陳靜，陳煒，唐秀松，伍媛，勞祎林，吳林△

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由于各種腦血管疾病引起腦損傷，導(dǎo)致不同程度認(rèn)知功能障礙的疾病［1］。表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶能力減退、運動功能障礙、情緒行為異常等［2-3］。我國人口老齡化呈上升趨勢，老年性癡呆的人數(shù)也越來越多，其中VD患者約占老年性癡呆患者的20%［4］。相關(guān)文獻報道［5-8］，VD的發(fā)病主要與膽堿能系統(tǒng)障礙、氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)、氧自由基增多、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。VD是現(xiàn)階段唯一可逆的癡呆類型疾?。?］。由于VD復(fù)雜的發(fā)病機制，單純靠西藥治療可能不是很好的解決辦法［10］，中藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在防治VD方面發(fā)揮獨特優(yōu)勢［11-12］。何歡等［13］通過中醫(yī)傳承輔助平臺軟件分析了155首治療VD的方劑，發(fā)現(xiàn)丹參在中藥方中的使用頻率排第3位。董菲等［14］運用關(guān)聯(lián)規(guī)則研究了治療VD的101首方劑，在支持度為20的條件下，丹參-石菖蒲、丹參-黃芪、丹參-川芎、丹參-何首烏藥對的使用頻率較高。李強等［15］在數(shù)據(jù)挖掘治療VD的方中發(fā)現(xiàn)丹參用藥頻率排第3位?？梢姡⒃赩D的治療中出現(xiàn)頻率較高。丹參，別名血參根、大紅袍、紅根，為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖［16］，丹參味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、涼血消癰、清心除煩、通經(jīng)止痛等作用。常用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、熱痹、心煩失眠、痛經(jīng)等病癥［17-18］。藥理研究報道，丹參具有改善血液循環(huán)、抗炎、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化及調(diào)節(jié)血糖、血脂和血壓等的作用［19-26］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于對“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)進行整體分析的新技術(shù)，能展示中藥有效成分作用于人體起治療作用的機制［27］。本研究采用該技術(shù)探討丹參治療VD的作用機制，以期為丹參的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 丹參有效成分的檢索和篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇“Herb name”，以“丹參”為關(guān)鍵詞搜索其全部有效成分。

1.2 丹參靶點基因獲取在TCMSP中以“丹參”為關(guān)鍵詞，選擇“Related Targets”欄，導(dǎo)出結(jié)果。并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）查詢其蛋白所對應(yīng)的基因，用Perl 5.26.3軟件（https：//www.perl.org/get.html）注釋篩選出的靶點基因。

1.3 VD疾病相關(guān)基因檢索分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//genealacart.genecards.org/）、OMIM數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.omim.org/）中 輸 入“Vascular dementia”，檢索VD相關(guān)靶點基因，以表格形式下載，export導(dǎo)出結(jié)果，去除重復(fù)項，最后得到VD疾病基因數(shù)據(jù)集。

1.4 韋恩圖繪制將得到的丹參有效成分和靶點進行整理，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入R×64 3.6.2軟件（https：//www.r-project.org/），進行相應(yīng)腳本運算，得出丹參靶點和VD疾病靶點交集。

1.5 丹參-有效成分-VD-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將丹參靶點和丹參-VD靶點利用Perl軟件進行映射，然后運用Cytoscape 3.7.2軟件（https：//cytoscape.org/）對該網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)溆嬎悖玫降?成分-VD-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 丹參-VD靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因篩選利用SRRING在線軟件（https：//string-db.org/）將丹參-VD靶點輸入軟件Multiple Proteins列表下的List of Names中，在Organism中選擇homo sapiens，保存結(jié)果文件，將所得文件輸入R×64 3.6.2軟件，計算得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點條圖。

1.7 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將丹參-VD靶點利用R×64 3.6.2軟件計算得到GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 丹參有效成分和靶點共搜索得到202個化合物。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）＞0.18為篩選條件［28］得到65個有效成分，根據(jù)OB由大到小展示前20位，見表1。

表1 丹參中有效成分和靶點篩選結(jié)果（排名前20）

續(xù)表1

2.2 韋恩圖丹參-VD交集靶點有86個。其中VD疾病靶點3901個，丹參靶點108個。見圖1。

圖1 丹參有效成份-VD靶點

2.3 丹參-有效成分-VD-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖中紅色五邊形代表疾病VD，黃色菱形形代表中藥丹參，紫色V形代表丹參抗VD的有效成分，藍色圓形代表丹參與VD疾病共同靶點，表明丹參主要通過54種有效成分作用于86個靶點，這86個靶點可能影響VD疾病的發(fā)生。見圖2。

圖2 丹參-成分-VD-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 丹參-VD靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與篩選核心基因丹參-VD核心基因按鄰接節(jié)點數(shù)目由多到少依次為Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1、EFGR、MYC、JUN、STAT3、CASP3、PTGS2、CCND1、MAPK14、MMP9、RELA、APP、ESR1、PPARG、BCL2L1、IL10等。鄰接節(jié)點數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大，故Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1可能為核心基因。見圖3—4。

圖3 丹參-VD靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能富集分析丹參-VD靶點涉及的GO功能共富集到130條生物過程，主要包括G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA、兒茶酚胺結(jié)合等。見圖5—6。

圖4 丹參-VD蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點條圖

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析丹參治療VD的核心靶標(biāo)的KEGG通路富集分析共富集出134條通路與治療VD的功效相關(guān)，主要包括卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、非小細(xì)胞肺癌、乙型肝炎病毒通路、IL-17信號通路等。見圖7—10及表2。

表2 KEGG富集分析通路

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 IL-17信號通路

圖9 AGE-RAGE信號通路

圖10 HIF-1信號通路

3 討論

中醫(yī)無“血管性癡呆”的病名，“癡呆”一詞最先記載于《華佗神醫(yī)秘傳·華佗治癡呆神方》，血管性癡呆屬“呆病”“健忘”“文癡”“武癡”“癲狂”等范疇［29-30］。一般將VD的證候分為腎精虧虛、痰濁阻竅、瘀血阻絡(luò)、肝陽上亢4種證型［31］。丹參有活血化瘀功效，符合瘀血阻絡(luò)病機。前期研究證實［21］，以丹參為君藥的中藥方劑和有效成分能改善微循環(huán)缺血再灌注后引起的心、腦功能障礙和器官損傷［32］。

從表1可知，丹參主要有效成分有65個，包括紫丹參萜醚、醛基丹參酮、丹參醌新酮、表丹參螺縮酮內(nèi)脂、丹參醇B、丹參醇A、紫丹參素C、異隱丹參酮、新隱丹參酮、隱丹參酮等。從圖2可知，丹參治療VD的有效成分是54個，主要有丹參醇B（Danshenol B）、丹參醇A（Danshenol A）、1，2，5，6-四氫丹參酮（1，2，5，6-tetrahydrotanshinone）、多孔甾醇（Poriferasterol）、丹參新醌（danshexinkum d）、丹參酮（tanshinoneⅥ）、異歐前胡素（isoimperatorin）、丹參酮ⅡA（DehydrotanshinoneⅡA）、二乙醇酸鹽（digallate）、木犀草素（luteolin）、醛基丹參酮（formyltanshinone）、紫丹參萜酸A（przewalskin a）、紫丹參萜酸B（przewalskin b）等。

從圖1和圖3的PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)丹參治療VD的核心靶點主要是Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等。Akt（又稱PKB，protein kinase，PKB/Akt）是一種與蛋白激酶C相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［33］。Akt是磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號傳導(dǎo)通路中一個關(guān)鍵的下游靶激酶，G蛋白偶聯(lián)受體、蛋白酪氨酸激酶受體和Ras蛋白可激活PI3K［34-35］。PI3K/Akt信號通路對神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增殖、分化及腦血管舒縮功能起重要作用，在VD防治中PI3K/Akt信號通路是一個熱點通路［36-39］。白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）是一種嗜神經(jīng)細(xì)胞因子，主要調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)［40］。血清IL-6表達水平與VD的嚴(yán)重性相關(guān)［41］。研究證實，炎癥因子IL-6和動脈粥樣硬化的致炎進程有關(guān)，它可損傷血管，加快動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，加重腦血管病變、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，患者最后出現(xiàn)認(rèn)知功能減退等癡呆癥狀［42-43］。丹參酮ⅡA有抗凋亡作用，可降低IL-6水平［44-45］。FOS，別名AP-1，C-FOS，p55。C-FOS基因是一種原癌基因［46］，在細(xì)胞生產(chǎn)調(diào)節(jié)和胞內(nèi)信號傳遞分泌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，減少C-FOS入核可阻礙炎性因子轉(zhuǎn)錄與蛋白合成，最后減輕炎癥程度［47］。丹參提取物和丹參化學(xué)成分可下調(diào)C-FOS表達水平［48］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與很多血管生成依賴性疾?。òX血管?。┑陌l(fā)生發(fā)展［49］。隱丹酮能夠調(diào)控VEGF，調(diào)控Src/FAK和ERK1/2信號途徑，抑制VEGF誘導(dǎo)的血管 生 成［50］。絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是一組能被不同細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、趨化作用的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶［51］。MAPK是促進炎癥反應(yīng)的重要信號分子。MAPK1又稱p38 MAPK，是MAP激酶家族的一個成員［52］，p38 MAPK抑制劑能夠保護VD大鼠海馬區(qū)功能損傷［53］。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，丹參治療VD的基因功能主要調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA、兒茶酚胺結(jié)合、類固醇激素受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、酰胺結(jié)合等。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，丹參治療VD通路主要有信號通路、癌癥通路、代謝通路、感染通路等。其中信號通路有白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。IL-17歸于CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞，與人體細(xì)胞結(jié)合會使IL-17水平明顯升高，并且IL-17能誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生TNF和IL-6等，最終導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤［54-55］。研究證實，VD患者IL-17水平高于健康人群，說明白細(xì)胞介素在VD起病早期可作為診斷依據(jù)之一，提前切斷其發(fā)生發(fā)展［56］。血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）可能是VD患者和急性腦梗死患者發(fā)病的危險因素，推斷它們參加腦血管損傷，引起腦梗死，最后發(fā)生VD。AGEs與PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性損害和RAGE誘導(dǎo)NF-κB表達密切相關(guān)。VD患者血清AGEs升高，并和簡易智力狀態(tài)檢查量表（Mini-mental state examination，MMSE）評分呈負(fù)相關(guān)［57］。低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是低氧反應(yīng)的調(diào)控因子，可以調(diào)控下游靶基因發(fā)揮腦組織保護作用［58］。其中HIF-1α激動劑能保護VD患者的神經(jīng)［59］。丹參中的隱丹參酮可以下調(diào)HIF-1α表達水平［60］。

綜上所述，丹參抗VD的主要有效成分有丹參醇、1，2，5，6-四氫丹參酮、多孔甾醇、丹參新醌、丹參酮Ⅵ、丹參酮ⅡA、木犀草素等54個有效成分。丹參通過Akt1、IL6、FOS、VEGFA、MAPK1等核心靶點調(diào)控130條生物學(xué)過程和134條KEGG通路，說明丹參是通過多成分、多靶點和多途徑調(diào)控VD。該研究可為VD的治療提供思路，為丹參的臨床及實驗研究提供一定的理論依據(jù)。