張嘉懿， 格根圖*， 賈玉山， 王志軍， 張佳偉， 閆星全， 司 強(qiáng)， 趙牧其爾， 孫 林

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

苦荬菜(Lactucaindica)原產(chǎn)于亞洲，由野生的山萵苣馴化栽培而來[1]，是菊科萵苣屬一年生或二年生草本植物,因其具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好等特點(diǎn)，適宜在我國(guó)大部分地區(qū)種植[2]，是一種優(yōu)質(zhì)的青綠飼料作物。苦荬菜可以直接青飼利用，但是生產(chǎn)季節(jié)收獲的苦荬菜堆積存放時(shí)容易發(fā)霉變質(zhì)導(dǎo)致品質(zhì)變差，無法在非生長(zhǎng)季節(jié)為畜禽提供優(yōu)質(zhì)苦荬菜[3]。

青貯是保留牧草營(yíng)養(yǎng)成分、延長(zhǎng)牧草保存時(shí)間、解決牧草生產(chǎn)季節(jié)不均衡的一種方法[4]?？噍げ擞捎诤扛?，可溶性碳水化合物含量較低，直接青貯很難獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，加入添加劑可以改善畜禽飼料的青貯品質(zhì)[6]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)是青貯調(diào)制中較為常用的兩種乳酸菌添加劑。植物乳桿菌屬于同型發(fā)酵乳酸菌，在青貯發(fā)酵時(shí)能產(chǎn)生大量的乳酸，迅速降低pH值，提高發(fā)酵品質(zhì)。謝曉華等[7]研究表明，添加植物乳桿菌使青貯小麥(Hordeumvulgare)的乳酸菌數(shù)量增加，同時(shí)pH值和氨氮濃度下降。Parvin等[8]研究表明，在多花黑麥草(Loliummultiflorum)中添加植物乳桿菌能顯著提高發(fā)酵品質(zhì)，但是也顯著降低了乳酸菌數(shù)量。布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，可將青貯飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和乳酸分解為乙酸、丙二醇等，使得酵母菌、霉菌等有害微生物的生長(zhǎng)被有效抑制。王磊等[9]研究表明，布氏乳桿菌可以降低高濕玉米(Zeamays)青貯飼料中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。Gandra等[10]研究表明，在向日葵(Helianthusannuus)中添加布氏乳桿菌可以降低干物質(zhì)含量，增加乳酸菌數(shù)量，同時(shí)抑制酵母菌和霉菌的活動(dòng)。

目前植物乳桿菌和布氏乳桿菌多用于苜蓿、玉米、燕麥等植物的青貯中，而對(duì)苦荬菜青貯的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究植物乳桿菌和布氏乳桿菌對(duì)苦荬菜青貯品質(zhì)的影響，篩選出適合苦荬菜青貯添加的乳酸菌，為苦荬菜用作青貯飼料的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青貯原料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育的苦荬菜品種—‘蒙早’苦荬菜(Lactucaindica‘Mengzao’)，2021年5月8日在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室牧草試驗(yàn)地播種，于2021年8月17日盛花期人工刈割，留茬高度3 cm，利用鍘刀切短至1～2 cm，自然狀態(tài)下陰干約10 h，待含水量降至60%～65%進(jìn)行青貯調(diào)制。添加劑：植物乳桿菌和布氏乳桿菌均購(gòu)自山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：即對(duì)照(CK組，無添加劑)、單獨(dú)添加植物乳桿菌(LP組，0.01 g·kg-1)、單獨(dú)添加布氏乳桿菌(LB組，0.01 g·kg-1)和混合添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌(LP+LB組，0.01 g·kg-1+0.01 g·kg-1)，添加量均為鮮重基礎(chǔ)，活菌數(shù)1.0×1010cfu·g-1，將添加劑溶于30 mL蒸餾水中，用噴壺噴灑在切短的原料上，對(duì)照組噴灑等量蒸餾水，每個(gè)處理3次重復(fù)，后裝入做好標(biāo)記的聚乙烯袋中，每袋200 g抽真空密封，室溫條件下避光、干燥保存。青貯60 d后開袋測(cè)定其相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1營(yíng)養(yǎng)成分 青貯60天后開袋將青貯樣品稱鮮重后，置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重，稱干重。將烘干的樣品過不同目篩粉碎，混合均勻裝自封袋，用于測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分。

干物質(zhì)(Dry matter，DM)含量采用烘干法進(jìn)行測(cè)定[11]；粗灰分(Crude ash，Ash)含量采用550℃灼燒法進(jìn)行測(cè)定[11]；粗蛋白質(zhì)(Crude protein，CP)含量使用全自動(dòng)杜馬斯定氮儀進(jìn)行測(cè)定[12]；酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量使用ANKOM A2000i型全自動(dòng)纖維儀進(jìn)行測(cè)定[13]；粗脂肪(Ether extract，EE)含量采用索氏提取法進(jìn)行測(cè)定[11]；可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)采用蒽酮-硫酸比色法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì) 青貯60天后開袋將青貯樣品充分混合均勻，稱取10 g青貯樣品置于聚乙烯拍打袋中，并加入90 mL無菌水，用勻質(zhì)儀拍打2 min后過濾，所得濾液分成兩份，分別用于測(cè)定發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量。使用pH計(jì)測(cè)定濾液的pH值；有機(jī)酸含量使用高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定，利用0.22 μm的水系濾膜對(duì)濾液進(jìn)行過濾后注入進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)測(cè)定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)、丁酸(Butyric acid，BA)含量；氨態(tài)氮(Ammonia-nitrogen，NH3-N)含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.3.3微生物數(shù)量 將另一份濾液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋至10-1，10-3，10-5，采用平板計(jì)數(shù)法[16]測(cè)定青貯飼料中乳酸菌(Lactic acid bacteria)、一般好氧性細(xì)菌(Aerobic bacteria)、大腸桿菌(Coliform bacteria)、酵母菌(Yeasts)和霉菌(Molds)數(shù)量。乳酸菌使用乳酸菌固體(De Man，Rogosa，Sharpe，MRS)培養(yǎng)基30℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；一般好氧性細(xì)菌使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；大腸桿菌使用大腸桿菌/大腸菌群液體顯色(Blue light broth，BLB)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；酵母菌和霉菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，所得數(shù)據(jù)用lg cfu·g-1of FM表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft excel 2010處理數(shù)據(jù)，采用SAS 9.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最終結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。同時(shí)利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法[17-18]對(duì)不同處理的青貯品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，首先分別計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，然后按照不同指標(biāo)隸屬函數(shù)值的平均值進(jìn)行排名。

如果某個(gè)指標(biāo)與青貯品質(zhì)正相關(guān)，計(jì)算公式如下：

U(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

如果某個(gè)指標(biāo)與青貯品質(zhì)負(fù)相關(guān)，則用反隸屬函數(shù)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下：

U(X)=1―(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：U(X)為隸屬函數(shù)值，X為某一指標(biāo)的測(cè)定值，Xmax和Xmin為所有處理中某一指標(biāo)的最大值和最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦荬菜青貯原料的營(yíng)養(yǎng)成分及微生物數(shù)量

由表1可知，‘蒙早’苦荬菜原料的DM含量為27.28%，Ash含量為9.32%，CP含量為10.08%，NDF含量為57.40%，ADF含量為49.31%，EE含量為3.80%，WSC含量為2.02%。原料里一般好氧性細(xì)菌的數(shù)量最多，為6.45 lg cfu·g-1FM，酵母菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量次之，分別為4.55 lg cfu·g-1FM和4.09 lg cfu·g-1FM，數(shù)量最少的是乳酸菌，為3.84 lg cfu·g-1FM，同時(shí)檢測(cè)出霉菌，為3.00 lg cfu·g-1FM。

表1 苦荬菜青貯原料的營(yíng)養(yǎng)成分及微生物數(shù)量Table 1 Nutritional components and fermentation quality of Lactuca indica silage raw materials

2.2 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表2可知，青貯60 d后，LB組的DM含量顯著低于CK組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差異；添加劑組的CP含量均顯著低于CK組(P<0.05)；CK組的WSC含量顯著高于LB組和LP+LB組(P<0.05)；各處理組之間的Ash，NDF，ADF和EE含量均無顯著差異。

表2 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 2 Effect of lactic acid bacteria additives on nutritional components of silage

2.3 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，添加劑組的pH值均顯著低于CK組(P<0.05)，其中LP組的pH最低，為4.67；LP組和LP+LB組的LA含量顯著高于其他組(P<0.05)，且LP組的LA含量高于LP+LB組，但差異不顯著；LB組的AA含量顯著高于其他處理組(P<0.05)；各添加劑組的NH3-N/TN均顯著高于CK組(P<0.05)；各處理組中均未檢測(cè)出丙酸和丁酸。

表3 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria additives on fermentation quality of silage

2.4 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料微生物數(shù)量的影響

由表4可知，各添加劑組的乳酸菌數(shù)量均顯著高于CK組(P<0.05)，其中LP組的乳酸菌數(shù)量最多，為7.71 lg cfu·g-1FM；各處理組的一般好氧性細(xì)菌數(shù)量無顯著差異；LB組的酵母菌數(shù)量顯著低于CK組(P<0.05)；各處理組中均未檢測(cè)出大腸桿菌和霉菌。

表4 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料微生物數(shù)量的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria additives on microbial quality of silage

2.5 青貯飼料品質(zhì)的隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)

本試驗(yàn)采用隸屬函數(shù)法，以CP，WSC，乳酸菌，LA，AA，NDF，ADF，pH值，NH3-N/TN，酵母菌10個(gè)指標(biāo)，對(duì)苦荬菜4個(gè)處理的青貯品質(zhì)進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)平均值越高表明該處理的青貯品質(zhì)越好，結(jié)果如表5所示，青貯品質(zhì)最好的是LP組，其次是LP+LB組和CK組，最差的是LB組。

表5 乳酸菌添加劑對(duì)青貯飼料品質(zhì)影響的綜合評(píng)價(jià)Table 5 Comprehensive evaluation of the effect of lactic acid bacteria additives on silage quality

3 討論

3.1 乳酸菌添加劑對(duì)苦荬菜青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分的影響

營(yíng)養(yǎng)成分是反映飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)，通過營(yíng)養(yǎng)成分可以直觀地評(píng)價(jià)飼料品質(zhì)的優(yōu)劣[9]。唐振華等[19]研究發(fā)現(xiàn)在甘蔗尾青貯中添加20 mL布氏乳桿菌菌液顯著降低了DM含量。Reich等[20]研究認(rèn)為添加布氏乳桿菌會(huì)造成青貯飼料干物質(zhì)含量的損失。本試驗(yàn)中，LB組的DM含量顯著低于CK組，這與上述研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)樵谇噘A過程中，布氏乳桿菌將乳酸分解為乙酸、1，2-丙二醇、乙醇和CO2時(shí)需要降解可溶性碳水化合物提供能量，而可溶性碳水化合物的降解會(huì)降低DM含量[21]。各添加劑組的CP含量均顯著低于CK組，可能由于添加劑的加入使青貯飼料中的植物蛋白酶和附著的微生物共同反應(yīng)，導(dǎo)致CP被降解成多肽、游離氨基酸和氨，CP含量減少[22]。WSC是青貯發(fā)酵中微生物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸的底物。相比CK組，添加劑組的WSC含量均下降，這與Contreras-Govea等[23]研究結(jié)果不一致，主要是因?yàn)樘砑觿┙M的乳酸菌數(shù)量多于CK組，使得乳酸菌發(fā)酵需要消耗更多的WSC，所以剩余較少的WSC。其中LB組的WSC含量最低，原因可能是布氏乳桿菌在青貯發(fā)酵過程中除了產(chǎn)生乳酸外，還需要消耗WSC去產(chǎn)生乙酸。

3.2 乳酸菌添加劑對(duì)苦荬菜青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯發(fā)酵過程中，pH值，LA，AA，PA和BA含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，與CK組相比，各添加劑組的pH值均顯著降低，這與侯健健等[24]的研究結(jié)果相似，說明添加乳酸菌能有效地降低苦荬菜青貯飼料的pH值。其中LB組的pH值略高，可能是因?yàn)椴际先闂U菌將青貯過程中所產(chǎn)生的部分LA分解并轉(zhuǎn)化為AA，劉輝等[25]也得到了相同的研究結(jié)果。本試驗(yàn)中，LP組的LA含量顯著高于除LP+LB組以外的其他兩組，而LB組的AA含量顯著高于其他處理組，這與Winters等[26]的研究結(jié)果一致，植物乳桿菌是同型發(fā)酵乳酸菌，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量LA，而布氏乳桿菌是異型發(fā)酵乳酸菌，在厭氧條件下將部分LA直接分解轉(zhuǎn)化為AA。而LP+LB組LA含量低于LP組但高于LB組，AA含量高于LP組但低于LB組，說明混合添加不同發(fā)酵類型的乳酸菌可以提高苦荬菜青貯飼料的LA和AA含量，這與司華哲等[27]研究結(jié)果一致。NH3-N/TN可以反映青貯飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸的降解情況，本試驗(yàn)中，各添加劑組的NH3-N/TN均顯著高于CK組，說明加入添加劑后苦荬菜青貯飼料中的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶分解后參與體內(nèi)代謝活動(dòng)產(chǎn)生了NH3-N[28]。各處理組中均未檢測(cè)出BA，原因可能是添加劑的加入增加了青貯飼料中乳酸菌的數(shù)量，抑制有害微生物的不良發(fā)酵，降低了BA的含量。

3.3 乳酸菌添加劑對(duì)苦荬菜青貯飼料微生物數(shù)量的影響

青貯發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵過程，原料特性、發(fā)酵環(huán)境及原料附生微生物等因素決定了青貯能否成功[29-30]。有研究表明原料附著的乳酸菌數(shù)量大于105cfu·g-1FM時(shí)，青貯更容易成功[31]?！稍纭噍げ烁街娜樗峋鷶?shù)量較少，所以需要額外添加乳酸菌來促進(jìn)青貯發(fā)酵，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由于不同乳酸菌添加劑的加入，各添加劑組的乳酸菌數(shù)量均較CK組顯著增加。在青貯飼料發(fā)酵過程中，酵母菌的存在往往是不利的，一般會(huì)引起飼料青貯品質(zhì)的腐敗變質(zhì)[32-33]。本試驗(yàn)中添加劑組的酵母菌數(shù)量均有所下降，其中LB組的酵母菌數(shù)量最少，這可能是因?yàn)椴际先闂U菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乙酸，而乙酸可以有效抑制酵母菌等有害細(xì)菌的活動(dòng)。各處理組中均未檢測(cè)出大腸桿菌和霉菌，這可能是因?yàn)榭噍げ饲噘A飼料中乳酸菌數(shù)量增加，促進(jìn)青貯發(fā)酵快速產(chǎn)生乳酸，pH值下降，抑制了有害微生物大腸桿菌和霉菌的繁殖。

3.4 苦荬菜青貯飼料品質(zhì)的隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)

青貯飼料的品質(zhì)是由多個(gè)指標(biāo)共同影響的，不能根據(jù)單一指標(biāo)對(duì)其評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)法可以在多個(gè)指標(biāo)的基礎(chǔ)上對(duì)青貯品質(zhì)進(jìn)行更全面、可靠的綜合評(píng)價(jià)[34]。本試驗(yàn)采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)苦荬菜4個(gè)處理的青貯品質(zhì)，排名由高到低依次為L(zhǎng)P組>LP+LB組>CK組>LB組。LB組的排名在CK組后面，原因可能是LB組的CP和WSC含量在青貯發(fā)酵過程中消耗得較多，但其他測(cè)定指標(biāo)相比于CK組得到了改善[35]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，在苦荬菜青貯時(shí)單獨(dú)或混合添加不同發(fā)酵類型乳酸菌均能增加乳酸和乙酸含量，降低pH值，從而改善苦荬菜青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)；采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)，得出LP組的青貯品質(zhì)最好，說明在調(diào)制苦荬菜青貯飼料時(shí)添加植物乳桿菌能提高青貯效果。