高 微,鄭 培,陳 瑩,王 策,袁麗云,曹志然

布氏菌與巨噬細胞的相互作用機制

高 微,鄭 培,陳 瑩,王 策,袁麗云,曹志然

布氏菌病是由布氏菌感染引起的、嚴(yán)重的人獸共患傳染病。病原是一種革蘭氏陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌。巨噬細胞既是重要的固有免疫應(yīng)答細胞同時又是布氏菌感染的重要靶細胞，布氏菌進入宿主后在一系列毒力因子的幫助下侵入宿主的巨噬細胞中，并通過多種機制抵抗巨噬細胞的殺菌作用，有利于其在巨噬細胞內(nèi)生存和繁殖；同時巨噬細胞也可通過一系列機制抵抗布氏菌的感染。通過研究布氏菌與巨噬細胞的相互作用機制對于布氏菌病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。

布氏菌；巨噬細胞；機制；毒力因子；細胞因子

布氏菌是革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，它引起的布氏菌病是一種重要的人畜共患傳染病，布氏菌可通過消化道、呼吸道、泌尿生殖道和皮膚等多種途徑進入體內(nèi)，臨床主要表現(xiàn)為波浪熱、關(guān)節(jié)炎、脊柱損傷、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心內(nèi)膜炎、睪丸炎和附睪炎等多器官損傷，還可能引起孕婦或懷孕動物的流產(chǎn)。該病在全球有著廣泛的流行區(qū)域，尤其是在發(fā)展中國家，已成為嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病之一。據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的信息，2013年感染人數(shù)為43 486例，比2012年(39 515例)增加10%，位居37種報告?zhèn)魅静〉牡?3位，因此給人類的經(jīng)濟生活和身心健康帶來了巨大的影響。但是目前尚無安全有效的疫苗用于本病的預(yù)防，而適合人類應(yīng)用的新疫苗的研制有賴于布氏菌與宿主作用機制的深入研究。巨噬細胞既是重要的免疫細胞又是布氏菌感染的主要靶細胞，因此布氏菌與巨噬細胞相互作用的機制是廣大研究者研究的重要課題，本文綜述了布氏菌與巨噬細胞相互作用機制研究進展。

1 布氏菌抵抗巨噬細胞殺傷作用機制

布氏菌不存在典型的毒力因子如溶細胞素、外毒素分泌蛋白、菌毛等，其能侵入巨噬細胞并且逃脫巨噬細胞的殺傷作用而在其中繁殖，胞內(nèi)環(huán)境為布氏菌的生長繁殖提供了一個安全的空間，以防止在感染過程中產(chǎn)生的抗體和補體的作用[1]。巨噬細胞在機體固有免疫應(yīng)答中占據(jù)很重要的位置，它既可以提呈抗原啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，又可以非特異性吞噬殺傷多種病原微生物，而這些作用都不能阻止布氏菌在其中的繁殖，主要原因有以下幾點：①布氏菌抑制吞噬內(nèi)體與溶酶體融合；②布氏菌適應(yīng)巨噬細胞內(nèi)惡劣環(huán)境；③布氏菌可抑制巨噬細胞活化及分泌細胞因子；④布氏菌抑制巨噬細胞抗原提呈；⑤抑制巨噬細胞凋亡。這些都需要布氏菌與巨噬細胞的相互作用。

1.1 布氏菌可抑制吞噬小體和溶酶體融合 細菌進入巨噬細胞后可形成吞噬小體，吞噬小體與胞內(nèi)的溶酶體融合形成的吞噬溶酶體可以將細菌分解從而殺死細菌。然而研究表明光滑型布氏菌感染后，它的LPS O-鏈抑制吞噬小體與巨噬細胞溶酶體的早期融合，因粗糙型布氏菌不能表達O抗原，所以迅速與溶酶體融合，導(dǎo)致布氏菌降解[2]。因此布氏菌的LPS O-鏈抑制吞噬溶酶體的形成以保護它不被溶酶體酶降解。

此外布氏菌小體(BCVs)的成熟涉及到與細胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)相互作用并融合，此過程導(dǎo)致一個允許細菌復(fù)制的空泡產(chǎn)生，Porte等的研究表明一個virBⅣ型分泌系統(tǒng)的布氏菌突變體不能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用，并且會通過與溶酶體融合而被殺死，據(jù)此說明Ⅳ型分泌系統(tǒng)通過參與BCVs成熟抑制吞噬溶酶體形成[3]。

1.2 布氏菌可適應(yīng)巨噬細胞內(nèi)惡劣環(huán)境 布氏菌進入巨噬細胞后面臨各種惡劣環(huán)境，包括營養(yǎng)缺乏、低pH、氧化環(huán)境，長期在巨噬細胞中存活的布氏菌可以表達各種基因產(chǎn)物來適應(yīng)胞內(nèi)惡劣環(huán)境[4]。

1.2.1 抵抗?fàn)I養(yǎng)不足 細菌的胞內(nèi)生存都需要營養(yǎng)支持，然而布氏菌進入巨噬細胞后形成吞噬體，在吞噬體中表現(xiàn)出明顯的營養(yǎng)不足，所以布氏菌株阻斷糖酵解途徑，利用磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)作為能量來源[5]。營養(yǎng)不足主要表現(xiàn)為氧氣缺乏，氧氣作為電子終端受體為布氏菌的呼吸代謝提供燃料。研究表明布氏菌可以產(chǎn)生cbb3型細胞色素C氧化酶和細胞色素bd泛醇氧化酶復(fù)合物，它允許NO3-代替O2作為電子終端受體參與呼吸代謝，使細菌在低O2濃度下有效呼吸。所以布氏菌可以抵抗低氧的營養(yǎng)不足環(huán)境，在巨噬細胞內(nèi)復(fù)制和繁殖[6]。

1.2.2 抗氧化損害 布氏菌在有氧呼吸過程中產(chǎn)生活性氧(ROS)如O2-和H2O2代謝產(chǎn)物，由于O2-為帶電分子所以不能通過細菌細胞膜，所以會抑制布氏菌的生長繁殖，但研究表明布氏菌可以產(chǎn)生應(yīng)激蛋白超氧化物歧化酶(SOD)來抵抗活性氧代謝產(chǎn)物的損害，使布氏菌能在胞內(nèi)生存[7]。

1.2.3 耐受酸性環(huán)境 酸性環(huán)境可以抑制細菌的生長繁殖，然而布氏菌卻可以通過產(chǎn)生各種基因產(chǎn)物耐受它所遇到的酸性環(huán)境從而在胞內(nèi)生長繁殖。hdeA是布氏菌周質(zhì)中的分子伴侶，Valderas的研究表明，一個布氏菌hdeA突變株對酸性環(huán)境的抵抗能力比野生菌株弱，由此證明hdeA在布氏菌抵抗酸性環(huán)境中起到重要作用。布氏菌2308株也可以通過產(chǎn)生基因產(chǎn)物Asp24結(jié)合蛋白耐受它所遇到的酸性環(huán)境[8]，使其順利在胞內(nèi)復(fù)制繁殖。

1.3 布氏菌可抑制巨噬細胞活化及分泌細胞因子 巨噬細胞可通過產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等多種細胞因子來發(fā)揮抗感染作用。但布氏菌感染巨噬細胞后卻抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子的產(chǎn)生。Jubier-Maurin 等人研究了野生型B.suis1330的主要外膜蛋白(Omp25和Omp31)對細胞因子產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明B.suis的Omp25對巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α起負(fù)調(diào)控作用[9]。

布氏菌的LPS也抑制細胞因子的分泌，研究表明布氏菌的內(nèi)膜蛋白bacA影響LPS的結(jié)構(gòu)，Parent等用bacA基因敲除的布氏菌突變株KL7感染BALB/c小鼠腹腔，結(jié)果巨噬細胞產(chǎn)生大量細胞因子抵抗KL7的感染，相反野生型布氏菌2308感染C57BL/6小鼠卻不能誘導(dǎo)細胞因子分泌，結(jié)果表明布氏菌的LPS可以抑制巨噬細胞活化及細胞因子分泌[10]。

1.4 布氏菌可抑制抗原提呈 外源性細菌侵入宿主后，巨噬細胞可以通過吞噬細菌來攝取抗原，并加工處理形成抗原肽-MHC-II復(fù)合物，呈遞給CD4+T細胞啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答來抵抗細菌感染。但布氏菌進入巨噬細胞后通過一系列機制抑制其抗原提呈能力，因此減弱T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[11]。研究表明布氏菌LPS雖然不能抑制MHC-II類分子表達，但可在空間上干擾MΦ的MHC-II類分子，抑制其抗原提呈[12]。Barrionuevo等體外培養(yǎng)B.abortusS2308和B.ovisREO 198后感染小鼠腹腔，實驗證明布氏菌脂蛋白L-Omp19可通過TLR2和IL-6抑制IFN-γ誘導(dǎo)MΦ表達MHC-Ⅱ分子及其抗原提呈，阻止抗原特異性T細胞對布氏菌的識別，逃避機體的免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致慢性感染的形成[13]。

1.5 布氏菌可抑制巨噬細胞凋亡 外來細菌進入細胞后會誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，一方面細胞凋亡后胞內(nèi)細菌釋放到胞外環(huán)境中可被抗體、補體和各種抗生素捕獲，從而殺死細菌；另一方面凋亡小體釋放出的抗原成分可被樹突狀細胞(DC)識別使其活化并提呈抗原啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但布氏菌感染巨噬細胞后能通過各種機制抑制其凋亡，使其能在胞內(nèi)復(fù)制繁殖。

Cui 等的研究表明巨噬細胞凋亡需要鈣依賴性蛋白酶2的參與，而布氏菌感染后會使鈣蛋白酶2下調(diào)，從而抑制巨噬細胞凋亡[14]。Guo等用布氏菌16M株感染小鼠巨噬細胞可以引發(fā)自噬體的形成從而激活巨噬細胞的自噬途徑，該途徑能夠抑制半胱天冬酶9(Caspase-9)凋亡通路，從而抑制巨噬細胞凋亡，使布氏菌利于在宿主細胞內(nèi)存活[15]。

布氏菌抑制巨噬細胞凋亡的另一原因是特定的線粒體相關(guān)基因的下調(diào)作用，引起巨噬細胞大部分轉(zhuǎn)錄改變。首先線粒體是活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要場所，ROS是各種需氧細胞在應(yīng)對不同刺激時產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物，它在細胞凋亡早期可以起到信使作用，研究表明布氏菌感染誘發(fā)線粒體應(yīng)力路徑下調(diào)，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少，從而抑制巨噬細胞凋亡早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其次線粒體外膜通透性增加會促進一些凋亡因子如細胞色素C的釋放，它可以激活下游的細胞凋亡路徑，壓敏電阻器陰離子通道蛋白(Vdac1)對增加線粒體外膜通透性起重要作用，He 等的實驗證明布氏菌感染后Vdac1減少，從而抑制巨噬細胞凋亡。綜上所述，布氏菌感染早期引發(fā)巨噬細胞大部分轉(zhuǎn)錄改變，阻斷細胞色素C的釋放和線粒體活性氧的產(chǎn)生，防止細胞凋亡蛋白的級聯(lián)反應(yīng)激活，從而抑制巨噬細胞的凋亡[16]。

2 巨噬細胞抵抗布氏菌感染機制

即使布氏菌用很多策略試圖為它的復(fù)制創(chuàng)造一個合適的環(huán)境，宿主細胞仍然通過各種直接或間接途徑來識別和應(yīng)答布氏菌。機體固有免疫系統(tǒng)是抵抗布氏菌感染的第一道防線，致敏的CD4+T細胞分泌很多細胞因子包括IFN-γ、趨化因子等來激活巨噬細胞的抗菌活性[17]，MyD88依賴的樹突狀細胞成熟和細胞因子的產(chǎn)生對控制布氏菌感染也起作用[18]。

2.1 巨噬細胞作為固有免疫細胞發(fā)揮抗布氏菌感染作用 宿主固有免疫信號在布氏菌感染過程中起到了至關(guān)重要的作用，是抵御病原體的第一道防線，其中的巨噬細胞是布氏菌感染的主要靶細胞。固有免疫細胞通過抗原識別受體感受病原相關(guān)模式分子信號，并通過產(chǎn)生細胞因子和抗菌中間產(chǎn)物來對病原體快速應(yīng)答，一個病原相關(guān)模式分子與一個特定的模式識別受體相互作用啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子激活，激活的細胞核轉(zhuǎn)錄因子易位導(dǎo)致炎癥細胞因子Ⅰ型干擾素、趨化因子等表達[19-20]，從而啟動抗感染過程。

常見的模式識別受體有Toll樣受體(TLRs)、NOD樣受體(NLRs)，TLRs參與細胞外或液泡的激活途徑，誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的前體形式表達，NLRs對胞質(zhì)刺激產(chǎn)生應(yīng)答[21]。在布氏菌感染過程中最主要的受體是TLRs，因為細胞信號是由TLRs激活開始的。TLR2受脂質(zhì)外膜蛋白(L-Omp16和L-Omp19)激活，TLR4由布氏菌脂多糖和U-Omp16激活，TLR9由布氏菌DNA激活。Marco Tulio 等的研究表明TLRs通過MyD88和IRAK-4觸發(fā)胞內(nèi)信號激活，從而引起NF-κB和MAPKs激活并產(chǎn)生炎性細胞因子啟動抗感染過程[22]。其他胞質(zhì)受體如NLRC4、NLRP3等在識別布氏菌中也起到附加作用，這些受體被布氏菌激活使NF-κB激活導(dǎo)致細胞因子合成。綜上所述，布氏菌可能激活數(shù)個固有受體使細胞內(nèi)信號激活和細胞因子的產(chǎn)生達到頂峰，其中TLRs對控制布氏菌感染是必需的，而NLRs(如NOD1和NOD2)對清除布氏菌是非必需的[23]。

2.2 巨噬細胞可抗原提呈啟動抗布氏菌適應(yīng)性免疫應(yīng)答 機體的抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)包括巨噬細胞、樹突狀細胞(dentritic cell, DC)、B細胞，但Billard 的研究表明若機體內(nèi)巨噬細胞被局部清除后，DC可以被更好的激活以捕獲和提呈抗原[24]。DC雖然可以直接捕獲布氏菌，但捕獲后不能被有效激活，經(jīng)研究DC可以捕獲周圍凋亡或分解破裂的細胞碎片而被激活，推測可能這些碎片中含有的布氏菌抗原成分被DC捕獲，促使DC激活和成熟并提呈抗原啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[25]。Li 等的實驗證明光滑型菌株S2308誘導(dǎo)DC壞死和凋亡，而RB51減毒活疫苗誘導(dǎo)半胱天冬酶2(Caspase-2)介導(dǎo)的DC成熟、細胞因子的產(chǎn)生和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動[26]。

綜上所述，布氏菌通過一系列毒力因子抵抗巨噬細胞的殺傷作用使其能在宿主體內(nèi)復(fù)制繁殖，巨噬細胞通過啟動各種固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答來抵抗布氏菌的感染。研究布氏菌與巨噬細胞相互作用的機制，不僅可以闡明布氏菌的致病機制，還將為安全有效疫苗的研制提供新的思路。

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Cao Zhi-ran; Email: caozhiran@163.com

Interaction mechanisms betweenBrucellaand macrophages

GAO Wei,ZHENG Pei,CHEN Ying,WANG Ce,YUAN Li-yun,CAO Zhi-ran

(HebeiUniversity,Baoding071000,China)

The pathogen of brucellosis is a Gram-negative, facultative intracellular bacterium. Macrophages are not only the important cells of the innate immune response but also the main target cells ofBrucella. After entering into hosts,Brucellacan invade macrophages with the help of a series of virulence factors and resist the bactericidal effect of macrophages by many mechanisms, which is good forBrucellato survive and reproduce in macrophages. At the same time, macrophages also resist the infection ofBrucellathrough a series of mechanisms. Researching the interaction mechanisms betweenBrucellaand macrophages has important guiding meaning to the prevention and treatment of brucellosis.

Brucella; macrophage; mechanism; virulence factor; cytokines

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.018

河北省自然科學(xué)基金項目(No.C2010000243)和河北大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(No.201410075028)聯(lián)合資助

曹志然，Emial:caozhiran@163.com

河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定 071000

Funded by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2010000243)

R378

A

1002-2694(2015)08-0771-04

2014-11-05；

2015-03-16