周羽 陳路 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院疾病基因轉(zhuǎn)錄剪切調(diào)控實(shí)驗(yàn)室/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （四川成都 610041）

內(nèi)容提要：量化成像流式細(xì)胞儀具有多參數(shù)、高分辨率成像、高靈敏度以及高通量特點(diǎn)。文章綜述近年來量化成像流式細(xì)胞儀優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及其在免疫細(xì)胞、免疫表型、炎癥及免疫相關(guān)藥物研發(fā)方面的研究。

流式細(xì)胞儀主要應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞、細(xì)菌和微小顆粒物質(zhì)等。利用多參數(shù)測(cè)量，流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)和強(qiáng)弱測(cè)定，反映篩選細(xì)胞的比例或者細(xì)胞表面和內(nèi)部物質(zhì)分布及含量等信息。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞分析基于一定的細(xì)胞上樣量，對(duì)細(xì)胞的分群結(jié)果及細(xì)胞比例展示的是比較宏觀的結(jié)果。而對(duì)于極微量細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞的亞細(xì)胞定位及細(xì)胞中物質(zhì)分布、形態(tài)及大小的分析所獲取的信息量很少。因此流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展關(guān)注精準(zhǔn)性、操作性、檢測(cè)參數(shù)量、純度、通量、靈敏度、流式數(shù)據(jù)展示以及數(shù)據(jù)分析等方面。新一代的流式細(xì)胞儀如量化成像分析流式細(xì)胞儀（ImageStreamXMark Ⅱ）將流式細(xì)胞分析、熒光顯微成像、圖像數(shù)據(jù)獲取及分析軟件結(jié)合一體，可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位熒光信號(hào)采集，最終將細(xì)胞信息進(jìn)行量化成像分析。目前，該儀器已廣泛應(yīng)用于腫瘤、納米材料、免疫、植物、微生物、藥物研發(fā)、外泌體研究以及方法學(xué)方面的研究。

1.量化成像流式細(xì)胞儀介紹

ImageStreamX Mark II量化成像流式儀在傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的液流系統(tǒng)上整合顯微成像技術(shù)，可高效每秒分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞。該儀器也是由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)三部分組成，最高可以升級(jí)配置7根激光器，同時(shí)檢測(cè)12個(gè)通道并采集細(xì)胞圖像。而該儀器的軟件部分涉及儀器操作、數(shù)據(jù)獲取和分析，可以對(duì)采集的每個(gè)細(xì)胞圖像進(jìn)行量化參數(shù)分析，量化參數(shù)結(jié)果可以用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，保證了數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性。儀器操作方面，該儀器具有自動(dòng)激光校準(zhǔn)、自動(dòng)上樣、自動(dòng)開關(guān)機(jī)和清洗功能，同時(shí)具備系統(tǒng)自檢。

2.量化成像流式儀技術(shù)優(yōu)勢(shì)

2.1 獲取細(xì)胞形態(tài)及定位信息

量化成像流式技術(shù)將熒光顯微成像技術(shù)與流式細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞定位及熒光標(biāo)記物進(jìn)行量化分析。儀器的特點(diǎn)主要是采用極限層流技術(shù)最大程度抑制液流中細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)，同時(shí)儀器的檢測(cè)系統(tǒng)是選用廣泛用于宇宙航拍和基于時(shí)間延遲積分技術(shù)的CCD，保障了高速流動(dòng)中細(xì)胞的高分辨率成像效果。此外，成像流式細(xì)胞儀還可以與共聚焦顯微鏡聯(lián)用，通過觀察活細(xì)胞中病毒結(jié)構(gòu)、侵染和復(fù)制機(jī)制，研究病原微生物和宿主的免疫反應(yīng)[1]。因此，流動(dòng)中的每個(gè)細(xì)胞圖像可以被快速捕捉，細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)及物質(zhì)定位信息可被用于后續(xù)分析，豐富了細(xì)胞的形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2.2 精準(zhǔn)細(xì)胞分群

在細(xì)胞分群實(shí)驗(yàn)中，如果能夠同時(shí)結(jié)合細(xì)胞表面特定標(biāo)記物和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)圖像，細(xì)胞分群效果會(huì)更好。傳統(tǒng)的流式分析中通常需要人工圈門，該方法具有重復(fù)性差、耗時(shí)長(zhǎng)、依賴主觀和經(jīng)驗(yàn)判斷等缺點(diǎn)。流式分選時(shí)圈定細(xì)胞群的界線通常是直接在流式散點(diǎn)圖或者柱狀圖上界定分割線，缺乏對(duì)界限附近細(xì)胞準(zhǔn)確的歸屬判斷，而量化成像流式分析可以清晰直觀地觀察界限處細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞熒光學(xué)特征，有效地判斷出圈門的界限，從而更準(zhǔn)確地分選出目的細(xì)胞。在本文關(guān)注的免疫相關(guān)研究的免疫表型分析中，對(duì)免疫細(xì)胞分群圈門的操作中量化成像流式細(xì)胞分析技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。此外，量化成像流式細(xì)胞技術(shù)在稀有細(xì)胞分析方面可以獲得更多細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的圖像信息及其他量化參數(shù)數(shù)據(jù)，有助于稀有細(xì)胞功能的進(jìn)一步研究。

2.3 搭建大數(shù)據(jù)平臺(tái)

傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀上樣系統(tǒng)通常受到限制，需要手動(dòng)將樣本依次放上，而量化成像流式細(xì)胞儀具有96孔板全自動(dòng)上樣功能，同一批樣本可以同時(shí)制樣和上樣，減少了上樣操作的繁瑣性，適合高通量篩選試驗(yàn)。

細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)都可以通過量化成像流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。不僅在細(xì)胞檢測(cè)數(shù)量上可以從幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，還可以精確到每個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)，很大程度地提高了通過流式細(xì)胞技術(shù)獲得數(shù)據(jù)的有效性和效率。

因此，結(jié)合多參數(shù)、高通量篩選系統(tǒng)和每秒幾千個(gè)細(xì)胞的分析速度，通過量化成像流式細(xì)胞儀可以高效獲取海量的細(xì)胞數(shù)據(jù)。并且采集的熒光和形態(tài)學(xué)參數(shù)量化分析數(shù)據(jù)具有客觀統(tǒng)計(jì)意義，有助于醫(yī)院和科研機(jī)構(gòu)分析研究平臺(tái)和大數(shù)據(jù)平臺(tái)的搭建。最重要的是，平臺(tái)的搭建有益于基礎(chǔ)科研和臨床相結(jié)合的研究，用于免疫類疾病及其他各類疾病發(fā)病機(jī)制的研究。

3.量化成像流式細(xì)胞儀在免疫相關(guān)研究中的應(yīng)用

3.1 免疫細(xì)胞功能

人體中各種免疫細(xì)胞發(fā)揮著不同的作用，在抗原呈遞細(xì)胞功能研究中，T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的免疫突觸之間無(wú)法進(jìn)行成像分析，而量化成像流式技術(shù)可以獲取量化成像信息，從而對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。Habtamu等[2]通過成像流式儀分析抗原誘導(dǎo)下T細(xì)胞-單核細(xì)胞偶聯(lián)來研究結(jié)核患者的免疫調(diào)控作用。成像流式細(xì)胞技術(shù)還可以識(shí)別淋巴細(xì)胞中抗原相關(guān)結(jié)合蛋白定位信息來判斷免疫細(xì)胞激活狀態(tài)。此外，該技術(shù)也應(yīng)用在單核細(xì)胞趨化、自然殺傷細(xì)胞功能障礙、淋巴細(xì)胞中物質(zhì)定位和脾細(xì)胞滲透性等研究中[3-6]。因此，在免疫細(xì)胞功能研究中，量化成像流式細(xì)胞技術(shù)主要利用成像功能對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行圖像信息采集和分析。

3.2 免疫表型分析

利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合前向角散射光、側(cè)向角散射光和細(xì)胞標(biāo)志物熒光特征參數(shù)，在相應(yīng)的散點(diǎn)圖中設(shè)置不同的門來區(qū)分出不同的細(xì)胞群。而基于成像流式細(xì)胞儀對(duì)白細(xì)胞亞群分析進(jìn)行方法學(xué)研究，可以較準(zhǔn)確地區(qū)分不同的亞群。在1型糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究中，通過量化成像流式儀可以觀察抗CD20藥物治療后細(xì)胞亞群分類及表達(dá)量[7]。Rao等[8]通過量化流式分析檢測(cè)二肽基肽酶-IV和免疫表型，研究巨噬細(xì)胞中調(diào)節(jié)二肽基肽酶-IV表達(dá)途徑，結(jié)果表明通過靶向調(diào)節(jié)二肽基肽酶-IV表達(dá)途徑可能是減少二肽基肽酶-IV引起的炎癥的新策略。

3.3 炎癥反應(yīng)

炎癥的發(fā)生通常與免疫細(xì)胞的激活相關(guān)，而炎癥小體在人體免疫反應(yīng)和炎癥發(fā)生過程中具有重要作用。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白與胞質(zhì)傳感器蛋白組裝與炎癥小體的形成相關(guān)，炎癥小體的形成可以激活caspase-1，促進(jìn)IL-1β/IL-18的釋放。其中凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白聚集濃縮后形成凋亡相關(guān)斑點(diǎn)復(fù)合物，用傳統(tǒng)熒光顯微鏡分析該復(fù)合物是經(jīng)典的評(píng)估炎癥小體活化的指標(biāo)。但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)且樣本量少，開發(fā)靈敏快速的檢測(cè)方法是提高炎癥小體相關(guān)疾病臨床評(píng)估能力的手段。Lage等[9]構(gòu)建了一種基于成像流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白斑點(diǎn)成像方法，同時(shí)可以檢測(cè)活化的caspase-1在凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白多聚體中的分布。該方法已在多種免疫性疾病、炎癥類疾病和阿爾茨海默癥中都有廣泛的應(yīng)用。在對(duì)41例多發(fā)性硬化癥患者的研究中發(fā)現(xiàn)尿酸鈉晶體可以激活炎癥小體[10]。Nagar等[11]在細(xì)胞群和單細(xì)胞水平對(duì)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白斑點(diǎn)和caspase-1活性進(jìn)行定量檢測(cè)，量化信息包括斑點(diǎn)頻率、面積以及細(xì)胞分布等。

3.4 藥物研發(fā)

量化成像流式儀可用于細(xì)胞的攝取、靶向定向運(yùn)輸以及細(xì)胞結(jié)合情況的藥物治療作用研究。在單抗藥物研發(fā)中，研究人員需要評(píng)估克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎疾病中抗β7整合素單抗etrolizumab藥物的安全性和有效性。通過細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)合量化成像流式儀進(jìn)行功能性動(dòng)態(tài)體外黏附實(shí)驗(yàn)，對(duì)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞因子分泌進(jìn)行分析，有助于闡明藥物阻滯作用和免疫學(xué)機(jī)制[12]。在口服藥效研究中，Pocock等[13]結(jié)合成像流式細(xì)胞技術(shù)和紫外熒光光譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇狀的顆粒狀載體更容易穿透黏液層。在生物制藥研究領(lǐng)域，Pekle等[14]開發(fā)了細(xì)胞系中成像流式分析技術(shù)檢測(cè)重組重鏈和mRNA，可用于篩選高產(chǎn)量的克隆細(xì)胞系。在疫苗研發(fā)方面，Schetters等[15]通過成像流式細(xì)胞儀鑒定骨髓來源的樹突狀細(xì)胞的內(nèi)吞能力，同時(shí)區(qū)分膜上熒光和胞內(nèi)熒光來跟蹤受體的內(nèi)在化，發(fā)現(xiàn)小鼠DC-SIGN/CD209a可作為抗原呈遞和適應(yīng)性免疫的靶點(diǎn)。此外，量化成像流式細(xì)胞技術(shù)可以展現(xiàn)藥物作用后細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞代謝、增殖及凋亡等信息，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)及流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)將數(shù)據(jù)進(jìn)行定量，從而應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選試驗(yàn)。

4.小結(jié)

與傳統(tǒng)流式細(xì)胞分析儀相比，量化成像流式細(xì)胞儀具有高通量、數(shù)據(jù)量化、細(xì)胞成像等特點(diǎn)，已在免疫疾病及免疫相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究中應(yīng)用較多。觀察免疫細(xì)胞之間相互作用，分析細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白含量及定位信息，可以作為免疫激活信號(hào)檢測(cè)或者疾病診斷標(biāo)志。目前，量化成像流式檢測(cè)炎癥小體技術(shù)在神經(jīng)類疾病、免疫及炎癥中應(yīng)用廣泛。而在免疫細(xì)胞功能研究、免疫表型分析及藥物研發(fā)方面，量化成像流式細(xì)胞也起到了重要的作用。同時(shí)，儀器在細(xì)胞學(xué)功能研究中還包括細(xì)胞周期、微核計(jì)數(shù)、細(xì)胞形變和趨化等。

量化成像流式細(xì)胞術(shù)作為細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域強(qiáng)有力的分析工具，已應(yīng)用在藥物研發(fā)過程中細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察及靶點(diǎn)篩選，對(duì)免疫疾病中細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)及代謝通路研究提供進(jìn)一步的量化成像數(shù)據(jù)支持。

因此，科學(xué)研究中基于成像信息的流式分析技術(shù)的研究手段可用于解決復(fù)雜的科學(xué)問題和臨床檢測(cè)方法的技術(shù)開發(fā)。這將不僅限于免疫類疾病發(fā)病機(jī)制、檢測(cè)技術(shù)以及治療手段的研究，而同時(shí)可以開發(fā)該技術(shù)用于其他類疾病及多種交叉學(xué)科的應(yīng)用。此外，該技術(shù)可以完善流式細(xì)胞分析分選平臺(tái)設(shè)備功能應(yīng)用，進(jìn)一步促進(jìn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)及科研平臺(tái)細(xì)胞高通量分析及大數(shù)據(jù)采集平臺(tái)的搭建。這有利于基于細(xì)胞成像的流式技術(shù)用于疾病的診斷和治療學(xué)科研究方向的發(fā)展。