朱棟才，李杰，余有貴，楊濤，李新社，姜慶昊，徐海月

(1.江西李渡酒業(yè)有限公司，江西 南昌，331700；(2.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000；(3.生態(tài)釀酒技術(shù)與應(yīng)用湖南省高校重點實驗室，湖南 邵陽，422000)

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑，具有生料制曲、自然接種、菌酶并用、使用陳曲的特點[1]。新曲的品質(zhì)評價體系由感觀、理化、微生物等指標(biāo)構(gòu)成[2]，王曉慧等[3]在大曲香氣成分研究、高通量測序分析、大曲分層研究和大曲感官深入分析等基礎(chǔ)上構(gòu)建入庫曲和出庫曲質(zhì)量評定體系。大曲質(zhì)量受原料、環(huán)境條件、加工工藝、菌群結(jié)構(gòu)等許多因素的影響[4-7]，培菌管理是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[8]，中—高溫大曲的生產(chǎn)工藝強(qiáng)調(diào)“前緩、中挺、后緩落”的要求，其中，低溫培菌期(前緩)的主要目的是讓霉菌和酵母在30～40 ℃、相對濕度大于90%、時間2～3 d中大量繁殖，曲塊表面呈現(xiàn)顏色一致的針頭狀的白色斑點或菌叢的“穿衣”現(xiàn)象[9]，為高品質(zhì)曲塊立下頭功。如果曲坯含水量大、安曲的曲間距小或曲塊接觸、蓋草有明水滴落到曲塊表面、曲室前期培菌的高溫高濕環(huán)境、第一次翻曲不及時等操作，可導(dǎo)致曲塊表面不能正?！按┮隆倍L滿絮狀的灰黑色菌絲水毛，水毛屬于毛霉菌，它的生長取代了曲霉菌，水毛現(xiàn)象被稱為一種病害[10]。然而，有關(guān)水毛曲對中高溫曲品質(zhì)的理化、微生物群落結(jié)構(gòu)的影響未見有相關(guān)報道。本研究以江西李渡酒業(yè)有限公司生產(chǎn)的中高溫大曲為對象，研究培菌前期水毛曲與“穿衣”正常曲的陳曲在大曲理化和微生物群落方面的差異性，旨在豐富曲塊質(zhì)量評價體系的理論依據(jù)，并為大曲生產(chǎn)工藝的優(yōu)化控制提供實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

1.1.1 材料

制曲原料：面粉、麩皮、鮮酒糟和水按一定比例混合而成。

正常曲：原料混合后經(jīng)壓曲機(jī)制成大曲坯，按“前緩、中挺、后緩落”的中高溫大曲的培菌工藝要求，前期培菌時曲塊表面長滿針頭大小的白色斑點或菌叢，這樣的曲塊屬于正?！按┮隆保嗑Y(jié)束的新曲入庫貯存180 d，從陳曲中取樣。

水毛曲：與正常曲不同的是入室培菌時，前期控溫控濕不當(dāng)，曲塊表面長滿灰黑色絮狀菌絲即水毛，中后期管理按正常曲工藝要求，培菌結(jié)束的新曲入庫貯存180 d，從陳曲中取出表面附著灰黑色絮狀菌絲叢的樣品。

化學(xué)藥品：可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸銨、磷酸二氫鉀、碘化鉀、重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、冰乙酸、無水乙酸鈉、無水乙醇均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

恒溫干燥箱：DHG-9031A，上海-恒科學(xué)儀器有限公司。

分析天平：ML204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

電熱恒溫水浴鍋：HWS-28型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

臺式高速離心機(jī)：Centrifuge 5418型，Eppendorf艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司。

PCR儀：580BR10905型，美國伯樂生物科技股份有限公司。

電泳儀：HE-120型，上海天能生命科學(xué)有限公司。

凝膠成像儀：2500型，上海天能生命科學(xué)有限公司。

生物分析儀：Bioanalyzer 2100型，安捷倫科技有限公司。

微量紫外-可見光分光光度計：NanoDrop 2000型，賽默飛世爾科技公司。

1.2 曲樣采集與制備

采用三點取樣法，在曲堆的上、中、下層中，每層分別取6塊水毛曲和6塊正常曲。收集同一類型18塊大曲，先進(jìn)行外觀評價；然后，各層曲塊隨機(jī)平分成3小組，將各層的小組隨機(jī)組合成3組混合樣，其中每組混合樣6塊曲(含上中下3層曲各2塊)。采用四分法制樣，鏟下曲塊外表面1 cm厚的曲皮，粉碎后混合均勻，分別用于理化和微生物類群的指標(biāo)檢測。連續(xù)取樣3批次。

1.3 檢測方法

1.3.1 理化指標(biāo)的檢測

1)水分 采用常壓烘箱干燥法[11]，以“ % ”表示；

2)酸度 采用酸堿中和法[11]，以“mmol/10 g”表示。

3)液化力 采用碘液褪色法[11]，定義在35 ℃、pH為4.6條件下，1 g絕干曲l h能液化淀粉的克數(shù)為1 U，以“g/g·h”表示；

4)糖化力 采用斐林氏法[11]，定義在35 ℃、pH為4.6條件下，1 g大曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為1 U，以 “mg/g·h”表示；

5)發(fā)酵力 采用CO2失重法[11]，參照“QB/T 4257—2011釀酒大曲通用分析方法”中發(fā)酵力檢測稍作改進(jìn)，定義在30 ℃、24 h內(nèi)1 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的CO2克數(shù)為1 U，以“g/g·24 h”表示；

6)酯化力 采用皂化法[11]，定義每50 g大曲在35 ℃，經(jīng)過7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為1 U，以“mg/50 g·7 d”表示。

1.3.2 微生物類群的檢測

采用高通量測序方法，細(xì)菌和真菌由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1)細(xì)菌 采用16 S擴(kuò)增子微生物多樣性測序法，通過對16 S rRNA基因上的可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，利用變異區(qū)域的差異分類鑒定不同菌屬的細(xì)菌進(jìn)行，并對大曲中細(xì)菌的豐度進(jìn)行分析。

2)真菌 采用ITS擴(kuò)增子微生物多樣性測序法，通過DNA抽提、PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物電泳檢測，使用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對18 S rDNA和28 S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS區(qū))測序，利用變異區(qū)域的差異分類鑒定不同菌屬的真菌進(jìn)行，并對大曲中真菌的豐度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水毛曲與正常曲的外表比較

由圖 1 可知，前期為低溫培菌期，要求入室曲坯在第2～3 d的溫度控制在42 ℃以內(nèi)，控制“前緩”的目的是曲塊表面均勻“穿衣”，見圖1(b)。而如果在培曲時曲坯表面水分過多、安曲過密致曲塊接觸、第一次翻曲不及時等操作，則會造成曲塊表面長灰黑色菌絲的水毛，見圖1(a)，水毛新曲經(jīng)貯存后，在陳曲的表面附著有水毛的灰黑色菌絲叢，見圖1(c)。而正常曲為白色或微黃色，見圖1(d)。將圖1(c)的水毛曲表面局部放大,可見更清晰的灰黑色菌絲叢，見圖1(e)。

圖1 水毛曲與正常曲的外表比較

2.2 水毛曲與正常曲理化特性的比較

由表1可知，與穿衣良好的正常曲相比，前期長水毛的陳曲水分含量和酸度均較高，但兩者之間水分含量和酸度的差異均不顯著(P>0.05)；水毛曲與正常曲相比，液化力稍強(qiáng)但兩者之間差異不顯著(P>0.05)；糖化力、發(fā)酵力和酯化力均較弱，而糖化力之間差異極顯著(P<0.01)，發(fā)酵力差異顯著(P<0.05)，酯化力差異不顯著(P>0.05)。因此，與正常曲相比，水毛曲的糖化力(P<0.01)、發(fā)酵力(P<0.05)顯著下降，而液化力(P>0.05)、酸度(P>0.05)有所提高，酯化力(P>0.05)有所下降，但影響程度均不顯著。

表1 水毛曲與正常曲主要理化指標(biāo)的比較

2.3 水毛曲與正常曲主要微生物類群的比較

1)細(xì)菌群落屬水平上結(jié)構(gòu)分布的比較

水毛曲檢出91個屬細(xì)菌，而正常曲檢出136個屬細(xì)菌，在細(xì)菌屬水平上水毛曲少于正常曲。由圖2可知，水毛曲與正常曲排名前8的細(xì)菌類中，兩者共有6類細(xì)菌：Weissella(魏斯氏菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Pediococcus(片球菌屬)、Saccharopolyspora(糖多孢菌屬)、Muribaculaceae(鼠李屬)、Bacteroides(擬桿菌屬)，但各自獨有2類細(xì)菌：正常曲為Acetobacter(醋酸桿菌屬)和Pseudonocardiaceae(假諾卡氏菌屬)，水毛曲為Staphylococcus(葡萄球菌屬)和Prevotella(普氏菌屬)。在兩者共有的6類細(xì)菌中，水毛曲顯著多于正常曲的2類細(xì)菌為Weissella(魏斯氏菌屬)和Pediococcus(片球菌屬)，水毛曲顯著少于正常曲的2類細(xì)菌為Lactobacillus(乳酸桿菌屬)和Saccharopolyspora(糖多孢菌屬)，水毛曲較少于正常曲的 2 類細(xì)菌為Muribaculaceae(鼠李屬)和Bacteroides(擬桿菌屬)。在排名前 4 的細(xì)菌類中，水毛曲依次為Weissella(魏斯氏菌屬)、Pediococcus(片球菌屬)、Lactobacillus(乳酸桿菌屬)、Muribaculaceae(鼠李屬)，而正常曲依次為Lactobacillus(乳桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)、Saccharopolyspora(糖多孢菌屬)、Acetobacter(醋酸桿菌屬)。酒曲中檢出的主要細(xì)菌屬類中，與江東材等研究偏高溫大曲中細(xì)菌區(qū)系有Lactobacillus、Weissella、Pediococcus、Staphylococcus4個屬相同[12]，與張蕓曌報道的中高溫大曲中細(xì)菌區(qū)系有Lactobacillus、Weissella、Pediococcus、Staphylococcus、Acetobacter、Saccharopolyspora6個屬相同[13]，樣品是導(dǎo)致相互間細(xì)菌類差異的最關(guān)鍵因素。

圖2 水毛曲和正常曲主要細(xì)菌類(屬)的結(jié)構(gòu)分布比較

細(xì)菌是白酒釀造的主要生香類微生物。Lactobacillus、Weissella、Pediococcus均為乳酸 菌，能代謝生成醇類、酯類、酮類和吡嗪類等物質(zhì)[14]，如產(chǎn)生乳酸、乳酸乙酯等[15]，能調(diào)節(jié)發(fā)酵酒醅初期的酸度，形成酒體的重要香味成分。Weissella屬于厭氧或兼性厭氧的乳酸菌，在培菌管理前期的低溫高濕的條件下生長繁殖最旺盛，與酸度呈顯著性正相關(guān)(p<0.05)[13]。Lactobacillus是常見的厭氧桿菌，更適于培菌管理前期的中溫高濕低氧環(huán)境生長繁殖，其代謝產(chǎn)物有乙酸、乳酸、乙醇以及其他重要風(fēng)味化合物[13]。Saccharopolyspora能分泌多種酶類和代謝產(chǎn)生重要的生物活性物質(zhì)，從而有利于酒體風(fēng)味更加豐滿[16]；它與酸度呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與液化力呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)[13]。Pediococcus可降低胺的含量，有利于發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味形成[13]。

2)真菌群落屬水平上結(jié)構(gòu)分布的比較

水毛曲檢出13個屬的真菌，而正常曲檢出12個屬真菌，在真菌屬水平上水毛曲稍多于正常曲。由圖3可知，水毛曲和正常曲在排名前8的真菌類中，兩者共有6類真菌：Aspergillus(曲霉屬)、Rhizomucor(毛霉屬)、Pichia(畢赤酵母屬)、Rhizopus(根霉屬)、Wickerhamomyces(威克氏菌屬)、Lichtheimia(利希氏菌屬)，但各自獨有 2 類真菌：水毛曲為Torulaspora(環(huán)孢菌屬)和Trichosporon(毛孢子菌屬)，正常曲為Xeromyces(干菌屬)和Candida(假絲酵母屬)。在相對豐度排名前4的真菌中，水毛曲依次為Aspergillu(曲霉屬)、Rhizomucor(毛霉屬)、Rhizopus(根霉屬)和Acremonium枝頂孢屬，而正常曲依次為Aspergillus(曲霉屬)、Xeromyces(干菌屬)、Pichia(畢赤酵母屬)、Candida(假絲酵母屬)。酒曲中檢出的主要真菌屬類中，與張蕓曌研究有Candida、Aspergillus、Rhizomucor、Rhizopus、Trichosporon5個屬相同[13]，樣品是導(dǎo)致相互間主要真菌類差異的最關(guān)鍵因素。

圖3 水毛曲和正常曲主要真菌類(屬)的分布比較

霉菌是白酒釀造中糖化的主要動力。Aspergillus能產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶，對大曲液化力、糖化力、酯化力等起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，代謝產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸等有機(jī)酸和脂肪酸酯[17]，有利于提升酒體的風(fēng)味物質(zhì)。Aspergillus與酸度呈顯著性正相關(guān)(P<0.01)[13]。Rhizopus能代謝生成豐富的酶類如脂肪酶[18]，大多數(shù)具有糖化發(fā)酵與酯化能力，從而提高出酒率和提升白酒風(fēng)味；Rhizopus在曲坯入室第2 d后就開始大量繁殖，尤其在溫度較高的時候[13]，是大曲 “穿衣”良好的主要菌類。Rhizomucor能產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，可分解蛋白質(zhì)及產(chǎn)生芳香物質(zhì)、糖化力較強(qiáng)，還可產(chǎn)檸檬酸、乳酸和甘油等[18]。

酵母菌是白酒釀造中發(fā)酵的主要動力,除主要產(chǎn)生乙醇外還會產(chǎn)生高級醇、酯類和其他芳香活性物質(zhì)。Wickerhamomyces也是一種能產(chǎn)酯的生香酵母[19]，它與酸度呈顯著性正相關(guān)(P<0.01)，與液化力呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)[13]。Candida能產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶[20]，它與酸度呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)[13]。

水毛曲與正常曲在微生物類群結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致了曲塊之間理化、生化指標(biāo)上的差異，但水毛曲的微生物類群還需要深入分析，微生物與理化、生化指標(biāo)之間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

1)與“穿衣”正常曲相比，前期長水毛曲會導(dǎo)致成品曲的糖化力(P<0.01)、發(fā)酵力(P<0.05)顯著下降，而液化力(P>0.05)、酸度(P>0.05)有所提高，酯化力(P>0.05)有所下降，但影響程度均不顯著。

2)在微生物群落屬水平的結(jié)構(gòu)分布中，水毛曲檢出91個屬細(xì)菌、13個屬真菌，而正常曲檢出136個屬細(xì)菌、12個屬真菌。在屬水平排名前8的細(xì)菌類中，水毛曲與正常曲兩者共有6類細(xì)菌，但正常曲獨有Acetobacter(醋酸桿菌屬)和Pseudonocardiaceae(假諾卡氏菌屬)2類，水毛曲獨有Staphylococcus(葡萄球菌屬)和Prevotella(普氏菌屬)2類；在排名前4的細(xì)菌類中，水毛曲依次為Weissella(魏斯氏菌屬)、Pediococcus(片球菌屬)、Lactobacillus(乳酸桿菌屬)、Muribaculaceae(鼠李屬)，而正常曲依次為Lactobacillus(乳酸桿菌屬)、Weissella(魏斯氏菌屬)、Saccharopolyspora(糖多孢菌屬)、Acetobacter(醋酸桿菌屬)。在屬水平排名前 8 的真菌類中，兩者共有6類真菌，且水毛曲顯著多于正常曲的2類真菌為Rhizomucor(毛霉屬)、Rhizopus(根霉屬)，水毛曲顯著少于正常曲的2類真菌為Aspergillus(曲霉屬)、Pichia畢赤酵母屬；水毛曲獨有Torulaspora(環(huán)孢菌屬)和Trichosporon(毛孢菌屬)2類，正常曲獨有Xeromyces(干菌屬)和Candida(假絲酵母屬)2類。

3)研究結(jié)果揭示了中高溫大曲中水毛曲與正常曲之間內(nèi)在的品質(zhì)差異，對于提高白酒制曲質(zhì)量，進(jìn)一步了解制曲條件和發(fā)酵性能之間的關(guān)系提供了一定的理論基礎(chǔ)。