陳愛亮

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

食品欺詐（Food fraud）是指企業(yè)或個人故意在食品的完整性方面欺騙他人以獲取不正當(dāng)經(jīng)濟(jì)利益的行為[1]。近年來，隨著食品工業(yè)化發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的全球化，食品供應(yīng)鏈也越來越復(fù)雜，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動下，用低成本低質(zhì)量食品冒充高價值高質(zhì)量食品的食品欺詐事件頻頻發(fā)生，幾乎發(fā)生在所有的食品領(lǐng)域[2]，包括動物類產(chǎn)品，如肉類、乳品、水產(chǎn)品、蜂蜜；植物類產(chǎn)品，如果汁、紅酒、食用油、谷物以及中藥材、植物性膳食補(bǔ)充劑、香料等。而且標(biāo)簽錯誤率居高不下，如在意大利銷售的加工肉制品和魚片上標(biāo)簽錯誤比例分別高達(dá)57%和42.8%[3～4]；在美國銷售的肉制品、對蝦產(chǎn)品、山羊乳制品則分別有高達(dá)35%、24.4%和80%的標(biāo)簽錯誤率[5～7]。2020年，全球各地仍然發(fā)生了多起馬肉冒充牛肉事件。在國內(nèi)，研究人員們對來自30種不同品牌的153份烤鱈魚片樣本進(jìn)行了脫氧核糖核酸（DNA）檢測，發(fā)現(xiàn)58%的樣本存在被其他低值魚類冒充或標(biāo)簽錯誤的情況[8]；對市場上銀鱈魚和南極犬牙魚進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)85%的產(chǎn)品存在假冒或標(biāo)簽錯誤的情況[9]。根據(jù)美國消費品牌協(xié)會的數(shù)據(jù)，大約10%的商業(yè)化生產(chǎn)的食品受到了食品欺詐的影響。

食品真實性鑒別（Food authentication）是指通過對食品的組成性質(zhì)等進(jìn)行分析，驗證其是否符合其標(biāo)簽所示成分、營養(yǎng)等信息的過程。應(yīng)對食品欺詐，執(zhí)行相關(guān)食品欺詐法規(guī)都需要食品真實性鑒別技術(shù)的支撐。近年來，一系列食品真實性鑒別技術(shù)被開發(fā)出來用于食品欺詐分析[2]，按技術(shù)原理主要分為4類，即化學(xué)方法、物理方法、蛋白質(zhì)方法和DNA方法?；瘜W(xué)方法主要通過分析食品的組成成分對食品進(jìn)行真實性鑒別，如利用色譜—質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)、紅外光譜和拉曼光譜技術(shù)等分析食品內(nèi)特征代謝物成分，其主要用于食品摻假、替代、稀釋、增強(qiáng)等改變食品成分組成的食品真實性鑒別分析。食品中的穩(wěn)定同位素以及礦物元素組成主要與食品產(chǎn)地有關(guān)，因此穩(wěn)定同位素和礦物元素分析技術(shù)主要用于食品產(chǎn)地的溯源鑒別。蛋白質(zhì)和DNA技術(shù)，尤其是DNA技術(shù)，主要用于食品中物種源性成分的分析，如歐洲馬肉摻假鑒別最主要應(yīng)用的技術(shù)就是DNA分析技術(shù)。

從應(yīng)用場景來分，這些技術(shù)又可以分為兩類，一類是需要精密儀器和復(fù)雜操作步驟的技術(shù)，主要應(yīng)用于專業(yè)的實驗室，如穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)、高分辨率核磁共振技術(shù)等。另一類是基于DNA分析的熒光定量PCR技術(shù)、基于抗原抗體的ELISA技術(shù)以及正在發(fā)展的便攜式光譜技術(shù)，這些技術(shù)更適用于普通實驗室，甚至是現(xiàn)場的快速檢測。尤其是歐洲馬肉風(fēng)波以后，歐洲各國政府認(rèn)識到有必要開發(fā)更多的基于DNA的分析技術(shù)，并在官方實驗室中進(jìn)行應(yīng)用，將DNA技術(shù)確立為驗證食品真實性和執(zhí)行食品成分、標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)立法的常規(guī)檢測手段。本文概述了DNA分析技術(shù)在食品真實性鑒別中的重要性，綜述了物種特異性單一DNA標(biāo)記主要類型及目前常用的擴(kuò)增檢測技術(shù)優(yōu)缺點，并探討了基于物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測的食品真實性鑒別技術(shù)的未來發(fā)展趨勢。

一、DNA分析技術(shù)在食品真實性鑒別中的重要性

選擇DNA分析作為食品真實性鑒別的主要技術(shù)，尤其是食品中物種源性成分鑒定的主要技術(shù)，是因為鑒別食品的成分首先需要鑒別食物是什么種類。相對于質(zhì)譜等其他具體成分分析技術(shù)而言，DNA分析技術(shù)具有簡單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點。DNA作為生物的遺傳物質(zhì)決定了生物種屬差異，且兩個物種在進(jìn)化上距離越遠(yuǎn)，DNA差異也就越大。DNA分析技術(shù)甚至可以被用來進(jìn)行生物的個體鑒定，如畜產(chǎn)品個體溯源等。

蛋白質(zhì)、代謝物、礦物元素等容易受氣候、環(huán)境以及食品加工過程影響而發(fā)生變化，相對而言，DNA則從動植物生長到成熟到深加工制品整個食物鏈上都具有非常好的一致性和深加工熱穩(wěn)定性，而且DNA在生物體的不同部位也都完全一致，使其成為食品真實性鑒別和溯源的最佳標(biāo)志物之一[10]。

20世紀(jì)90年代初，英國農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和食品部（MAFF）開始資助研究開發(fā)檢測食品欺詐的分析方法，其中包括應(yīng)用法醫(yī)DNA圖譜來確定食品的真實性。但直到2003年歐洲馬肉風(fēng)波發(fā)生后，才真正推動了DNA技術(shù)在食品真實性鑒別中的應(yīng)用和發(fā)展。DNA分析技術(shù)早期的應(yīng)用包括從基因序列中簡單鑒定單個肉類和魚類物種，以用于食品真實性鑒別。如今DNA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到更廣泛的食品、農(nóng)產(chǎn)品、飼料真實性分析，包括植物源性食品鑒別（如果汁摻假）、轉(zhuǎn)基因食品（GMO）鑒別、植物品種鑒定（如印度巴斯馬蒂香米鑒別）、過敏原檢測、病原微生物的檢測與鑒定等。

目前，應(yīng)用于食品真實性分析的DNA分析技術(shù)主要分為3類。第1類是基于物種特異性單一DNA標(biāo)記的核酸擴(kuò)增分析技術(shù)。這類技術(shù)主要是針對食品中不同物種類型鑒別，這些物種通?？梢院Y選到單一DNA標(biāo)記，通過PCR或者等溫擴(kuò)增等方法實現(xiàn)簡單快速的鑒定。第2類是基于DNA多態(tài)性位點的指紋圖譜分析技術(shù)。這類技術(shù)主要針對近緣物種或者同一物種內(nèi)部不同品種進(jìn)行分析，需要依據(jù)多個DNA多態(tài)性位點進(jìn)行DNA指紋圖譜分析以實現(xiàn)鑒別，主要包括微衛(wèi)星技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性技術(shù)等。第3類是基于DNA條形碼的測序分析技術(shù)。DNA條形碼作為物種鑒別的科學(xué)依據(jù)，尤其適合用于外觀形態(tài)遭受破壞的食品物種源性成分的鑒別，而且其作為非靶向性檢測方法，結(jié)合高通量測序，在混合食品中物種成分鑒定方面愈來愈受重視。

目前，基于DNA分析的食品真實性鑒別技術(shù)主要用于食品欺詐中物種源性成分分析，由于食品欺詐行為種類方式復(fù)雜多樣，因此針對特定的食品欺詐行為選擇合適的鑒別方法成為食品真實性鑒別的挑戰(zhàn)之一，有時可能需要多種方法聯(lián)用才能確定食品的真假以及來源。

二、物種特異性單一DNA標(biāo)記

物種特異性單一DNA標(biāo)記是指某物種特有的一段DNA序列，其在物種間的變異程度足夠可以通過PCR擴(kuò)增等技術(shù)手段與其他物種鑒別開，即通過檢測某一個目標(biāo)DNA片段達(dá)到識別食品中某個物種成分的目的。單一DNA標(biāo)記檢測技術(shù)因簡單、快速、直接，成為食品真實性定性鑒別的主要手段。當(dāng)然，選用單一DNA標(biāo)記進(jìn)行鑒別的前提是能夠找到具有物種特異性的DNA片段并且通過擴(kuò)增技術(shù)檢測出來。

（一）線粒體DNA標(biāo)記線粒體脫氧核糖核酸（mtDNA）或植物葉綠體等細(xì)胞器DNA和核染色體DNA（nDNA）區(qū)域都已經(jīng)被用于進(jìn)行物種鑒定，但使用線粒體DNA標(biāo)記的應(yīng)用更多。原因在于：一是動物線粒體DNA具有更強(qiáng)的種間和種內(nèi)變異性[11]， 它是單倍體非重組DNA， 呈母系遺傳[12]，突變率比核染色體DNA高5～10倍，因此容易尋找到用于鑒別不同物種甚至是近緣物種的種屬特異性DNA標(biāo)記。二是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在大量的線粒體，每個細(xì)胞中線粒體數(shù)量大概從幾百到幾千個，而核染色體上DNA靶標(biāo)的豐度則要少得多。這樣對于同樣數(shù)量的樣品，線粒體DNA更多，容易分離獲得，也就意味著更好的靈敏度，適用于量少的樣品。三是相比于核染色體DNA，線粒體DNA對溫度、壓力抗性更強(qiáng)，更穩(wěn)定、抗降解，因此更適用于長期久置的樣品（如頭發(fā)、骨骼以及牙齒等）以及加熱、加壓、加工處理后的食品。

與核染色體基因組相比，線粒體基因組較小，在動物中線粒體基因組全長一般16 000 bp，因此相對容易尋找合適的物種特異性DNA標(biāo)記。目前已經(jīng)報道了許多線粒體DNA標(biāo)記被用于物種的鑒別，其中最常用的是細(xì)胞色素b（Cytb）和D-loop。Cytb是整個線粒體基因組中最保守的區(qū)段，而D-loop則是物種間變異最大的區(qū)段，因此成為物種鑒別中最常用的目標(biāo)DNA標(biāo)記。其他常用的線粒體基因組標(biāo)記還包括12S rRNA、16S rRNA、COI、ND4、ATP6、ATP8、ND5、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)等。例如，2013年馬肉風(fēng)波后，歐盟推薦的鑒別馬肉的實時熒光定量PCR方法選擇的目標(biāo)基因片段即為線粒體DNA（ND4基因，NADH脫氫酶亞單位4）上的87 bp片段，經(jīng)過實驗驗證，該區(qū)域有足夠的變異可以將馬肉特異性擴(kuò)增，而其他哺乳動物、鳥類、魚類等動物，以及植物類大豆、玉米、蔬菜等共46種動物和7種植物均沒有擴(kuò)增信號。

（二）核染色體DNA標(biāo)記除了線粒體DNA，近年來也有一些核染色體DNA標(biāo)記被篩選出來用于物種的鑒別，多用于定量分析。除了篩選物種特異性DNA片段外，篩選多個物種或者所有物種通用的DNA標(biāo)記在物種鑒別中也起到非常重要的作用。這類引物有時可以作為簡化多重鑒別操作的手段[13～14]，有時也可以作為檢測某一類物種的標(biāo)記片段或者作為檢測的內(nèi)參質(zhì)控手段。有時線粒體DNA無法滿足要求，需要從核染色體上尋找合適的DNA標(biāo)記。例如，為了區(qū)分動物與植物，經(jīng)常選用動物編碼肌球蛋白的DNA片段來對動物源性成分進(jìn)行檢測，其可以用于素食食品的鑒別。

另外近緣物種之間線粒體基因組非常相似，例如，歐洲野豬（Sus scrofa scrofa）和家豬（Sus scrofa domesticus）兩個物種線粒體基因組有99%的同源性（根據(jù)BLAST），而且只有一個位點突變，因此不能用于物種鑒定。這時可以從核染色體上尋找一些特定的性狀基因（如顏色決定基因MCR1）進(jìn)行鑒別[15～16]或者選擇DNA多態(tài)性標(biāo)記（如微衛(wèi)星位點）進(jìn)行鑒別[17]。

此外，線粒體數(shù)目通常在同一生物體的組織之間或來自不同個體的同一組織之間存在差異，在不同的細(xì)胞中數(shù)目也不同且高度可變，因而使得利用線粒體DNA標(biāo)記進(jìn)行食品摻假定量分析時的誤差變大。而核染色體DNA通常有更穩(wěn)定的拷貝數(shù)，不同組織、不同細(xì)胞間拷貝數(shù)一致，用來進(jìn)行食品摻假定量分析也就更為準(zhǔn)確[18～19]。目前，常用的核染色體物種鑒定DNA標(biāo)記有哺乳動物生長激素受體（Growth hormone receptor，GHR）[18]、管家基因復(fù)制蛋白A1（Housekeeping gene replication protein A1，RPA1）[20]、核F2基因內(nèi)含子[21]、HEG1基因[22]、LHB基因[23]、藏紅花Mg-protoporphyrin monomethyl ester cyclase基因[24]、蜜蜂核基因組蜂王漿蛋白2（MRJP2）基因[25]等。另外，有些通用的核染色體單拷貝DNA標(biāo)記也被篩選出來作為摻假定量分析的參考?xì)w一化基因，例如哺乳動物/家禽肌肉生長抑制素基因[18，23]、魚通用基因a-skeletal actin[26]、魚類肌肉組織主要蛋白質(zhì)小清蛋白（Parvalbumin）的核基因內(nèi)含子[27]、魚PanI基因片段[28]等。

雖然單一DNA標(biāo)記更為簡單直接，開發(fā)檢測方法也更為容易，但這類標(biāo)記主要適用于種屬的鑒別，因為在進(jìn)化中已經(jīng)發(fā)展出足夠的種間變異用于區(qū)分不同的物種。很多情況下，同一種屬內(nèi)不同品種之間因為親緣關(guān)系較近，難以找到某單一DNA片段具有足夠的基因變異可以區(qū)分不同的品種，這時候就需要采用多個DNA標(biāo)記，一般是DNA多態(tài)性標(biāo)記來進(jìn)行食品的真實性鑒別。

三、物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測技術(shù)

目前，用于物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測的技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)兩類。

（一）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)現(xiàn)代DNA分析是建立在核酸擴(kuò)增（NAA）技術(shù)基礎(chǔ)上的，聚合酶鏈反應(yīng)則是核酸擴(kuò)增最主要的技術(shù)，具有設(shè)計簡單、靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點，包括第一代終點法PCR和第二代實時熒光定量PCR方法。

1.終點PCR法。終點PCR方法作為第一代PCR方法，需要依靠凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小進(jìn)行鑒定。最初物種鑒定方法都是基于終點PCR方法開發(fā)的，例如利用這種方法發(fā)現(xiàn)了我國臺灣地區(qū)羊奶粉里摻牛奶粉的概率在25%，羊奶片的摻假率在50%[29]；利用同樣的方法在捷克羊奶酪產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了牛奶成分摻假[30]；在埃及水牛奶鑒別中發(fā)現(xiàn)有14%完全是純牛奶，還有38%是摻假了牛奶的水牛奶[31]。終點法的優(yōu)點是擴(kuò)增片段長度不受限制可以從100 bp到1 000 bp，因此可以針對不同靶標(biāo)設(shè)計不同長度的擴(kuò)增片段，在同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過電泳分離根據(jù)片段大小進(jìn)行多重檢測[32～33]。終點PCR方法的缺點是PCR完成后還需要通過凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，操作復(fù)雜。

2.實時熒光定量PCR技術(shù)。實時熒光定量PCR技術(shù)作為第二代PCR技術(shù)，通過摻入熒光染料或者采用熒光探針的方式，觀察熒光信號的強(qiáng)度實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生，避免了傳統(tǒng)終點PCR方法依賴電泳觀察的繁雜操作步驟。同時，其具有半定量或者相對定量的優(yōu)點，而且在精密度、分析速度、靈敏度和自動化方面也都有更好的性能，已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、食品安全和分子診斷學(xué)中不可或缺的研究工具，也成為當(dāng)前食品真實性鑒別中最主要的技術(shù)。

目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于動植物源性成分鑒定的熒光定量PCR方法，常見肉類、魚類、植物物種源性鑒定的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等也都已經(jīng)發(fā)布。利用熒光定量PCR進(jìn)行物種鑒別是通過觀察熒光擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷，理論上，檢測到針對待測樣品的熒光探針擴(kuò)增信號被認(rèn)為是陽性反應(yīng)，但是由于PCR方法高度靈敏，因此在實際中，經(jīng)常設(shè)定一個報告陽性結(jié)果的Ct閾值，避免潛在因為污染等原因造成的假陽性結(jié)果。

2013年馬肉風(fēng)波后，歐盟最先推薦的就是利用熒光定量PCR方法進(jìn)行牛肉中馬肉的鑒別，而且給出了具體的引物探針序列和操作方法標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（SOP），如前所述，該方法對馬肉鑒別非常特異，低至0.1%的馬肉也可以準(zhǔn)確的檢出。

3.多重PCR方法。在很多情況下，食品摻假經(jīng)?？赡軗接卸喾N可能的成分，因此需要開發(fā)多重PCR方法，同時檢測多個指標(biāo)。多重定量PCR方法主要分為3類：第1類是傳統(tǒng)PCR方法，根據(jù)不同鑒別對象擴(kuò)增后產(chǎn)生的片段大小的不同，可以通過電泳進(jìn)行鑒別[32，34～36]。第2類是通過Taqman探針法熒光定量PCR，這類方法主要依靠設(shè)計多個波長的熒光探針，實現(xiàn)多重檢測[37～38]。第3類是染料法熒光定量PCR，也稱為熔解曲線法（High resolution melt，HRM）。不同物種DNA片段擴(kuò)增Tm值不同，通過熔解曲線進(jìn)行鑒別。例如，利用通用引物對Cytb基因148 bp片段進(jìn)行擴(kuò)增，可以同時對牛、羊、家豬、馬、穴兔、雞、野生火雞和鵪鶉肉類進(jìn)行鑒別[39]。SOARES等[40]以中華蜜蜂和意大利蜜蜂的16SrRNA基因為靶點，開發(fā)了基于高分辨率熔解分析的實時PCR方法用于兩種蜂蜜的鑒別。目前利用線粒體不同DNA標(biāo)記，已經(jīng)開發(fā)了很多多重肉類[41～44]、奶類[45]的鑒別方法。

但是基于PCR擴(kuò)增的DNA分析方法在實際應(yīng)用中會遇到一些因素的限制，例如依賴復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀器；復(fù)雜食品樣本在提取時會有抑制PCR擴(kuò)增的抑制劑從而影響擴(kuò)增效率等。為了解決這些問題，近年來多種基于等溫擴(kuò)增的DNA分析方法被發(fā)展起來。

（二）等溫擴(kuò)增技術(shù)等溫擴(kuò)增方法不需要熱循環(huán)過程和復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，與傳統(tǒng)的PCR方法相比，擴(kuò)增效率更高，因此擴(kuò)增時間更短。同時有研究表明，由于使用了與傳統(tǒng)Taq酶不同的、在等溫條件下擴(kuò)增的DNA聚合酶，其對復(fù)雜基質(zhì)（如食物和臨床樣本）中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典PCR抑制劑具有更強(qiáng)的耐受性，也就意味著等溫擴(kuò)增方法可以最大限度地簡化樣本前處理過程[46～47]。再加上不需要昂貴復(fù)雜的熱循環(huán)儀器和擴(kuò)增時間的縮短，使得等溫擴(kuò)增方法更適合于開發(fā)現(xiàn)場快速便攜式的鑒別方法。

目前已經(jīng)開發(fā)出基于多種原理的等溫擴(kuò)增方法，如鏈置換擴(kuò)增（SDA）技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增（CPA）技術(shù)、依賴解旋酶DNA等溫擴(kuò)增（HDA）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)等。其中比較成熟且常用的技術(shù)包括LAMP技術(shù)和RPA技術(shù)。

1.LAMP技術(shù)。LAMP通常在60～65℃條件下進(jìn)行，4個內(nèi)部引物加2個外部引物在Bst DNA聚合酶的作用下，利用自動循環(huán)鏈的位移實現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的快速擴(kuò)增。利用實時熒光LAMP方法，在有外引物存在的情況下，通常在15 min左右即可實現(xiàn)擴(kuò)增，30 min檢測完畢。同時由于采用了4～6條引物，賦予了其擴(kuò)增更高的特異性[48]，加上Bst酶本身對基質(zhì)干擾物的低敏感性，使其獲得了廣泛應(yīng)用。尤其是2020年LAMP技術(shù)專利過期后，該技術(shù)配套各種簡易樣品前處理方法和現(xiàn)場快速檢測裝置，被廣泛應(yīng)用于核酸檢測領(lǐng)域。SUL等[49]開發(fā)了一種基于LAMP的針對16SrRNA基因的方法，用于肉類加工產(chǎn)品中雞肉的快速現(xiàn)場檢測，可從簡易制備的樣品中直接檢測雞肉的存在，基因組靈敏度達(dá)到10 fg。利用LAMP技術(shù)還開發(fā)了鱈魚與油魚[50]，三文魚、大馬哈魚、虹鱒魚[51]，有毒蘑菇[52～54]等系列鑒別方法，并且通過將LAMP與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了多種奶產(chǎn)品的多重檢測[55]。

LAMP技術(shù)不足之處在于需要針對4～6個目標(biāo)序列設(shè)計引物，因此引物設(shè)計過程相對復(fù)雜，同時由于多引物的存在，需要注意潛在的引物—引物非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽性，需要仔細(xì)設(shè)計引物以及調(diào)整體系的引物濃度，開發(fā)起來相對PCR要復(fù)雜一些。此外，復(fù)雜的擴(kuò)增過程產(chǎn)生串聯(lián)擴(kuò)增產(chǎn)物，這限制了簡單檢測方法（如瓊脂糖凝膠電泳）的使用，需要應(yīng)用實時熒光等方法[56]。

2.RPA技術(shù)。RPA是一種相對較新的等溫擴(kuò)增技術(shù)，其機(jī)制與PCR相似，但利用重組酶—引物復(fù)合物來識別和引發(fā)鏈位移，從而消除了對熱模板變性的需要，通過指數(shù)放大實現(xiàn)快速擴(kuò)增，通常在20 min內(nèi)完成。同時RPA反應(yīng)溫度一般在37～42℃，對儀器的需求進(jìn)一步降低，結(jié)合新開發(fā)的實時熒光探針以及相對容易的多通道檢測，可滿足現(xiàn)場便攜、多種目標(biāo)快速檢測的需求。而且RPA還可以與試紙條技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)羊肉[57]、牦牛奶[58]等現(xiàn)場快速鑒別。

3.其他等溫擴(kuò)增技術(shù)。目前，其他等溫擴(kuò)增技術(shù)也在食品真實性鑒別方面獲得了應(yīng)用。例如，利用CPA技術(shù)檢測肉類混合物中的羊肉物質(zhì)，其檢測限為1%（w/w）[59]。

相對于PCR技術(shù)，等溫擴(kuò)增技術(shù)以其便于現(xiàn)場應(yīng)用、對于復(fù)雜樣品基質(zhì)抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點，正逐漸成為英國和歐盟食品真實性鑒別執(zhí)法中重點應(yīng)用的技術(shù)。新冠肺炎疫情的爆發(fā)促使現(xiàn)場便攜式乃至家用快速核酸檢測技術(shù)、裝備得到發(fā)展，將等溫擴(kuò)增技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)[60～61]結(jié)合或者集成到微流體裝置中[62～64]，以實現(xiàn)檢測的自動化、集成化，正成為等溫技術(shù)發(fā)展的趨勢。

四、DNA標(biāo)記分析用于深加工食品真實性鑒別的注意事項

需要指出的是，利用DNA標(biāo)記進(jìn)行食品真實性鑒別，尤其是深加工食品的鑒別，選擇的DNA目標(biāo)片段不適宜過長，一般應(yīng)在250 pb以內(nèi)，最好在100 bp左右。這是因為高溫高壓等加工條件能夠?qū)NA切割成短片段，且加工越多，條件也越苛刻，DNA降解越嚴(yán)重，例如，暴露在3.2×105Pa的壓力下會產(chǎn)生大約100 bp的片段。因此，針對深加工制品，設(shè)計的PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段宜短不宜長。當(dāng)然，在生肉或一般熟肉制品中，DNA不會降解那么多，但設(shè)計短DNA片段的方法應(yīng)用更廣，無論加工程度如何，都可以進(jìn)行檢測。為了應(yīng)對DNA目標(biāo)片段被降解，還有一種辦法就是設(shè)計兩個或多個目標(biāo)片段進(jìn)行檢測[65～66]，因為兩個目標(biāo)片段同時都被降解掉的概率非常低，從而保證檢測結(jié)果的可靠性。

目前DNA分析技術(shù)已經(jīng)成為食品真實性鑒別的重要支撐技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于與物種成分相關(guān)的食品真實性鑒別中，最常見的是肉類、奶類、轉(zhuǎn)基因食品、果汁等產(chǎn)品鑒別，這類產(chǎn)品DNA含量豐富，因此檢測相對容易。除了這些產(chǎn)品，基于DNA的真實性分析還被用于一些深加工制品，如葡萄酒[67]、 食用油[68～70]、 蜂蜜[40]等。 當(dāng)然對于這類產(chǎn)品進(jìn)行DNA分析需要優(yōu)化DNA提取方法[70～72]，因為在精煉深加工的過程中大部分DNA被去除[69]，剩余殘存DNA也存在降解嚴(yán)重的情況。因此，宜選用小片段目標(biāo)DNA以及在葉綠體或者線粒體中高拷貝數(shù)的目標(biāo)DNA片段，例如選用高拷貝數(shù)的植物5SDNA間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)作為目標(biāo)片段進(jìn)行菜籽油、玉米油、向日葵和大豆油鑒別，甚至可以對提取的模板進(jìn)一步稀釋達(dá)到減少PCR抑制的目的[68]。

五、未來發(fā)展趨勢與展望

綜上所述，在目前應(yīng)用于食品真實性鑒別的DNA分析技術(shù)中，基于物種單一性DNA標(biāo)記擴(kuò)增的檢測技術(shù)是最為成熟、穩(wěn)定和可靠的技術(shù)，已經(jīng)被用于各類食品物種源性成分的鑒定。而且目前已經(jīng)開發(fā)有商品化的試劑盒，含有進(jìn)行食品物種鑒別的各種試劑，大大方便了食品生產(chǎn)經(jīng)營者以及消費者使用。如德國BIORON Diagnostics GmbH公司和BIOTECON Diagnostics GmbH公司提供了豬肉、駱駝肉、馬肉、牛肉、雞肉、火雞肉、山羊肉、綿羊肉、驢肉、鴨肉、蝦肉和蟹肉等肉類鑒別熒光定量PCR試劑盒，可用于生熟食品以及飼料樣品鑒別。美國Eurofins GeneScan公司也開發(fā)了動物肉類鑒別系列定量PCR試劑盒，包括牛肉與野牛肉、豬肉（包括野豬肉）、牛肉與豬肉、雞肉、火雞肉、鴨肉、鵝肉、山羊肉、綿羊肉、馬肉、水牛肉和驢肉等。國內(nèi)北京新羿生物科技有限公司與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所合作，也推出了可用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、馬肉、驢肉、駱駝肉等常見肉類，以及大西洋鱈魚、太平洋鱈魚、油魚、三文魚、虹鱒魚、大馬哈魚等常見水產(chǎn)品的實時熒光LAMP試劑盒產(chǎn)品。

但是目前大部分熒光定量PCR試劑盒檢測時間長，DNA提取步驟復(fù)雜，一般還需要在實驗室中進(jìn)行，但無論生鮮食品還是熟制食品，其容易腐敗變質(zhì)的特性都需要現(xiàn)場快速的食品真實性鑒別方法，以不影響食品銷售等活動。如前所述，近年來針對物種特異性單一DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測的熒光定量PCR技術(shù)和等溫擴(kuò)增技術(shù)在便攜快速檢測方面都取得了很大的進(jìn)步。尤其是全球新冠疫情促進(jìn)了現(xiàn)場乃至家用核酸快速檢測技術(shù)的研發(fā)，這些技術(shù)也被平移到食品真實性鑒別領(lǐng)域，提高了食品物種源性成分鑒定的效率。這其中首先是DNA快速提取方法，各種DNA快速提取液的出現(xiàn)，避免了常規(guī)磁珠或膜柱法洗滌洗脫等多步驟操作，食品樣品中加入裂解液，簡單裂解后即可取上清液用于后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。其次在擴(kuò)增方面，等溫擴(kuò)增技術(shù)如LAMP或者RPA技術(shù)等顯現(xiàn)出了比熒光定量PCR更適合現(xiàn)場應(yīng)用的前景。等溫擴(kuò)增技術(shù)不需要復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀器，便于現(xiàn)場應(yīng)用，同時沒有升變溫、變性、復(fù)性的過程，擴(kuò)增效率更高，實時熒光LAMP技術(shù)可在30 min完成擴(kuò)增，而實時熒光R PA更快，可在20min內(nèi)完成擴(kuò)增。而且這兩種擴(kuò)增技術(shù)都采用了實時熒光檢測法，邊反應(yīng)邊檢測，無需后續(xù)電泳或其他方法，結(jié)合快速DNA提取，基本上可以在30 min左右實現(xiàn)從提取到擴(kuò)增檢測全過程。近年來，LAMP及RPA技術(shù)還和微流控芯片、納米材料以及生物傳感器結(jié)合，開發(fā)了更加自動化、集成化、便攜式的現(xiàn)場快速檢測裝置，更進(jìn)一步提高了檢測的效率，其中等溫擴(kuò)增技術(shù)和試紙條技術(shù)相結(jié)合，具有快速簡單、成本低等優(yōu)點，在食品真實性鑒別中顯示出良好的應(yīng)用前景[73～74]。

另外一個重要的問題就是定量和非靶向分析的問題。雖然本文只綜述了目前基于DNA標(biāo)記擴(kuò)增檢測的食品真實性定性鑒別方法，但是定量分析對食品摻假鑒別來說尤為重要。主要是因為目前基于單一DNA標(biāo)記的核酸擴(kuò)增方法靈敏度非常高，基本上1%甚至0.1%都能檢測出來。而這種含量很低的情況很多是由于和其他種類食品共用生產(chǎn)線，沒有清洗干凈而發(fā)生的無意沾染現(xiàn)象，并不是蓄意摻假。因此，為了更好的監(jiān)管和執(zhí)法，避免假陽性的情況，需要對食品摻假進(jìn)行定量分析。除了定量，還有一個需要解決的問題是非靶向分析，即在食品摻假物種未知的情況下，可以對食品所包含的種類進(jìn)行鑒定，避免因為摻假物種未知無法檢測，出現(xiàn)假陰性的情況。目前已經(jīng)開發(fā)了一些基于DNA分析的食品摻假定量分析和非靶向分析方法，如熒光定量PCR、數(shù)字PCR、DNA條形碼、高通量測序技術(shù)等，但這些技術(shù)還不是非常成熟，處于發(fā)展完善之中。

除了商品化試劑盒促進(jìn)應(yīng)用，進(jìn)一步開發(fā)現(xiàn)場便攜式技術(shù)以及定量和非靶向分析方法之外，食品真實性鑒別與原來食品安全檢測相比，屬于一個比較新的領(lǐng)域，在標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面還需要進(jìn)一步加強(qiáng)。雖然我國已經(jīng)在國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中制定了一系列食品、飼料物種源性成分的熒光定量PCR鑒定方法，但目前還不能形成體系，不能滿足市場檢測需求。同時作為參考物質(zhì)的食品真實性鑒別用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)樣品，市面上還幾乎沒有，因此也需要盡快研制常見食品種類的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)，提高鑒定的準(zhǔn)確性，最后形成一套比較完整的食品真實性鑒別技術(shù)體系。