200 μL肉湯；將活化后的濃度為1×107CFU/mL的PA、MDRPA、ATCC27853菌懸液10 μL加入1～9孔中，最終接種菌量約為5×105CFU/mL，12孔不加菌液，為陰性對(duì)照。上述操作重復(fù)3次，37℃恒溫恒濕靜置培養(yǎng)18～24 h，酶標(biāo)儀（single，570 nm）檢測(cè)相應(yīng)OD值。

1.5.4 特治星及其聯(lián)合含藥血清的抑菌作用測(cè)定（K-B紙片法）分組：特治星組、特治星+空白血清組、特治星+2倍血清組、特治星+4倍血清組、特治星+8倍血清組、特治星+中藥組臨床等效中藥水提物。將活化的菌株使用比濁儀配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?；用無(wú)菌棉簽浸入配制好的菌液，用拭子劃線整個(gè)MH瓊脂培養(yǎng)基，從平板頂部到底部，均勻涂布，每次旋轉(zhuǎn)平板約60°，涂抹3次，確保每次接種菌液均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈，防止菌懸液流動(dòng)，并使菌液涂布于整塊平板的每個(gè)角落。按照預(yù)先設(shè)定的分組，將抗菌藥物紙片貼于已接種細(xì)菌的瓊脂表面。37℃恒溫恒濕孵育18～24 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，方差齊采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；方差不齊采用Welch近似方差分析，多重比較采用Dunnett’S T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥含藥血清及其聯(lián)合特治星的MIC測(cè)定（微量稀釋法）中藥顆粒劑含藥血清無(wú)明顯抑菌作用。與空白血清聯(lián)合特治星比較，中藥含藥血清聯(lián)合特治星不能顯著降低PA的MIC；中藥2倍、4倍含藥血清聯(lián)合特治星不能降低MDRPA的MIC；中藥8倍含藥血清聯(lián)合特治星能降低一個(gè)梯度的MDRPA的MIC。ATCC27853特治星的MIC是2 μg/mL。見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)PA及MDRPA的體外MIC μg/mL

2.2 特治星及其聯(lián)合含藥血清的抑菌作用測(cè)定（K-B紙片法）從恒溫恒濕培養(yǎng)箱中取出過(guò)夜孵育的固體培養(yǎng)基，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組抑菌環(huán)的直徑。見(jiàn)表2。

表2 各組抑菌環(huán)直徑（K-B紙片法） mm

3 討論

體外抑菌試驗(yàn)作為基礎(chǔ)研究方法，是抗菌藥物研究過(guò)程中重要的試驗(yàn)手段和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，被廣泛應(yīng)用于藥物的篩選、臨床藥敏試驗(yàn)、抗菌譜效價(jià)測(cè)定及活性物質(zhì)的追蹤等研究領(lǐng)域，是評(píng)價(jià)藥物抗菌效能較經(jīng)典也是最直接的研究方法［10］。目前在中藥體外抑菌作用研究中稀釋法和紙片法是最常應(yīng)用的研究方法。

在中醫(yī)藥的研究中，無(wú)論中藥單藥還是中藥復(fù)方，在抑菌、殺菌方面都積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，而且在臨床細(xì)菌感染相關(guān)疾病的治療中發(fā)揮重要作用。有研究表明蒲公英、黃連、夏枯草、五倍子、烏梅、絲瓜絡(luò)等中草藥對(duì)PA有一定抑菌作用［11-12］，中草藥衍生物黃芪多糖有抗呼吸道PA感染的功效［13］。在聯(lián)合用藥方面金銀花能增強(qiáng)慶大霉素的體外抑制PA效果［14］，中藥復(fù)方芪歸銀方提取物可降低多種抗菌藥物的MIC［15］。由于中草藥所含成分復(fù)雜多樣，無(wú)論對(duì)單藥還是復(fù)方體外抑菌作用的研究干擾因素較多，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，藥理作用機(jī)制和代謝過(guò)程等問(wèn)題難以做出清楚解釋，因此很難對(duì)中藥體外藥效學(xué)作出客觀評(píng)價(jià)［16］。上世紀(jì)80年代初，日本著名藥理學(xué)家田代真一首次提出“血清藥理學(xué)”。他認(rèn)為中草藥制劑口服進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)過(guò)胃腸道的消化以及內(nèi)環(huán)境菌群的代謝和排泄等過(guò)程而發(fā)揮治療作用，因此中草藥制劑作用于人體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是機(jī)體生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物被吸收入血后與血漿蛋白相結(jié)合，通過(guò)血液循環(huán)作用于不同組織或器官［17］。國(guó)內(nèi)學(xué)者王喜軍在上世紀(jì)90年代便提出了“中藥血清藥理學(xué)”，為中醫(yī)藥藥效學(xué)研究開(kāi)創(chuàng)了新思路，相比于直接用傳統(tǒng)中草藥制劑干預(yù)的體外試驗(yàn)，含藥血清的生物活性更加合理，其結(jié)果更具可信度。將中草藥藥劑通過(guò)灌胃方式給藥，經(jīng)過(guò)動(dòng)物的消化、吸收、代謝等過(guò)程，使得其含藥血清能更直接地反映中草藥制劑的藥理作用，并能夠更科學(xué)地對(duì)中草藥制劑的療效和機(jī)制進(jìn)行闡述。但針對(duì)體外抑菌試驗(yàn)，含藥血清作為干預(yù)因素也存在較多缺陷。含藥血清成分復(fù)雜，不僅存在一定的滲透壓，其中還包含許多有助于細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定干擾。本研究參考2014年CLSI發(fā)布的抗菌藥物藥敏試驗(yàn)，建立了方便、快捷、易操作的微量肉湯稀釋法。本研究發(fā)現(xiàn)，單一的中藥含藥血清未體現(xiàn)出明顯體外抑菌作用。對(duì)于PA，與空白血清聯(lián)合特治星比較，中藥含藥血清聯(lián)合特治星不能顯著降低MIC值。對(duì)于MDRPA，與空白血清聯(lián)合特治星比較，中藥2倍、4倍含藥血清聯(lián)合特治星不能降低MIC值，而中藥8倍含藥血清聯(lián)合特治星能降低一個(gè)梯度的MIC值。提示含藥血清能夠一定程度敏化MDRPA，降低特治星對(duì)MDRPA的最小抑菌濃度，但有效的藥物濃度較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了臨床等效劑量，對(duì)臨床治療有一定的指導(dǎo)意義，但與臨床用藥規(guī)范不符。

紙片法是通過(guò)藥物在瓊脂上擴(kuò)散抑制其周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)而形成抑菌環(huán)圈，根據(jù)對(duì)應(yīng)抑菌圈直徑的大小判定細(xì)菌對(duì)某藥物的敏感性，可分為敏感、中介、耐藥。本研究結(jié)果顯示扶正解毒化瘀方不同濃度含藥血清或中藥水提物與特治星對(duì)PA及MDRPA并無(wú)明顯聯(lián)合抑菌作用。此結(jié)果與微量肉湯稀釋法的結(jié)果存在一定差異?？紤]紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)中抑菌圈的直徑大小受諸多因素影響，如培養(yǎng)基質(zhì)量、細(xì)菌接種量、藥敏紙片質(zhì)量、紙片含藥的準(zhǔn)確性和均勻性等，且含藥血清本身成分復(fù)雜，是細(xì)菌生長(zhǎng)的較好營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，尚需進(jìn)一步優(yōu)化抗菌藥物聯(lián)合含藥血清的K-B紙片法試驗(yàn)細(xì)節(jié)，進(jìn)一步探索扶正解毒化瘀方及其含藥血清在K-B法中的體外抑菌作用。

綜上所述，本研究得出高濃度扶正解毒化瘀方含藥血清有一定體外抑菌作用，可一定程度恢復(fù)MDRPA對(duì)TZP的敏感性，可能存在延緩甚至逆轉(zhuǎn)PA耐藥性的作用，為扶正解毒化瘀方可能干預(yù)PA耐藥機(jī)制體現(xiàn)療效的假設(shè)提供了研究基礎(chǔ)，并對(duì)臨床耐藥菌感染性疾病的治療提供了新思路。