全小龍, 陳夢詞, 段中華, 梁 軍, 喬有明

(青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室， 青海 西寧 810016)

世界上眾多草原類型的生態(tài)學過程均被證明受到化感效應的調控?；行獣Σ莸厝郝涞慕Y構和功能，如群落的物種組成和群落的演替過程產(chǎn)生影響[1-2]。國內外對此開展了大量的研究，如張寶琛等[3]開展了化感效應對高寒草甸群落演替過程的影響研究，結果表明垂穗披堿草的化感效應抑制了自身的種子萌發(fā)，卻促進了細葉亞菊(Ajaniatenuifolia)的種子萌發(fā)，而細葉亞菊的化感效應則抑制了垂穗披堿草的種子萌發(fā)，這種化感效應的不同使細葉亞菊在退化高寒草甸占據(jù)了群落的優(yōu)勢地位。Greer等[4]的溫室實驗結果表明入侵植物白羊草(Bothriochloaischaemum)通過抑制本土植物的種子萌發(fā)和幼苗生長而在北美中南部草原成功占據(jù)生態(tài)位。羅馬尼亞低地草原的研究結果也表明美麗針茅(Stipapulcherrima)占據(jù)群落優(yōu)勢地位的原因之一在于其釋放的化感物質強烈地抑制了群落中其他物種的幼苗更新[5]。假高粱(Sorghumhalepense)通過分泌化感物質抑制北美高草草原群落優(yōu)勢種北美小須芒草(Schizachyriumscuparium)的生長和繁殖過程，促使其成功入侵北美高草草原并占據(jù)群落優(yōu)勢地位[6]。

化感效應不僅存在于植物之間，也涉及植物與微生物間的相互作用。土壤微生物參與養(yǎng)分循環(huán)及植物競爭，影響物質分解，是植物化感效應重要的決定因子[7-8]。當毒雜草入侵健康草地時，向土壤中釋放化感物質，破壞土壤穩(wěn)定性，降低土壤活力，加速有害物質的積累，抑制土壤酶及微生物活性，造成病原體及害蟲等有害生物大量發(fā)生，導致土壤的微生物區(qū)系發(fā)生變化，土壤微生物與土壤因子的自然平衡遭到損壞，形成養(yǎng)分分解和供應障礙，加劇土壤病害蔓延[9-10]。土壤中微生物通過以代謝、降解與利用等方式改變化感物質，同時根系通過分泌各種次生代謝物質對根際微生物的種類、數(shù)量和分布產(chǎn)生影響[11]。沒有微生物存在下的化感物質活性的評價可能不具有生態(tài)相關性。因此，植物化感效應機制的深入研究必須建立在充分了解化感物質與微生物互作關系的基礎上，驗證生物入侵中化感效應時有必要考慮土壤微生物的影響[12-13]，才能使后續(xù)的研究更有意義。

草地生態(tài)系統(tǒng)化感效應的研究集中在化感效應的識別、化感效應對受體植物種子萌發(fā)和幼苗生長的室內觀測實驗及化感物質的分離和鑒定等方面[3-6,9]，對于微生物對化感效應的緩解研究還未見報道。鑒于此，本研究以青藏高原常見毒雜黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)、甘肅馬先蒿(Pediculariskansuensis)和細葉亞菊集中分布區(qū)域土壤為化感物質來源，以冷地早熟禾(Poacrymophila)和垂穗披堿草(Elymusnutans)生長旺盛區(qū)域土壤為優(yōu)良牧草生長基質，測定種子發(fā)芽率及幼苗生長狀況，研究土壤微生物對化感物質作用效果的緩解潛力。將化感物質的微生物降解研究納入化感效應的生物測定中，把化感效應和土壤因素結合起來，以期結果更能反映實際情況，揭示人工植被退化現(xiàn)象背后的本質，為高寒地區(qū)退化草地的恢復、重建，以及管理和新技術研發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究土壤樣品于2020年9月下旬在青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣(34°41′N,101°46′E)采集。采集地屬于典型的高寒草甸型草地，土壤類型以黑鈣土為主，主要優(yōu)勢種為冷地早熟禾和垂穗披堿草，伴生有鵝絨委陵菜(Potentillaanserina)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、瓣蕊唐松草(Thalictrumpetaloideum)、金露梅(Potentillafruticosa)和高原毛茛(Ranunculustanguticus)等，零散分布有黃帚橐吾、甘肅馬先蒿和細葉亞菊等。選擇毒雜草相對分布集中的區(qū)域土壤制備水浸液，以模擬自然條件下化感物質進入環(huán)境的方式，采集時用直徑為3.5 cm的土鉆，取10 cm上層土壤，裝入自封袋中，記為土壤A低溫保存帶回實驗室備用。為保存維持優(yōu)良牧草正常生長的原有微生物，選擇冷地早熟禾和垂穗披堿草生長旺盛區(qū)域，將所有土樣混合后分裝標記為土壤B放入-18℃冰箱，帶回實驗室用于準備發(fā)芽與生長基質。供試土壤信息如表1所示。

表1 供試土壤基本信息Table 1 Main chemical properties of the soil tested

2019年8月下旬種子收獲時期，于青海省牧草良種繁殖場(海南藏族自治州同德縣；35°15′N,100°38′E)采集供試牧草種子，種子經(jīng)干燥、清選后，裝入種子袋低溫保存?zhèn)溆?。種子信息如表2所示。

表2 供試牧草種子基本信息Table 2 Forage seeds for testing

1.2 試驗設計

土壤A去除殘根及雜質后制備水浸液，用于澆灌噴施基質。按照新鮮土壤與蒸餾水(質量比) 1∶2比例，20℃溫度下以200r·min-1在旋轉搖床中震蕩24 h制備根土水浸液。所得土壤水溶液分別通過定性濾紙和0.45 μm水系濾膜過濾，獲得每毫升含0.5 g土壤中化感物質的水浸液，分裝試劑瓶后4℃保存待用。

將土壤B過2 mm篩后，分成兩部分，一部分在高壓滅菌鍋115℃下20 min，滅菌1次，記為SS；另一份不滅菌，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽10 d，去除土壤種子庫種子，并保留原有微生物，記為US。將未滅菌土與滅菌土按U100(100%US)，U75(75%US +25%SS)，U50(50%US +50%SS)，U25(25%US +75%SS)和U0(100%SS)比例配制種子發(fā)芽和幼苗生長基質，每盆使用土壤200 g，將U0即完全滅菌土壤作為對照(CK)。

種子發(fā)芽試驗中，將供試種子在0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，并用蒸餾水沖洗，完成種子表面消毒。每盆挑選籽粒飽滿的供試種子50粒，放入裝有基質的小花盆中，輕翻基質，使種子完全覆在基質中，按照未滅菌土與滅菌土配比設置，設5個處理，每個處理設5次重復，每種牧草計25盆，5種供試牧草總計125盆。幼苗生長試驗中，按照種子發(fā)芽試驗要求先進行種子預發(fā)芽，待種子發(fā)芽5 d后，選擇長勢一致的幼苗移栽至小花盆中，每盆移植10株，3盆作為一個重復；同樣設U100，U75，U50，U25和U0共5個處理，每個處理設3次重復，每種牧草計45盆，5種供試牧草總計225盆。在光周期為12 h/12 h，溫度為 20℃/16℃，光照為3 000 lx的培養(yǎng)箱中進行試驗，每盆每隔兩日澆化感物質水浸液20 mL，如遇干旱則噴灑蒸餾水保持土壤潤濕。發(fā)芽試驗連續(xù)記錄15 d，以胚芽超出基質作為發(fā)芽標準，記錄后去除已發(fā)芽種子。幼苗生長數(shù)據(jù)測定在移植生長15 d后進行，將植物幼苗從小花盆中取出，洗凈根部附著的基質，每個重復隨機取10株測量根長(Root length,RL;單位：cm)和苗高(Shoot length,SL;單位：cm)。測量后將10株植株裝入紙袋，于65℃下烘干至恒重，稱重獲得10株植株干重(Dry weight,DW;單位：mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

種子發(fā)芽率(Germination percentage，GP)、化感效應指數(shù)(Allelopathic response index，RI)和綜合促進率(Comprehensive effect promotion rate，CE)按照以下公式計算：

CE(%)=
RI(%)GP+RI(%)RL+RI(%)SL+RI(%)DW

其中，下標GP，RL，SL和DW依次代表發(fā)芽率(%)、根長(cm)、苗高(cm)和干重(mg)相對應的數(shù)值，CE(%)的絕對值大小表示綜合促進率的強弱。

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)比較不同處理間差異顯著性。SPSS 21.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)進行方差分析，Origin 2018(OriginLab Inc.,Northampton,Massachusetts,USA)繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同基質組成對種子發(fā)芽的影響

土壤微生物調節(jié)下的種子發(fā)芽率如圖1所示，5種栽培牧草種子發(fā)芽率表現(xiàn)出隨滅菌土壤量的增加而逐漸降低趨勢。垂穗披堿草種子發(fā)芽率在U100，U75，U50和U25處理下無顯著性差異，但這四種處理與U0存在顯著性差異(P<0.05)。與U100相比，在U0處理下老芒麥和中華羊茅受到抑制，且與U100差異顯著(P<0.05)，但這兩種處理與U75，U50和U25處理間差異不顯著。草地早熟禾和冷地早熟禾種子發(fā)芽率在5種處理間無顯著性差異，但也呈現(xiàn)出隨未滅菌土壤的減少而降低的趨勢。

圖1 土壤微生物量影響下的種子發(fā)芽率Fig.1 Germination percentage of tested grass following microbial biomass注：同族不同小寫字母表示不同微生物量U100，U75，U50，U25和U0之間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Difference lowercase letters indicate significant difference among treatments in the same grass at 0.05 level,the same as below

2.2 不同基質組成對幼苗苗高的影響

微生物對栽培牧草幼苗苗高的影響與其對發(fā)芽率影響趨勢相似，幼苗苗高隨滅菌土壤量的增加而逐漸降低(圖2)。在U100和U0處理下，垂穗披堿草幼苗苗高表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05)，但二者與U75，U50和U25處理間差異不顯著。老芒麥在U100，U75，U50，U25處理間幼苗苗高未表現(xiàn)出顯著差異，而U100，U75與U0差異顯著(P<0.05)。中華羊茅、草地早熟禾和冷地早熟禾幼苗苗高在各組間無顯著性差異。

圖2 土壤微生物影響下幼苗苗高Fig.2 Shoot length of tested grass following microbial biomass

2.3 不同基質組成物對幼苗根長的影響

土壤微生物對幼苗根長的影響表現(xiàn)如圖3所示，在不同土壤微生物影響下不同的牧草表現(xiàn)出一定的差異。垂穗披堿草和冷地早熟禾幼苗根長變化相似，U25和U0處理間差異不顯著，但與U100處理差異顯著(P<0.05)；而三者與U75和U50處理間差異不顯著。老芒麥和中華羊茅幼苗根長均表現(xiàn)為U100與其余4組處理間差異顯著(P<0.05)，而其他4組處理之間無顯著性差異。在U100和U0處理下，草地早熟禾幼苗根長為差異顯著(P<0.05)，但二者與U75，U50和U25間差異不顯著。

圖3 土壤微生物影響下的幼苗根長Fig.3 Root length of tested grass following microbial biomass

2.4 不同基質組成對幼苗干重的影響

微生物量對栽培牧草幼苗干重的影響因栽培牧草的不同和處理的差異而表現(xiàn)出不同的變化(圖4)。垂穗披堿草干重在U25和U0處理間差異不顯著，但與U100處理差異顯著(P<0.05)；而三者與U75和U50處理間差異不顯著。老芒麥在U25處理下與其4組無顯著性差異，U100，U75和U50處理間無顯著差異，但同U0間呈顯著性差異(P<0.05)。中華羊茅和草地早熟禾干重受抑制，在U100和U0處理下間差異顯著(P<0.05)，但這兩種處理與U75，U50和U25處理間差異不顯著。冷地早熟禾在U100和U75處理下干重未表現(xiàn)出顯著差異，但與U0差異顯著(P<0.05)。

圖4 土壤微生物影響下的幼苗干重Fig.4 Dry weight of grasses following microbial biomass and fertility

2.5 不同基質組成對栽培牧草的綜合影響

比較未滅菌土壤和滅菌土壤對栽培牧草的綜合影響，如圖5所示，微生物對栽培牧草發(fā)芽和生長的影響因栽培牧草的不同而存在差異。在種子發(fā)芽階段，微生物對中華羊茅種子發(fā)芽率促進作用最為明顯為7.69%，其后依次為垂穗披堿草(7.02%)、冷地早熟禾(5.59%)、老芒麥(5.08%)和草地早熟禾(4.35%)。在生長階段，微生物對5種栽培牧草苗高綜合促進率平均為9.61%，其中促進率最高值為垂穗披堿草11.92%，最低值為中華羊茅8.06%。微生物對草地早熟禾幼苗根長的促進率高達16.02%，而對老芒麥的促進率僅為6.13%。在幼苗干重方面促進作用差異更為明顯，最高綜合促進率的草地早熟禾(17.14%)與中華羊茅(16.58%)，約為老芒麥(3.98%)4倍。

圖5 土壤微生物對栽培牧草種子發(fā)芽和幼苗生長的綜合效應Fig.5 Comprehensive effects of microbial levels on grass germination and growth

3 討論

土壤微生物量是存在于土壤環(huán)境中對環(huán)境的變化比較敏感的指標，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。土壤微生物種類繁多，數(shù)量龐大，不僅在土壤發(fā)育形成、基本物質循環(huán)和土壤肥力演變中扮演著重要角色，還影響著生態(tài)系統(tǒng)的功能完整性[14]。微生物通過自身代謝活動，分泌有機酸等物質黏結土壤粒子組成土壤團粒結構，促進土壤的形成和發(fā)育；部分代謝產(chǎn)物能促進礦物質分解，以助植物吸收利用[15-17]。研究顯示，土壤微生物量與土壤健康狀況密切相關，也能指示草地生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)能力強弱，當土壤微生物量下降時，表明土壤微生物活性降低，土壤出現(xiàn)一定程度的退化[18-20]。

本研究中，以U100，U75，U50和U25為基質的5種栽培牧草種子發(fā)芽率均高于U0，且隨基質中微生物的減少而有類似的遞減規(guī)律，雖對不同物種的影響存在差異，但也證明了微生物量的增加提高了種子發(fā)芽率。這與Rudgers and Orr研究高羊茅及其內生真菌通過土壤中的化學或生物變化影響樹苗生長的結果類似[21]，以及Zhu等人[22]對土壤生物區(qū)系降低了入侵紫莖澤蘭的化感效應的研究結果一致，均表明土壤微生物具有減輕化感效應的重要作用。高小寬等[23]對禾本科植物小麥的研究表明，根際微生物可有效加快小麥種子的萌發(fā)速度，提高種子的發(fā)芽率結果也與本研究一致。土壤微生物分解動植物殘體等有機質形成腐殖質，改善土壤的結構和耕性，釋放營養(yǎng)元素供給植物吸收利用[24-26]。同時，殘體分解也伴隨著化感物質在土壤中的遷移、轉化，進入土壤中的化感物質，由于溫度、水分、養(yǎng)分等因素與微生物的種類和數(shù)量密切相關，因此有的化感物質可被微生物分解而失活[27]。本研究中，微生物對種子發(fā)芽率促進可能與其分泌的一些激素等有利于種子萌發(fā)的生物活性物質有關；另外，也可能是土壤微生物消耗有機分子，使化感物質不能積累到植物毒性水平，因而受體植物在自然情況下不表現(xiàn)出任何化感效應，但究其具體原因還有待于進一步研究。

比較U100，U75，U50，U25和U0基質下幼苗的生長狀況，結果顯示垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗苗高隨土壤微生物含量的增加而增加，但對于兩種早熟禾的影響不明顯。這應該與幼苗的大小存在聯(lián)系，5種栽培牧草生長時間一致，但早熟禾因種子小，出苗時根與芽生長相對較小，在初期生長階段受微生物的促進影響較弱，尚未表現(xiàn)出明顯性狀。研究表明，土壤微生物多樣性越豐富，更適合于植物根系的生長[28-29]。本研究顯示，在U100處理下，5種栽培牧草幼苗的根長均高于其他處理組，證明在幼苗生長階段土壤微生物的多樣性與生物量對根系生長至關重要。對比以U75，U50，U25和U0為基質的實驗組，發(fā)現(xiàn)它們之間變異較小，說明完整的土壤微生物組成更能有效促進幼苗根長。在植物生長過程中，根系分泌物向土壤微生物提供大量的營養(yǎng)與碳源，影響微生物群落結構，產(chǎn)生有利于種子發(fā)芽和植物生長的生物活性物質，提高了種子發(fā)芽率并促進了幼苗生長[30-31]。本研究中，垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗干重的變化趨勢同幼苗苗高一致，幼苗干重可能受幼苗苗高影響更為突出。這可能是垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅種子，種子萌發(fā)時胚乳營養(yǎng)儲備充裕，滿足了萌發(fā)后幼苗快速生長的營養(yǎng)需求。

種子的萌芽測試因方法簡單、重復性好，易于控制，成為化感潛力分析中最重要和最廣泛的方法之一。幼苗生長試驗是對受體幼苗生長和發(fā)育指標的測定，通常以根長、苗高、干鮮重等指標來判斷化感效應。一般認為，幼苗生長試驗比種子萌芽測試更為敏感，化感潛力是研究化感效應不可缺少的部分，種子萌發(fā)測試和幼苗生長試驗是最常見的化感潛力分析方法[32]。綜合對比研究結果，基質對5種栽培牧草的平均促進率為38.72%，其中對冷地早熟禾、中華羊茅與草地早熟禾的促進作用較大，依次為46.74%，46.56%和45.49%，且主要表現(xiàn)在根系生長和幼苗干重方面。對垂穗披堿草和老芒麥，兩種披堿草屬的栽培牧草相對較小，這可能與物種的進化史有關。

4 結論

以U100，U75，U50，U25 和U0為基質的5種栽培牧草種子發(fā)芽率呈逐漸降低趨勢，土壤微生物能緩解化感效應提高種子發(fā)芽率，但對不同物種的影響存在差異。比較U100，U75，U50，U25和U0處理下幼苗苗高的生長狀況，結果顯示垂穗披堿草、老芒麥和中華羊茅幼苗苗高隨土壤微生物含量的增加而增加，但對于兩種早熟禾的影響不明顯。在U100處理下，5種栽培牧草幼苗的根長均高于其他處理，表明在幼苗生長階段土壤微生物對根系生長至關重要。幼苗干重的變化趨勢同幼苗苗高相似，可能受幼苗苗高影響更為突出。基質的微生物對冷地早熟禾、中華羊茅與草地早熟禾的促進作用較大，依次為46.74%，46.56%和45.49%，且主要表現(xiàn)在根系生長和幼苗干重方面。