張靜 徐琳 葉元華

子癇前期是妊娠期并發(fā)癥中常見的疾病之一，同時也是造成孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的高危因素之一[1]。目前子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究較為廣泛，但確切病因仍是眾說紛紜，其中滋養(yǎng)細(xì)胞侵入不足以及胎盤螺旋動脈重鑄不足這兩個原因是目前普遍公認(rèn)的重要病理基礎(chǔ)，但病因仍尚未完全明確[2-3]。長鏈非編碼RNA缺氧誘導(dǎo)因子-1α-反義鏈1(long non-coding RNA hypoxia-inducible factor 1 alpha antisense RNA 1，LncRNA HIF1A-AS1)是一種特殊類型的自然反義RNA，其正義RNA為缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF1A)mRNA[4]。自然反義RNA在結(jié)構(gòu)上與其正義RNA存在互補(bǔ)序列，且能通過基因重組、轉(zhuǎn)錄碰撞等多種調(diào)控機(jī)制影響正義RNA的表達(dá)[5]。HIF1A能介導(dǎo)低氧反應(yīng)，與血管內(nèi)皮損傷等有重要聯(lián)系[6]。然而有關(guān)LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A是否與胎盤螺旋動脈重鑄不足及滋養(yǎng)細(xì)胞侵入不足有關(guān)目前尚未可知。因此本研究著重探討LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A與重度子癇前期胎盤螺旋動脈重鑄的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

回顧性分析2019年10月—2021年4月于本院住院分娩的92例晚發(fā)型重度子癇前期孕婦(子癇前期組)的病例資料，孕婦年齡23～32歲，平均(27.9±3.1)歲，孕周(38.5±0.5)周；選取同期86例正常妊娠孕婦作為正常妊娠組，孕婦年齡23～31歲，平均(27.3±2.8)歲，孕周(38.4±0.7)周。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)重度子癇前期孕婦符合第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》子癇前期診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)孕婦均為漢族，且均為單胎頭位妊娠；(3)年齡>18歲，臨床資料齊全；(4)既往無嚴(yán)重急慢性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期間孕婦伴有其他妊娠合并癥；(2)妊娠前期有用藥史，妊娠期間存在飲酒及吸煙史；(3)合并自身免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、慢性腎炎等疾病；(4)有其他傳染病史。

收集整理孕婦一般資料，主要包括年齡、分娩前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、孕周、孕次、產(chǎn)次、收縮壓、舒張壓、新生兒體重。研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)授權(quán)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，受試孕婦均簽署知情同意書。

二、方法

1.主要試劑與儀器：RNA提取試劑盒(貨號：K1101)購自上海瓦蘭生物科技有限公司；qPCR SYBR?Green Mix(貨號：KL2091aP)購自上?？道噬锟萍加邢薰?；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：205311)購自德國QIAGEN公司。qRT-PCR儀(型號：CFX384)購自美國Bio-Rad公司；掃描電子顯微鏡(型號：JCM-7000)購自日本電子株式會社。

2.研究方法：

(1)胎盤組織中LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA表達(dá)水平測定。胎盤娩出后，立即采集新鮮胎盤，無菌條件下在胎盤母體面4個象限中心各取1塊大小為1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織，PBS緩沖液反復(fù)沖洗2～3次后，采用滅酶錫箔紙包好放入經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的冷凍管中保存待測。采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測胎盤組織中LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA表達(dá)水平：采用試劑盒提取胎盤組織總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成(引物序列見表1)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA(50 ng/μL)2 μL，qPCR SYBR?Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算胎盤組織中LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA的相對表達(dá)量?！鳌鰿T=[(待測樣本目的基因CT值-待測樣本內(nèi)參基因CT值)-(對照樣本目的基因CT值-對照樣本內(nèi)參基因CT值)]。

表1 qRT-PCR引物序列

(2)胎盤螺旋動脈管壁厚度和管腔面積測定。將剝離的新鮮胎盤取組織大小為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，采用PBS緩沖液沖洗后，鋨酸染色、浸泡、脫水后鍍金染色。于掃描電子顯微鏡下隨機(jī)選取組織標(biāo)本大于5條螺旋動脈的管腔面積和管壁厚度，計算均值做為最終所得值。

結(jié) 果

一、正常妊娠組、子癇前期組一般情況比較

正常妊娠組、子癇前期組年齡、分娩前BMI、孕周、孕次、產(chǎn)次、新生兒體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常妊娠組相比，子癇前期組收縮壓、舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 正常妊娠組、子癇前期組一般情況比較

二、正常妊娠組、子癇前期組胎盤螺旋動脈管壁厚度及管腔面積比較

與正常妊娠組相比，子癇前期組平均管壁厚度明顯升高，平均管腔面積明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 正常妊娠組、子癇前期組胎盤螺旋動脈管壁厚度及管腔面積比較

三、正常妊娠組、子癇前期組胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA水平比較

與正常妊娠組相比，子癇前期組胎盤組織HIF1A mRNA水平明顯升高，LncRNA HIF1A-AS1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 正常妊娠組、子癇前期組胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA水平比較

四、晚發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA水平與各參數(shù)的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，晚發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1與HIF1A mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.628，P<0.05)，且LncRNA HIF1A-AS1與平均管腔面積呈正相關(guān)(P<0.05)，與平均管壁厚度、收縮壓、舒張壓均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；HIF1A mRNA與平均管腔面積呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與平均管壁厚度、收縮壓、舒張壓均呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 晚發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1與HIF1A mRNA水平的相關(guān)性

表5 晚發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A mRNA水平與各參數(shù)的相關(guān)性

討 論

子癇前期是妊娠期高血壓的一種，其主要臨床表現(xiàn)為妊娠中期高血壓、蛋白尿及水腫，不僅會造成母體全身多器官功能紊亂，而且會對母嬰生命健康造成威脅[8]。子癇前期發(fā)病機(jī)制有母嬰免疫失衡、血管內(nèi)皮損傷、胚盤淺著床、胎盤螺旋動脈重鑄不足及滋養(yǎng)細(xì)胞侵入不足等[9-10]。本研究將探究篩選出的LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A兩指標(biāo)與晚發(fā)型重度子癇前期胎盤螺旋動脈重鑄的關(guān)系。

正常妊娠狀態(tài)下，螺旋動脈血管中層彈力纖維和肌纖維消失，進(jìn)而被無收縮功能的纖維蛋白樣物質(zhì)取代，使得管壁變薄、管腔增大[11]。子宮螺旋動脈重鑄是母體血管內(nèi)皮、免疫細(xì)胞與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞相互作用完成的[12]。而本研究顯示晚發(fā)型重度子癇前期孕婦平均管壁厚度明顯高于正常妊娠孕婦，平均管腔面積明顯低于正常妊娠孕婦，進(jìn)一步提示子宮動脈處于管壁厚、管徑小的結(jié)構(gòu)，使得阻力大、血流小，出現(xiàn)“高阻低流”的狀態(tài)，導(dǎo)致胎盤灌注不足，進(jìn)而可能影響晚發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

HIF1A是一種低氧環(huán)境誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過低氧反應(yīng)原件定向結(jié)合在靶基因的啟動子上，進(jìn)而調(diào)控下游一系列基因的轉(zhuǎn)錄[13-14]。研究表明，HIF1A參與腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子及胎盤生長因子等細(xì)胞因子的調(diào)控，而這些因子均能參與滋養(yǎng)細(xì)胞的分化，影響滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡及浸潤能力[15-16]。Wu等[17]研究顯示，LncRNA HIF1A-AS2能間接調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和增殖。本研究結(jié)果顯示，與正常妊娠孕婦相比，子癇前期孕婦胎盤組織HIF1A mRNA水平明顯升高，LncRNA HIF1A-AS1水平明顯降低，且二者呈明顯負(fù)相關(guān)。提示LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A可能在晚發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，基于二者特殊的調(diào)控機(jī)制，推測病理狀態(tài)下LncRNA HIF1A-AS1表達(dá)降低，LncRNA HIF1A-AS1調(diào)控的HIF1A水平升高，HIF1A通過影響其下游細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)一步參與晚發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展。何美榮等[18]研究結(jié)果顯示，HIF1A在子癇前期患者胎盤中異常高表達(dá)，且其作用機(jī)制與本研究推測基本一致。本研究進(jìn)一步采用Pearson法分析LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A與各參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果中LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A與平均管壁厚度、平均管腔面積、收縮壓、舒張壓均具有相關(guān)性。進(jìn)一步推測LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A調(diào)控的下游細(xì)胞因子表達(dá)增加后，可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞分化，使得胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤能力下降，對螺旋動脈浸潤不足，進(jìn)而導(dǎo)致螺旋動脈重鑄不足，使孕婦出現(xiàn)一系列子癇前期的臨床表現(xiàn)，血壓異常，收縮壓和舒張壓升高。

綜上所述，晚發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織中LncRNA HIF1A-AS1低表達(dá)，HIF1A mRNA高表達(dá)，二者均與螺旋動脈管壁厚度和管腔面積具有相關(guān)性。LncRNA HIF1A-AS1、HIF1A可能通過參與螺旋動脈重鑄不足，影響晚發(fā)型重度子癇前期的發(fā)生發(fā)展。本研究可為今后晚發(fā)型重度子癇前期發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探索提供方向。但LncRNA HIF1A-AS1是否能通過調(diào)節(jié)HIF1A的表達(dá)參與胎盤螺旋動脈重鑄不足以誘導(dǎo)子癇前期發(fā)生，目前仍不十分明確，其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制今后將進(jìn)一步通過動物和細(xì)胞試驗驗證。此外，本研究并未納入34周前發(fā)病的早發(fā)型子癇前期患者，未能對比早發(fā)型重度子癇前期患者與晚發(fā)型重度子癇前期患者胎盤結(jié)果是否有差異，今后將增加樣本量進(jìn)一步探究。