李夢園，孔令非

（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院a.腫瘤內(nèi)科；b.病理科，河南 鄭州 450003）

選擇性剪接是真核基因中普遍存在的轉(zhuǎn)錄后過程，也是少量基因產(chǎn)生大量mRNA并加工成結(jié)構(gòu)、功能不同的蛋白質(zhì)亞型的重要機(jī)制［1］。在癌細(xì)胞中，正常的選擇性剪接調(diào)節(jié)受到干擾，導(dǎo)致癌癥特異性RNA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，促使癌細(xì)胞增殖、遷移、死亡逃避和凋亡［2-3］。近期多項(xiàng)有關(guān)實(shí)體瘤的研究表明，癌癥特異性剪接模式歸因于異常調(diào)節(jié)的剪接因子［4］。這使干擾癌癥發(fā)展的剪接因子備受關(guān)注［5-6］。核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族是關(guān)鍵的選擇性剪接調(diào)節(jié)因子，已鑒定出包括hnRNP A～U在內(nèi)的約20個(gè)關(guān)鍵成員，它們可以通過RNA結(jié)合域（RNA binding domains，RBDs）識別特定RNA序列，使pre-mRNA成熟為穩(wěn)定的功能性mRNA［7-8］，從而參與腫瘤的代謝等生物學(xué)過程。該家族蛋白表達(dá)紊亂可導(dǎo)致靶凋亡基因功能受損，使細(xì)胞異常增殖，增強(qiáng)細(xì)胞耐藥性［9］。hnRNP U在該過程中表達(dá)明顯異常［10］，提示了hnRNP U在腫瘤診斷和治療方面的潛在價(jià)值。

1 hnRNP U的結(jié)構(gòu)和功能

hnRNP U位于1號染色體q44，是hnRNPs家族中分子量最大的磷酸化蛋白質(zhì)，由825個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為90.584 kD。其C端存在富含甘氨酸的RNA結(jié)合域，并含有一段重復(fù)的RGG序列，稱為RGG box［11］。hnRNP U也被稱為SAF-A，其蛋白中包含骨架/基質(zhì)相關(guān)區(qū)（S/MAR）特異性雙向DNA結(jié)合域，可以選擇性地結(jié)合DNA核骨架附著區(qū)。hnRNP U通常與RNA、DNA和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，以復(fù)合物的形式參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)過程。hnRNPU可與RNA結(jié)合，通過增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)mRNA的表達(dá)，或與mRNA直接結(jié)合后參與mRNA的形成過程［12］。隨著對分子研究的進(jìn)一步深入，hnRNP與mRNA的特異性結(jié)合位點(diǎn)也被逐漸發(fā)現(xiàn)。

hnRNP U在哺乳動物的多種生理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Xist基因是哺乳動物X染色體失活起始過程中的關(guān)鍵基因，hnRNP U的RGG box能特異性識別Xist RNA，這種特異性識別維持了X染色體中Xist RNA的累積，這對X染色體的失活是必須的［13］。這表明hnRNP U是Xist RNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)、參與X染色體失活的重要因子。hnRNP U 不僅具備一般hnRNPs蛋白的功能，還能與DNA及蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合，通過獨(dú)特的作用模式發(fā)揮各種生物學(xué)功能。其與S/MAR DNA的特異性結(jié)合，參與DNA在核骨架中的定位和停泊過程［14］，與隨體DNA（satDNA）結(jié)合，參與了染色質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)的形成過程［15-16］。在蛋白水平上，hnRNP U與蛋白結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，并與RNA聚合酶Ⅱ的高磷酸化C端重復(fù)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，影響初始轉(zhuǎn)錄物或DNA模板的形成［17-19］。除此之外，hnRNP U還與有絲分裂、DNA損傷及凋亡過程有聯(lián)系，可能是潛在的Wilms腫瘤相關(guān)基因［20］。

hnRNP U在多種腫瘤組織中表達(dá)水平升高，通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)或發(fā)生異常選擇性剪接產(chǎn)生致癌性的剪接體，影響細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換等生物學(xué)過程，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前已有較多hnRNP U相關(guān)研究在不同惡性腫瘤中出現(xiàn)。

2 hnRNP U在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

2.1 hnRNP U與肺癌 肺癌被認(rèn)為是最常見的癌癥類型和腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。近年來，盡管肺癌治療的診斷和治療方式均有了顯著改善，但當(dāng)疾病擴(kuò)散到區(qū)域淋巴管時(shí)，預(yù)后仍然很差［21］。在這種情況下，鑒定涉及肺癌轉(zhuǎn)移的基因和分子途徑開辟了肺癌治療進(jìn)展的可能性。hnRNP U在存在真底物蛋白（p-β-連環(huán)蛋白等）的情況下與β-TrCP復(fù)合物分離，兩者分離之后β-TrCP復(fù)合物與p-β-catenin結(jié)合，導(dǎo)致p-β-catenin通過泛素-蛋白酶體途徑降解，細(xì)胞遷移從而受到抑制［22-23］。這一結(jié)論在后續(xù)的細(xì)胞遷移研究中應(yīng)用廣泛。Tseng等［24］發(fā)現(xiàn)生長停滯特異性蛋白7（growth arrest specific protein 7，GAS 7）在肺癌患者中低表達(dá)，且在肺癌細(xì)胞的遷移中發(fā)揮抑制作用，這一作用通過GAS 7C/hnRNP U和GAS 7C/N-wasp的同時(shí)存在來達(dá)成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)尾靜脈注射過表達(dá)GAS 7C細(xì)胞的裸鼠肺表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量明顯少于注射載體對照細(xì)胞組的裸鼠，體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論［24］。在人類GAS 7亞型中，只有GAS 7C具有Src同源結(jié)構(gòu)域3，GAS 7C的過度表達(dá)可隔離hnRNP U，通過β-TrCP泛素降解途徑降低了p-β-catenin蛋白的水平，由此減弱了肺癌細(xì)胞的遷移作用。因此，hnRNP U在GAS 7C抑制肺癌細(xì)胞遷移的過程中起到關(guān)鍵作用。

非小細(xì)胞肺癌是肺癌中占比高且預(yù)后不良的分型。Pan等［25］通過pulldown實(shí)驗(yàn)證明了hnRNP U和LIMD1 mRNA在LIMD1-AS1下拉的產(chǎn)物中富集。雖然LIMD1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，但是其阻礙非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并促使其凋亡的機(jī)制并不清楚。但有研究證實(shí)hnRNP U的敲除降低了肺癌細(xì)胞A549中LIMD1 mRNA和蛋白質(zhì)的水平，同時(shí)縮短了LIMD1 mRNA的半衰期［25］。這表明hnRNP U通過與LIMD1-AS1相互作用來維持LIMD1 mRNA的表達(dá)及穩(wěn)定，從而抑制了非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。這可能有助于為非小細(xì)胞肺癌的分子靶向治療提供新的思路。

2.2 hnRNP U與肝癌 肝癌是常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有原發(fā)性肝腫瘤的75%～85%，盡管HCC的診斷和治療有所改善，但由于其侵襲性和高增殖能力，HCC的預(yù)后仍然很差［26］。導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展的因素很多，表觀遺傳學(xué)是肝癌發(fā)生發(fā)展研究的新熱點(diǎn)。Zhang等［27］發(fā)現(xiàn)hnRNP U在晚期肝癌組織及肝癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯上調(diào)，這種上調(diào)與HCC患者的臨床分期及不良預(yù)后相關(guān)。通過克隆形成、使用CCK8試劑測定細(xì)胞存活數(shù)等增殖實(shí)驗(yàn)證明了在體外肝癌細(xì)胞系中敲除hnRNPU后，肝癌細(xì)胞的增殖活力、耐藥性以及對化療誘導(dǎo)凋亡的抵抗性均明顯下降［27］。小鼠的異種移植實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在體內(nèi)敲除hnRNP U對肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用［27］。c-Myc基因是最常見的原癌基因，具有可使細(xì)胞無限增殖獲得永生化的功能，在細(xì)胞的分化、凋亡和調(diào)控中起著重要的作用［28］。臨床HCC患者樣本中，c-Myc與hnRNP U在mRNA水平上呈正相關(guān)。hnRNP U的啟動子區(qū)域-增強(qiáng)子盒序列（E-box）存在c-Myc結(jié)合位點(diǎn)，且c-Myc與癌癥中的剪接體及異常剪接事件有關(guān)［29-30］。在機(jī)制方面，研究［28］驗(yàn)證了上述結(jié)論，證明了hnRNP U啟動子區(qū)域可與c-Myc結(jié)合，穩(wěn)定了c-Myc mRNA并參與調(diào)節(jié)c-Myc蛋白表達(dá)的過程，同時(shí)驗(yàn)證了c-Myc在調(diào)節(jié)hnRNP U轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮了積極作用。綜上所述，hnRNP U和c-Myc的這種正反饋環(huán)路可能導(dǎo)致了HCC的進(jìn)展及不良預(yù)后，hnRNPU可能作為HCC一種新的診斷和治療靶點(diǎn)。

Liang等［31］發(fā)現(xiàn)hnRNPU在HCC中表達(dá)上調(diào)，且hnRNP U的上調(diào)與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)。敲低hnRNP U后，HCC細(xì)胞的增殖在體內(nèi)外均受到抑制。機(jī)理上，通過染色質(zhì)免疫共沉淀、雙熒光素酶報(bào)告、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等實(shí)驗(yàn)證明了hnRNP U與細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子CDK2基因位點(diǎn)結(jié)合，其中H3K27乙?；╝cetylation of lysine 27 on histone H3，H3K27ac）、H3K9乙?；╝cetylation of lysine 9 on histone H3，H3K9ac）和H3K4單甲基化富集。此外，敲低hnRNP U降低了結(jié)合位點(diǎn)的H3K27ac和H3K9ac水平，H3K27三甲基化水平增加，最終導(dǎo)致CDK2下調(diào)。這項(xiàng)研究結(jié)果提出了一種新的機(jī)制，即hnRNP U通過增強(qiáng)CDK2的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)HCC的發(fā)展。

2.3 hnRNP U與胰腺癌 胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是世界范圍內(nèi)人類惡性腫瘤中最致命的癌種之一，多數(shù)患者在診斷時(shí)即發(fā)現(xiàn)處于疾病晚期或已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。PDAC的5 a總生存率低于6%，即使是最先進(jìn)的化療也只能提供有限的生存益處［21，32］。因此，迫切需要開發(fā)針對這種疾病的創(chuàng)新靶向分子療法，以提高PDAC的治療效果。蛋白編碼基因的突變無疑啟動和促進(jìn)了PDAC的發(fā)生，然而非編碼RNA也發(fā)揮了一定的作用。Sutaria等［33］發(fā)現(xiàn)了一種由hnRNP U加工轉(zhuǎn)錄的lncRNA（C1orf199/ncRNA00201），與正常和良性標(biāo)本相比，胰腺癌細(xì)胞系中hnRNP U處理的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量顯著增加。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)證明敲除hnRNP U的轉(zhuǎn)錄本后可減少胰腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲［33］。同時(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)hnRNP U的敲除可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞中hnRNP U的轉(zhuǎn)錄本ncRNA00201表達(dá)量明顯減少［33］。這表明hnRNP U作為一種RNA結(jié)合蛋白，可以直接或間接調(diào)節(jié)其加工轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。hnRNP U作為RNA結(jié)合蛋白與hnRNP U的轉(zhuǎn)錄本相互作用，阻止其處理的轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞中降解［34-35］。另一項(xiàng)研究對臨床PDAC患者樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與預(yù)后良好的患者相比，預(yù)后不良的PDAC患者標(biāo)本中hnRNP U處理的轉(zhuǎn)錄本lncRNA表達(dá)量增加，說明hnRNP U處理的轉(zhuǎn)錄本與患者的預(yù)后不良相關(guān)［36］。綜上可知，hnRNP U及其處理的轉(zhuǎn)錄本促進(jìn)了胰腺癌的進(jìn)展并可作為預(yù)后預(yù)測分子，有利于胰腺癌的診斷和治療。

2.4 hnRNP U與黑色素瘤 黑色素瘤是由皮膚中黑素細(xì)胞產(chǎn)生的惡性腫瘤，其特征是高度侵襲和遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移。黑色素瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散傾向?qū)е禄颊呖傮w生存率較低，占所有皮膚癌相關(guān)死亡的79%。黑色素瘤的發(fā)病率逐年上升，轉(zhuǎn)移的患者生存期僅6～9個(gè)月，5 a生存率不及5%［37］。研究腫瘤發(fā)病和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對改善腫瘤患者的預(yù)后至關(guān)重要。在黑色素瘤中，Mazur等［38］證明了hnRNP U是膠溶蛋白Gelsolin的分子伴侶。膠溶蛋白是一種多功能肌動蛋白結(jié)合蛋白，存在于細(xì)胞入侵足的前緣或細(xì)胞核中，主要負(fù)責(zé)腫瘤細(xì)胞的遷移，其高表達(dá)與黑色素瘤的不良預(yù)后相關(guān)［39-40］。使用來自黑色素瘤細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物和核組分裂解物的復(fù)合物通過液相色譜/質(zhì)譜分析及免疫共沉淀的方法，鑒定出與內(nèi)源性膠溶蛋白相互作用的新蛋白伙伴hnRNP U。hnRNP U與膠溶蛋白的抗體共同對A357和WM9兩種黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行染色后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的有絲分裂期間hnRNP U與膠溶蛋白的共定位現(xiàn)象。這進(jìn)一步證實(shí)了hnRNP U與膠溶蛋白之間存在直接的相互作用。以上內(nèi)容揭示了hnRNP U與膠溶蛋白互為分子伴侶，其與膠溶蛋白共同參與了黑色素瘤的進(jìn)展過程。

2.5 hnRNP U與神經(jīng)母細(xì)胞瘤 神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見的顱外實(shí)體腫瘤，占兒童癌癥死亡原因的15%。對于高危病例，盡管進(jìn)行多模式治療，患者的生存率仍然很低。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，致癌基因的激活或抑癌基因的失活有助于腫瘤細(xì)胞中糖酵解基因的表達(dá)，因此研究有氧糖酵解的調(diào)控因子對提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療效率具有重要意義。Song等［41］發(fā)現(xiàn)與正常背根神經(jīng)節(jié)相比，42個(gè)原發(fā)神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中，hnRNP U、CCCTC-結(jié)合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）、HNF4A、CXCR4或TPBG表達(dá)較高，CLU或UACA水平較低且腫瘤組織或血清中HNF4A-as1水平高的患者生存率較低。HNF4A-AS1、hnRNPU和CTCF的表達(dá)與42例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的生存顯著相關(guān)［42］。CTCF是廣泛存在于真核生物中的多功能轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞的生長、增殖及腫瘤的發(fā)生相關(guān)。該研究使用生物素標(biāo)記RNA下拉和質(zhì)譜分析、RNA免疫沉淀法、免疫共沉淀及雙分子熒光互補(bǔ)等體外實(shí)驗(yàn)證明了lncRNA HNF4A-AS1可與hnRNP U的RGG結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)了由hnRNPU介導(dǎo)的CTCF的反式激活，進(jìn)而調(diào)控了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的有氧糖酵解過程，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲性［41］。CTCF與某些因子的結(jié)合可以造成致癌轉(zhuǎn)錄［42］，而hnRNP U作為特異性因子與CTCF發(fā)生相互作用激活CTCF，從而繼發(fā)轉(zhuǎn)錄失調(diào)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。由此可知，hnRNP U與CTCF的結(jié)合導(dǎo)致了lncRNA HNF4A-AS1及其他與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄改變。通過lncRNA HNF4A-AS1反過來促進(jìn)了CTCF與hnRNP U的結(jié)合。這表明HNF4A-AS1/hnRNP U/CTCF軸在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。

3 小結(jié)與展望

近年來，隨著研究方法的進(jìn)步，人們逐漸認(rèn)識到在轉(zhuǎn)錄水平上，選擇性剪切因子在表觀遺傳及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，剪切因子也成為了近年腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有許多剪接因子抑制劑的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。hnRNP U作為選擇性剪切因子，也是hnRNPs家族中的重要成員，被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的進(jìn)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)。這提示了hnRNP U作為惡性腫瘤標(biāo)志物在治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值及惡性腫瘤診斷和預(yù)后判斷中的重要意義。對于hnRNP U介導(dǎo)的異常轉(zhuǎn)錄和異常選擇性剪接已有較多研究，然而其與蛋白質(zhì)分子結(jié)合發(fā)揮特定生物學(xué)功能的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。