魏熒 孫麗 劉洋 李悅

流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病（DM）可增加心力衰竭的發(fā)生風險及發(fā)生率。心力衰竭作為DM患者的主要死亡原因，多見于沒有明顯冠狀動脈疾病的DM 患者，表現(xiàn)為射血分數(shù)保留型心力衰竭[1]。這種有DM 相關心臟結構功能改變的心肌病被稱為糖尿病心肌病（DCM）。心肌胰島素信號轉導受損、線粒體功能障礙、氧化應激、鈣調節(jié)受損、炎性反應、微血管功能障礙等都與DCM 的發(fā)生和發(fā)展有關[2]。DCM 起病隱匿，最初特征為心肌能量代謝異常、心肌纖維化、重構導致心肌舒張功能障礙，最終進展為有明顯癥狀的難治性心力衰竭。目前DCM 的治療采用常規(guī)的抗心力衰竭治療方法，缺乏針對其機制的有效治療方法，且強化降糖治療并沒有改善DM 患者心功能或降低心力衰竭的發(fā)生率[3]，因此，需要深入探究DCM 發(fā)病機制并轉化為臨床干預措施。

外泌體是直徑為30～150 nm、具有雙層磷脂膜結構的細胞外囊泡（EVs），由多囊泡體與質膜融合釋放至胞外。外泌體攜帶蛋白質、脂質、核酸及代謝產(chǎn)物等多種生物活性分子，并可將其傳遞至受體細胞[4]。有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)中微小RNA（miRNA）主要來源于脂肪組織，以外泌體形式在組織間傳遞，且這種形式的miRNA 更加穩(wěn)定[5]。不同病理生理條件下，外泌體成分、數(shù)量及動力學發(fā)生變化，可反映細胞和微環(huán)境的狀態(tài)，獨特的生物學特性使外泌體在心血管領域顯示出良好的臨床前景[6]。本文回顧外泌體與DCM 發(fā)病、診療相關的研究進展。

1 外泌體在DCM發(fā)生中的作用

1.1 外泌體與心肌代謝重構

DCM 本質是代謝性心臟病。健康的心肌細胞利用脂肪酸（60%～70%）、葡萄糖和酮體等作為產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的主要原料，心肌細胞根據(jù)生理條件的變化，改變底物供應以適應代謝需求。DM 時胰島素絕對或相對缺乏，心肌細胞胰島素信號轉導受損，葡萄糖利用障礙，而脂肪酸代謝增多，心肌細胞幾乎全部以β 氧化為能量來源，耗氧量增加而ATP 生產(chǎn)效率降低，引起脂質蓄積，進而導致脂肪酸誘導線粒體解偶聯(lián)，鈣處理異常損傷線粒體氧化呼吸鏈，使生成的活性氧超出清除能力，加重心肌細胞、線粒體功能損傷和自噬。心肌喪失底物利用的靈活性及由此產(chǎn)生的下游損傷是DCM 代謝重構的關鍵[7]。外泌體可在周圍組織和器官中協(xié)調胰島素信號轉導級聯(lián)反應，Katayama等[8]發(fā)現(xiàn)DM 患者外周血中外泌體miR-20b-5p 水平增加，在人原代骨骼肌細胞中過表達miR-20b-5p可抑制人蛋白激酶B 相互作用蛋白（AKTIP）、信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）及糖原合成酶的表達，損傷胰島素介導的葡萄糖代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠血漿[9]、DM 鼠脂肪組織[10]和DM 鼠巨噬細胞[11]中的外泌體miRNA 可降低肝臟、骨骼肌等靶器官的胰島素敏感性，干擾葡萄糖穩(wěn)態(tài)。Wen 等[12]發(fā)現(xiàn)肥大的脂肪細胞來源的外泌體miR-802-5p 可降低大鼠原代心室肌細胞葡萄糖攝取及蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，通過生信分析篩選，雙熒光素酶報告基因確認miR-802-5p 靶向抑制熱休克蛋白（HSP）60 表達。敲除HSP60 或過表達miR-802-5p 可增加心肌細胞氧化應激水平和未折疊蛋白反應，導致心肌胰島素抵抗，應用胞吞抑制劑細胞松弛素D（cytochalasin D）或抑制miR-802-5p 表達可逆轉上述變化。外泌體不僅參與胰島素信號轉導，還攜帶葡萄糖及脂類代謝相關分子，有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)EVs 數(shù)量與三酰甘油水平呈正相關，反映葡萄糖和脂質代謝狀態(tài)[13]。在缺乏葡萄糖的條件下，心肌細胞來源外泌體裝載葡萄糖轉運蛋白（GLUT4）和糖酵解酶類，并將其轉運至內皮細胞，參與心肌與內皮細胞的通訊，實現(xiàn)應激下蛋白質互補[14]。Li 等[15]發(fā)現(xiàn)自發(fā)性2 型糖尿病（T2DM）db/db 小鼠及DM 心力衰竭人群心臟及循環(huán)中miR-320 表達上調，通過重組腺相關病毒載體抑制miR-320 表達可改善db/db 小鼠心臟功能，減少心肌細胞凋亡，富集在心肌細胞核的miR-320 可增強脂肪酸轉運蛋白（CD36）轉錄，可能通過促進心肌脂質蓄積加重DCM 舒張功能障礙。心肌脂肪變性是T2DM 患者心臟舒張功能的獨立預測因子[16]，其發(fā)生早于心臟功能異常。1 項納入86 例受試者的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-1 和miR-133a 可預測T2DM 心肌脂肪變性，miR-133a 水平與心肌脂肪變性程度呈正相關[17]。高脂喂養(yǎng)小鼠體內及脂質處理的HL-1 心肌細胞外泌體中也發(fā)現(xiàn)了miR-133a 水平增加，miR-133a 有望成為T2DM 亞臨床心血管并發(fā)癥的標志物。

外泌體中線粒體功能蛋白高達10%，肥胖DM大鼠脂肪組織來源外泌體內線粒體蛋白、脂質和核酸含量更高[18]。外泌體線粒體內容物轉運在DCM 中的作用尚不明確。腫瘤相關研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞釋放的含有線粒體功能障礙的外泌體轉移至受體細胞，可介導化療耐藥[19]；癌細胞微環(huán)境產(chǎn)生的包裹線粒體DNA 的外泌體促進癌細胞增殖、轉移；利用外泌體輸出線粒體可實現(xiàn)細胞內容物的質量控制，恢復細胞內穩(wěn)態(tài)。外泌體調節(jié)DCM 心肌細胞線粒體功能還需要進一步研究。

1.2 外泌體與冠狀動脈微循環(huán)功能障礙

DCM 患者的心肌病變與冠狀動脈粥樣硬化無關，可能與冠狀動脈微循環(huán)障礙有關[2]，表現(xiàn)為毛細血管密度降低，心肌纖維化，炎性反應水平增加，一氧化氮（NO）等內皮舒張因子介導的血管舒張功能降低，內皮和平滑肌細胞功能障礙，冠狀動脈血流儲備減少。db/db 小鼠血清中有富含精氨酸酶-1 的外泌體，可被內皮細胞攝取并損害內皮依賴性血管舒張功能[20]。DM 心肌可分泌損傷內皮功能的外泌體，從非肥胖型T2DM 大鼠中分離的心肌細胞衍生外泌體富含miR-320，可降低內皮細胞中HSP20、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的表達，抑制內皮細胞增殖和遷移，減少血管生成[21]。DM內皮細胞來源外泌體同時也可調節(jié)心肌細胞功能，Hu 等[22]發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的心肌微血管內皮細胞分泌的外泌體富含哺乳動物STE20 相關激酶1（MST1）蛋白，可抑制心肌細胞自噬，促進細胞凋亡，干擾GLUT4 膜轉位，進而抑制葡萄糖攝?。辉隗w實驗也證實與野生型DM 鼠相比，內皮特異性MST1轉基因小鼠的胰島素抵抗更嚴重，心臟舒張功能更差。

1.3 外泌體與心臟結構重構

心肌纖維化和肥厚是DCM 的主要病理結構改變，影像學檢查及尸檢組織病理學證實DM 相關心力衰竭患者早期出現(xiàn)左室質量增加及心肌纖維化。DM 異常代謝狀態(tài)、炎性反應等激活轉化生長因子-β（TGF-β）通路，改變凋亡相關分子的表達，使正常自噬受損、細胞外基質降解失調，導致過量的基質蛋白在心肌間質聚積[23]。心肌細胞與成纖維細胞、脂肪細胞通過外泌體間接參與心肌纖維化進程，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）增加心肌成纖維細胞來源外泌體中miR-21-3p 水平并促進外泌體釋放增加，外泌體miR-21-3p 可上調心肌細胞AngⅡ受體和腎素、血管緊張素水平，加重心肌病理性肥 大[24]。在冠狀動脈結扎和阿霉素誘導心力衰竭大鼠模型中均可觀察到心肌細胞外泌體miR-208a 表達上調，可被成纖維細胞攝取，并抑制雙特異性酪氨酸磷酸化調控激酶2（DYRK2）的表達，進而參與心肌纖維化[25]。Zou 等[26]利用miRNA 芯片技術確定高脂與正常飲食小鼠心臟差異性表達的miRNA，證實脂肪源性miR-410-5p 下調心肌中Smad7 表達，激活TGF-β/Smad2 信號通路，促進纖維化的發(fā)生，抑制miR-410-5p 可減輕肥胖小鼠的心肌纖維化。體外高糖處理的巨噬細胞的外泌體中人抗原R（HuR）含量更高，利用短發(fā)夾RNA（shRNA）降低HuR 表達可減輕炎性反應及成纖維細胞的纖維化水平；將C57BL/6 分為兩組，分別給予db/db 小鼠骨髓源巨噬細胞（BMM?）來源外泌體和HuR 缺乏的db/db 小鼠BMM? 來源外泌體后發(fā)現(xiàn)，后者可顯著減輕AngⅡ誘導的心肌纖維化，外泌體攜帶HuR 可能成為DM 心肌纖維化的靶 標[27]。研究發(fā)現(xiàn)部分外泌體miRNA 具有保護作用，心力衰竭人群及動物模型中循環(huán)miR-30d 水平降低，Li 等[28]利用慢病毒、轉基因等方法減少 miR-30d 表達，結果顯示缺血性心力衰竭鼠模型心肌纖維化程度及心肌細胞凋亡減少；體外實驗中，原代心室肌細胞在缺氧早期分泌富含miR-30d 的EVs，通過靶向整合素α5 抑制成纖維細胞增殖活化。運動可增加DM 小鼠心肌細胞外泌體 miR-29b、miR-455 水平，這些miRNA 與基質金屬蛋白酶-9 存在結合位點，可抑制其表達，進而減輕心肌纖維化[29]。

2 外泌體在DCM中的診斷潛力

DCM 無典型的形態(tài)學改變、血清標志物和臨床表現(xiàn)，癥狀通常與其他并發(fā)癥相互重疊，診斷尚無統(tǒng)一標準。外泌體形成高效、靶向、非免疫原性細胞間通訊系統(tǒng)，使其有望用于DCM 機制研究和診治。DM 與DM 伴心力衰竭患者血液中外泌體內容物的種類及含量存在差異[30]，可提示DM 相關的心臟病理改變，如EVs 中Rap1 蛋白（一種小GTP 酶）數(shù)量與代謝綜合征嚴重程度呈正相關，可用于預測高風險人群心血管事件風險[31]，T2DM患者循環(huán)中的多種外泌體中血管生成相關miRNA（miR-193b-3p、miR-199a-3p 等）表達失調[32]。目前利用外泌體對DCM 進行早期診斷的研究較少，主要集中在尋找DCM 患者的miRNA 生物標志物，而循環(huán)中miRNA 主要存在于外泌體中[5]。對參加CECSID 臨床試驗的男性DM 患者及年齡匹配的非DM 患者進行5 年縱向研究，發(fā)現(xiàn)DCM 心臟重構進展程度與循環(huán)血漿miR-122-5p 水平呈正相關（P＝0.03），原因可能是miR-122-5p 能調節(jié)基質金屬蛋白酶進而影響細胞外基質水平[33]。Tao 等[34]觀 察266 例T2DM 患 者 發(fā) 現(xiàn)，DCM 患 者 血 漿miR-21 較非DCM 患者更低，miR-21 對DCM 的預測和診斷效率明顯優(yōu)于糖化血紅蛋白等參數(shù)，過表達miR-21 可有效改善線粒體生物發(fā)生，減少心肌細胞凋亡。影像學結合生物標志物如外泌體miRNA 檢測有望成為預測、診斷及評估DCM 進展的新工具。另外，不同的外泌體和miRNA 分離技術、測序平臺會影響實驗結果，細胞外RNA 通訊聯(lián)盟（ERCC）正努力解決這些問題，開發(fā)基于外泌體miRNA 的診療方法[30]。

3 外泌體與DCM治療

經(jīng)過基因修飾的外泌體可逆轉心肌損傷。在心臟中特異性過表達HSP20 可顯著降低鏈脲霉素誘導DCM 模型的心功能異常和心室重構，這種保護作用可被外泌體抑制劑GW4869 減弱，HSP20可能通過增加外泌體保護性蛋白磷酸化AKT（pAKT）、超氧化物歧化酶1（SOD1）等水平，減少高糖條件下的心肌和內皮細胞損傷。從心臟特異性過表達HSP20 轉基因動物分中離出的心肌細胞可通過外泌體自分泌及旁分泌方式改善DCM心臟功能[35]。Wang 等[21]利用熒光素酶報告基因發(fā)現(xiàn)DM 心肌細胞來源外泌體miR-320 可負向調節(jié)內皮細胞HSP20 表達，抑制血管生成。外泌體miR-320/HSP20 信號途徑或將成為DCM 治療的新靶標。Gan 等[36]發(fā)現(xiàn)存在DM 時脂肪細胞來源EVs 中的miR-130b-3p 是介導心肌缺血/再灌注損傷的關鍵分子，心肌內注射miR-130b-3p 抑制劑可減少DM 小鼠心肌梗死面積及心肌細胞凋亡水平。miR-130b-3p 負向調節(jié)靶基因5'-腺嘌呤核苷酸依賴性蛋白激酶α2（AMPKα2），可抑制多種抗凋亡、心臟保護分子的表達，阻斷病理條件下EVs 介導的脂肪組織與心肌信號交流,減輕DM 心臟損傷。

近年來干細胞療法在DCM、缺血性心臟病損傷等心血管疾病治療中受到廣泛關注。干細胞和祖細胞來源的外泌體生物療法目前仍處于實驗階段，成年人心肌祖細胞、人胚胎干細胞和間充質干細胞來源的外泌體在減輕心肌缺血/再灌注損傷、減少心肌細胞凋亡和改善免疫調節(jié)等方面顯示出治療潛 力[37]。Barile 等[38]檢測22 例無冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者心房組織，發(fā)現(xiàn)心肌祖細胞EVs 中外泌體為主要成分，可改善心肌梗死小鼠心臟功能，增加血管生成。高血糖可刺激內皮祖細胞、骨密質來源干細胞及心臟祖細胞EVs 的轉錄組改變[39]。研究發(fā)現(xiàn)，注射間充質干細胞來源的外泌體可顯著降低DM 鼠左室膠原蛋白水平，減少脂肪酸轉運蛋白和β 氧化酶的表達，通過抑制TGF-β1/Smad2 信號通路改善DM 鼠心肌損傷及纖維化。內皮祖細胞外泌體可顯著降低DM 鼠血清中氧化應激及炎性標志物水平，改善內皮依賴的舒張功能[40]。

外泌體參與DCM 的多種發(fā)病機制，人工改變外泌體內容物及利用干細胞來源外泌體對DCM 的治療作用在體內外實驗中得到證實。此外，外泌體靶向輸送藥物也成為近期研究熱點，但仍缺乏大型臨床試驗研究，在優(yōu)化外泌體分離方法、體內檢測追蹤方面仍存在問題，不良反應尚不明確。