曹 欣， 吳康樂， 文樂元， 黃麗娟， 肖潤林， 張志飛*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 湖南 長沙 410128； 2.湖南省畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心， 湖南 長沙 410006； 3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 湖南 長沙 410125)

綠狐尾藻(MyriophyllumelatinoidesGaudich)屬小二仙草科多年生沉水或浮水草本植物，能有效吸附氮、磷等水體富營養(yǎng)元素，廣泛應(yīng)用于污染水體的生態(tài)修復(fù)[1,2]，其在富營養(yǎng)化水體中生長速度快，多次收割條件下其收獲的生物量(干重)高達 5.34～13.42 g·m-2·d-1，且營養(yǎng)價值較高[3-4]。生長旺盛期大規(guī)模刈割后的綠狐尾藻可開發(fā)為非常規(guī)飼料資源[5-7]。但綠狐尾藻含水量高，調(diào)制干草需要大量能耗；與干物質(zhì)含量高的秸稈、農(nóng)副產(chǎn)品等進行混合青貯是經(jīng)濟高效的加工方式[8]。綠狐尾藻與水稻秸稈混合青貯，既可以平衡青貯原料含水量滿足乳酸菌繁殖需求，提高青貯成功率，還可以實現(xiàn)秸稈資源的有效利用[9]。水稻秸稈資源豐富，成本低廉，但營養(yǎng)價值低，纖維含量高，過量添加會降低青貯的青貯品質(zhì)和營養(yǎng)價值[10]。玉米粉、麥麩等農(nóng)副產(chǎn)品可溶性碳水化合物含量高，常作為青貯吸附型添加劑[11]，但價格較高，添加比例高會導(dǎo)致混合青貯成本增高。此外，混合青貯常添加葡萄糖作為發(fā)酵底物，以滿足乳酸菌大量繁殖需求，迅速啟動發(fā)酵，提高發(fā)酵品質(zhì)。孫茜等[12]研究表明乳酸菌菌劑搭配葡萄糖有利于綠狐尾藻青貯過程中乳酸菌的快速繁殖。但目前，利用吸附劑、青貯添加劑制備經(jīng)濟、高效的綠狐尾藻混合青貯體系的研究尚較少。本研究以不同混合比例的水稻秸稈和麥麩分別與70%左右綠狐尾藻為原料，分別添加植物乳桿菌和0，2%，4%和6%的葡萄糖進行混合青貯，測定其青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性，旨在利用水稻秸稈和少量葡萄糖替代麥麩提升綠狐尾藻混合青貯飼料質(zhì)量，探討狐尾藻混合青貯體系中適宜添加的水稻秸稈、麥麩比例及葡萄糖的比例，為狐尾藻混合青貯加工技術(shù)的完善提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯材料為湖南金井中國科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測站(28°55′36″N，113°34′65″E)三級凈化系統(tǒng)的綠狐尾藻，在2019年8月4號刈割水上部分并粉碎至1～2 cm。水稻秸稈為當(dāng)年收獲的稻草粉碎后備用，麥麩來自五得利面粉集團有限公司，植物乳桿菌(臺灣亞芯有限公司，菌含量為1×1011cfu·g-1，添加量為1×106cfu·g-1FM)，葡萄糖(國藥有限公司)。綠狐尾藻、麥麩和水稻秸稈化學(xué)成分如表1所示。

表1 綠狐尾藻、麥麩和水稻秸稈化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of Myriophyllum elatinoides,rice straw and wheat bran 單位：% DM

1.2 試驗設(shè)計

試驗前一天測定新鮮綠狐尾藻、水稻秸稈、麥麩等原料含水量，以混合后青貯原料理論含水量為65%為前提，計算分別添加水稻秸稈0%，5%，10%，15%所相應(yīng)的麥麩的添加量和新鮮綠狐尾藻的添加量。

采用雙因素完全隨機設(shè)計，A因素為水稻秸稈添加比例：0%，5%，10%，15%；B因素為葡萄糖添加比例：0%，2%，4%，6%(以混合青貯原料總質(zhì)量為基礎(chǔ))。植物乳桿菌每組固定添加，添加量1×106cfu·g-1FM。共有16個處理組，每個處理組設(shè)4個重復(fù)，處理方式如表2所示。

表2 試驗設(shè)計分組Table 2 Experimental grouping

按照配比將綠狐尾藻、水稻秸稈、麥麩充分混合，噴灑植物乳桿菌，添加一定比例葡萄糖，再次充分混合，使用聚乙烯真空青貯飼料袋(長40 cm，寬28 cm，厚度0.02 mm)模擬裹包，每袋青貯包約500 g，放入室溫青貯后開包取樣進行各項指標(biāo)分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1感官品質(zhì)測定 開包后首先進行青貯飼料感官鑒定，根據(jù)德國農(nóng)業(yè)協(xié)會評分法，根據(jù)氣味、結(jié)構(gòu)和色澤進行評估并計分，按照得分評定為優(yōu)、良、中、下4個等級[13]。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)測定 每重復(fù)四分法取20 g青貯鮮料裝入250 mL錐形瓶，加入180 mL去離子水，用榨汁機(九陽JYL-C012型多功能攪拌機)將其榨碎，先后用4層紗布過濾，得到青貯飼料浸提液，用于pH值、氨氮(NH3-N)、乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propanoic acid，PA)、丁酸(Butyric acid，BA)的測定，各指標(biāo)3次重復(fù)。

pH值采用Spectrum公司SI400型pH計測定；采用Agilent 1260高效液相色譜儀測定乳酸的含量[14][色譜柱：AcclaimTMOrganic acid(4.00 mm×150 mm，5 um)；進樣體積：5 uL；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30℃；流動相：50 mM磷酸二氫鈉溶液，運行時間：10 min；檢測波長210 nm)；乙酸、丙酸、丁酸含量采用氣相色譜儀Agilent 7890A測定(色譜柱：DB-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25 um)；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：1 uL；分流比：50∶1；程序升溫條件：60℃，保持2 min，以20℃升至220℃，保持3.5 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器，溫度：250℃]。氨氮測定方法參照T/CAAA 003-2018中的苯酚-次氯酸鈉比色法[15]。

參照日本草地畜產(chǎn)協(xié)會制定的青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)V-Score評分標(biāo)準[16]，以鮮樣(Fresh weight，F(xiàn)W)中氨氮/總氮、乙酸、丙酸及丁酸含量計算評分值。

1.3.3營養(yǎng)品質(zhì)測定 四分法從青貯包中取200 g樣品，105℃烘箱中15 min殺青，然后調(diào)至65℃烘干到恒重，測定干物質(zhì)(Dry matter，DM)等指標(biāo)。凱氏定氮法測粗蛋白(Crude protein，CP)[17]，酸堿消煮法測粗纖維(Crude fiber，CF)[17]，范氏法測中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)[17]，蒽酮比色法測可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrate，WSC)[18]。各指標(biāo)3次重復(fù)。

1.3.4有氧穩(wěn)定性分析 青貯包打開后，將每處理剩余的青貯飼料充分混勻后，把約200 g的青貯料放入2.5 L小塑料桶中，將MDL-1048A高精度溫度記錄儀的傳感器插入青貯料中，用紗布將桶口蓋住，防止交叉污染和減少水分損失，然后將傳感器接線有序插入記錄儀上，每30 min自動記錄一次溫度變化情況，每處理3次重復(fù)，當(dāng)溫度比外界溫度高出2℃時結(jié)束試驗，記錄有氧穩(wěn)定性時長(Aerobic stability，AS)。室溫為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行初步整理，試驗結(jié)果以平均值表示，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行統(tǒng)計分析。各測定數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)；處理組間進行LSD法多重比較(P<0.05)；水稻秸稈和葡萄糖添加比例和發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)指標(biāo)和有氧穩(wěn)定性進行皮爾遜線性相關(guān)性分析。

根據(jù)公式計算原料成本：

混合青貯成本(元)=原料A所占混合原料比例×原料A成本價+原料B所占混合原料比例×原料B成本價+原料C所占混合原料比例×原料C成本價。

麥麩2 000 元·t-1、水稻秸稈600 元·t-1(www.cnhnb.com惠農(nóng)網(wǎng)數(shù)據(jù))；綠狐尾藻鮮草人工打撈成本100 元·t-1；葡萄糖價格3 800 元·t-1(www.1688.com阿里巴巴數(shù)據(jù))。

依據(jù)田鳳調(diào)[19]提出的秩和比法(Rank-sum ratio，RSR)對不同處理綠狐尾藻混合青貯的綜合效果進行評價，對高優(yōu)指標(biāo)和低優(yōu)指標(biāo)分別降序、升序排序，并計算RSR，取值越小表明綜合評價越好。RSR計算公式如下：

式中，指標(biāo)j= 1,2,3,，m；組別I = 1,2,3，n；Rij為第i組第j個指標(biāo)的秩。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合青貯感官評定分析

對開包后的青貯進行感官評價，莖葉結(jié)構(gòu)均保持良好，除Z0,Z2,Z4,Z6,F4和F6色澤略有變色外，其他組皆與原料相似，F(xiàn)0、T0和FT0丁酸味較重。F2,F4,F6,T2,T4和FT4感官評價等級為優(yōu)秀，其他組皆為良好(表3)。

表3 綠狐尾藻混合青貯感官評定分析Table 3 Sensory evaluation analysis of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.2 葡萄糖和水稻秸稈添加對混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

如表4所示，水稻秸稈添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用對混合青貯發(fā)酵品質(zhì)的pH值、NH3-N/TN、LA、AA、PA和BA含量均有極顯著影響(P<0.01)。以水稻秸稈添加比例為主效應(yīng)分析表明，各處理BA含量隨水稻秸稈添加比例增加而顯著增加，存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；未添加水稻秸稈和添加15%水稻秸稈的混合青貯飼料pH、NH3-N/TN和乙酸顯著低于其他2個處理組，所有處理組pH均在4.2以下，NH3-N/TN低于10%，屬于優(yōu)質(zhì)青貯飼料的pH和NH3-N/TN范圍。以葡萄糖添加比例為主效應(yīng)分析表明，各處理pH值隨葡萄糖添加比例增加而顯著下降，存在顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；未添加葡萄糖的混合青貯飼料的NH3-N/TN、AA、PA和BA顯著高于其他3個處理組，LA含量均顯著低于其他3個處理組(P<0.05)；隨著葡萄糖添加比例增加，混合青貯飼料的NH3-N/TN、AA、PA和BA含量有下降趨勢，但無顯著相關(guān)性。

表4 綠狐尾藻混合青貯發(fā)酵品質(zhì)雙因素方差分析Table 4 Two factor variance analysis of fermentation quality of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.3 葡萄糖和水稻秸稈添加對混合青貯營養(yǎng)品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響

如表5所示，水稻秸稈添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用對混合青貯營養(yǎng)品質(zhì)的WSC、CP、NDF、ADF、CF含量和AS均有極顯著影響(P<0.01)。以水稻秸稈添加比例為主效應(yīng)分析，隨著水稻秸稈添加比例的增加，各處理NDF、ADF、CF含量顯著增加，存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，CP含量顯著下降，存在極顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；未添加水稻秸稈和添加15%水稻秸稈的混合青貯飼料WSC含量顯著高于其他2個處理組(P<0.05)，未添加水稻秸稈和添加5%水稻秸稈的混合青貯飼料AS顯著高于其他2個處理組(P<0.05)。以葡萄糖添加比例為主效應(yīng)分析，隨著葡萄糖添加比例增加，CP、NDF、ADF、CF含量和AS均顯著降低，存在極顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與WSC含量有極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

表5 綠狐尾藻混合青貯營養(yǎng)品質(zhì)(%DM)和有氧穩(wěn)定性(h)雙因素方差分析Table 5 Two factor variance analysis of Nutrient quality (%DM) and aerobic stability (h) of Myriophyllum elatinoides mixed silage

2.4 混合青貯效果綜合評價

水稻秸稈添加比例、葡萄糖添加比例以及二者交互作用對混合青貯的發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性均有極顯著影響(P<0.01)，說明水稻秸稈和葡萄糖兩個因素不同水平同時作用對各指標(biāo)均有顯著的加強或減弱作用。鑒于此，將各處理看作單因素處理組(簡單效應(yīng)分析)，以感官評價等級、V-Score評分、LA/AA、CP含量和AS為高優(yōu)指標(biāo)，pH、NDF和ADF含量、原料成本為低優(yōu)指標(biāo)，排序后計算秩和比RSR值，進行綜合評價(表6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不添加葡萄糖處理組的V-Score評分在62.42～78.39，pH 4.5～4.55，LA/AA比值均<1，發(fā)酵品質(zhì)相對較差；其他處理組的V-Score評分均在80分以上，pH≤ 4.28，發(fā)酵品質(zhì)較好。隨水稻秸稈添加比例增加導(dǎo)致綠狐尾藻混合青貯飼料的CP、NDF和ADF含量隨之改變；在相同混合青貯配方處理組中，CP含量隨葡萄糖添加的增加而降低；葡萄糖添加比例對混合青貯飼料的NDF和ADF含量有一定影響，但無明顯規(guī)律，交互作用效應(yīng)明顯。T4,FT4和T6的有氧穩(wěn)定性較差(≤ 36 h)，Z6也較低(62 h)，其他處理組的有氧穩(wěn)定性均≥132 h，可見較高含量的葡萄糖和較高比例的水稻秸稈對綠狐尾藻混合青貯飼料的有氧穩(wěn)定性均有負面影響。

表6顯示,單獨添加2%～6%葡萄糖處理組的Z4,Z2,Z6,T4和F4青貯效果綜合排名位居前5，可見不添加水稻秸稈而添加2%～6%葡萄糖的綠狐尾藻混合青貯飼料CP含量在13%以上，NDF含量低于25%，ADF含量低于14%，飼用品質(zhì)和發(fā)酵品質(zhì)均較好。添加5%或10%的水稻秸稈并添加4%的葡萄糖也可獲得質(zhì)量較好的青貯飼料，其中添加10%水稻秸稈的T4綜合排名第四，原料成本最低。

表6 綠狐尾藻混合青貯品質(zhì)秩和比排序Table 6 Rank sum ratio ranking of mixed silage quality of Myriophyllum elatinoides

3 討論

3.1 綠狐尾藻青貯可行性分析

水生植物因附生乳酸菌含量低、含糖量低、含水量高等特點，青貯較陸生植物困難，但也不乏成功的經(jīng)驗。鳳眼蓮經(jīng)過厭氧、控水、調(diào)酸、調(diào)糖四步驟后能調(diào)制出優(yōu)質(zhì)的青貯飼料，將其替代部分日糧飼喂肉用山羊有較好的生產(chǎn)性能[20]；蘆葦和浮萍等[21-22]制作青貯飼料效果也較好。綠狐尾藻一般用于養(yǎng)殖場的污水處理，三級綠狐尾藻表面流人工濕地中第三層濕地生長的綠狐尾藻可達到飼用標(biāo)準，無有害物質(zhì)污染風(fēng)險，符合飼料安全[5]，綠狐尾藻干粉在飼喂豬[6,23]、鴨[24]等畜禽方面也有較好的效果，是可開發(fā)的非常規(guī)飼料資源。新鮮的綠狐尾藻含水量較高(90%)，吳康樂等[9]研究發(fā)現(xiàn)70% 綠狐尾藻與15%水稻秸稈和15%玉米粉混合可制備發(fā)酵品質(zhì)較好的青貯飼料，如再添加纖維素酶可進一步改善青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。本研究中以水稻秸稈和麥麩調(diào)節(jié)綠狐尾藻含水量進行青貯，感官評價等級均為良好以上；不添加水稻秸稈制備的綠狐尾藻麥麩混合青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)好，粗纖維含量較低，可考慮用于單胃家畜養(yǎng)殖；添加適當(dāng)?shù)钠咸烟呛退窘斩捒芍苽淝噘A品質(zhì)較好的粗飼料，且與添加30%麥麩相比，使用10%水稻秸稈替代麥麩添加，可以降低原料成本；今后可根據(jù)不同畜禽的營養(yǎng)需求，篩選適宜的綠狐尾藻混合青貯配方，并可通過酶制劑、乳酸菌制劑等添加劑改善青貯品質(zhì)，以便形成綠狐尾藻青貯標(biāo)準化加工程序，從根本解決綠狐尾藻非常規(guī)飼料加工和利用問題。

3.2 葡萄糖、水稻秸稈與麥麩添加對混合青貯品質(zhì)的影響

青貯pH值、V-score是衡量青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)，青貯飼料中pH≤4.2、V-score>80分時，青貯飼料發(fā)酵效果良好。本研究中未添加葡萄糖的4個處理組的pH值均>4.2，V-Score<80分，乳酸/乙酸比值<1，異型乳酸菌占主導(dǎo)地位[25]，從發(fā)酵品質(zhì)來看屬于中等；添加葡萄糖后顯著改善了綠狐尾藻混合青貯發(fā)酵品質(zhì)。黃梁木枝葉[26]和木薯葉[27]青貯中添加葡萄糖能降低青貯飼料pH值，木薯葉青貯中添加2%，4%的葡萄糖能顯著提高LA含量和顯著降低BA含量[27]，與本研究結(jié)果相似。本實驗中各處理組原料中的可溶性糖含量均滿足乳酸菌繁殖的最低含量(>6%)，但外源葡萄糖添加對發(fā)酵品質(zhì)仍有顯著影響；且葡萄糖添加比例對發(fā)酵品質(zhì)各指標(biāo)的作用效應(yīng)大于水稻秸稈添加比例，這可能是因為乳酸菌繁殖速度與可溶性糖含量及種類有關(guān)，乳酸菌在低糖環(huán)境條件下較正長環(huán)境下的生存能力差，水生植物含糖量普遍較低，且所含可溶性糖的類型可能不易于乳酸菌利用[28]。直接添加葡萄糖為乳酸菌繁殖提供直接糖源，更快的促進無氧環(huán)境中乳酸的積累，降低pH，從而改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。值得注意的是本研究中葡萄糖添加量與AS有極顯著負相關(guān)關(guān)系，這可能是葡萄糖添加比例增加促進了同型發(fā)酵，降低了AA含量，從而影響了有氧穩(wěn)定性。

青貯過程中植物呼吸、微生物蛋白酶活動及微生物脫氨等作用會造成青貯飼料中CP等營養(yǎng)成分流失或者纖維成分變化[29]。桑葉[30]和四倍體刺槐[31]中添加葡萄糖，青貯料中CP，NDF和ADF含量下降。本研究中隨著葡萄糖添加比例增加，CP，NDF，ADF和CF含量均極顯著降低(P<0.01)。本研究中混合原料WSC含量可以滿足調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯飼料所需6%～7%的要求，但是添加葡萄糖相較于未添加的青貯發(fā)酵品質(zhì)好，乳酸/乙酸比值較高；但粗蛋白含量損失較多，這與常規(guī)青貯結(jié)果相悖。該現(xiàn)象原因可能與水生植物青貯過程中微生物菌群多樣。有些酵母菌可分解蛋白質(zhì)，在低于pH4的環(huán)境下，也能表現(xiàn)較強活性[32]，而限制酵母菌的主要因素為乙酸[33]，本試驗中外源葡萄糖增多促進了同型乳酸菌發(fā)酵，但較低的乙酸含量可能無法完全抑制酵母菌的生長繁殖，多余的葡萄糖、乳酸等同時也為酵母等可降解氮化合物的微生物提供了繁殖底物，從而造成營養(yǎng)成分流失。因此，應(yīng)加強綠狐尾藻附生乳酸菌種類特性、綠狐尾藻青貯發(fā)酵微生物菌群多樣性等研究，以明確外源乳酸菌在綠狐尾藻青貯中的作用機理，為綠狐尾藻混合青貯發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

水稻秸稈與麥麩添加比例、葡萄糖添加比例以及二者互作對綠狐尾藻混合青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)以及有氧穩(wěn)定性均有顯著或極顯著影響(P<0.05或P<0.01)。綠狐尾藻混合青貯體系中水稻秸稈添加比例增加降低了發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，葡萄糖添加比例增加會提高發(fā)酵品質(zhì)、改善纖維品質(zhì)，但也會降低青貯飼料中CP含量。綜合來看，70%綠狐尾藻與30%麥麩混合青貯添加2%～6%的葡萄糖可制備發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性性均優(yōu)的青貯飼料；添加5%或10%的水稻秸稈并添加4%的葡萄糖也可制備成本更低、品質(zhì)較好的青貯飼料。