姜紹文 謝青

根據(jù)2020年12月WHO發(fā)布的全球最新癌癥負擔數(shù)據(jù)，原發(fā)性肝癌是發(fā)病率居第6位的惡性腫瘤，而其死亡率更是高居第3位[1]。WHO估計2030年全球?qū)⒂谐^100萬人死于原發(fā)性肝癌，而肝細胞肝癌(HCC)是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型，約占所有原發(fā)性肝癌的85%[2]。我國是肝病大國，HCC發(fā)病率和死亡率均占全球的一半左右，疾病負擔極為沉重[3]。HCC起病隱匿、進展迅速，大多數(shù)患者在首次確診時已處于疾病中晚期，失去了根治的機會，遠期預后差。而早期篩查、早期診斷、早期治療對于改善HCC患者預后、提高根治率和長期生存率至關(guān)重要。令人沮喪的是，我國大陸地區(qū)早期HCC[巴塞羅那臨床肝癌分期(BCLC) 0/A期]的診斷構(gòu)成比僅為33%，總體生存期23個月，5年生存率僅11.7%～14.1%[3]。目前臨床上HCC的早期篩查主要依賴于腹部超聲檢查聯(lián)合外周血清標志物[如甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原(DCP/PIVKA-Ⅱ)等]檢測。然而這些單一的血清學標志物即使聯(lián)合超聲檢查，診斷早期HCC的能力仍無法令人滿意，發(fā)現(xiàn)小肝癌(直徑≤2 cm)的敏感度更有較大改善空間。因此，臨床急需敏感度和特異度更高的、便于反復檢測、動態(tài)監(jiān)測的新型無創(chuàng)HCC早期篩查標志物。

液體活檢指對外周循環(huán)中的腫瘤副產(chǎn)物進行分子生物學分析，以獲取原發(fā)腫瘤相關(guān)信息的技術(shù)，包括外周血、尿液、胸腔積液、腹腔積液等體液中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)游離RNA(cfRNA)及外泌體等成分[4]。液體活檢在肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌等腫瘤中的研究已顯示其具有良好的臨床應用前景[5]。近年來，HCC領(lǐng)域內(nèi)有關(guān)液體活檢的研究也逐漸增多，涵蓋HCC的早期篩查和診斷、預后評估、疾病進展及復發(fā)監(jiān)測、療效預測等諸多方面，成為眾多學者關(guān)注的一大熱點。本文對液體活檢在HCC早期篩查中的作用及研究進展作一綜述。

一、CTCs

CTCs由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤釋放進入外周血而形成。每天有大量CTCs進入血液循環(huán)，但僅少于0.01%的CTCs最終存活，并形成致命性轉(zhuǎn)移灶。CTCs半衰期一般為1.0～2.4小時，大多數(shù)CTCs因免疫攻擊、剪切力、失巢效應而消亡，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者中CTCs僅占外周血細胞的十億分之一，這給CTCs的研究帶來巨大困難[4-5]。幸運的是，隨著科學技術(shù)的不斷進步，鑒別、分離、分析CTCs特征的方法學也取得一定突破。目前檢測CTCs的平臺主要基于CTCs的物理特性(如密度、電荷、變形能力)或生物學特性(主要為細胞表面的各種標志物)，而CellSearchTM是唯一通過美國食品藥品監(jiān)督管理局認證的CTCs檢測系統(tǒng)[4-5]。該系統(tǒng)主要利用CTCs表面的上皮細胞粘附分子(EpCAM)對其進行識別和檢測，但HCC患者中EpCAM陽性率較低，再加上存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，因此該方法可能低估CTCs的實際數(shù)量[5-6]。

一項大型臨床研究檢測受試者(HCC和肝硬化/慢性乙型肝炎+健康對照)外周血中腫瘤相關(guān)基因的定量表達，構(gòu)建了源于CTCs的聚合酶鏈反應(PCR)評分用于HCC患者的診斷[7]。此研究證明該評分診斷HCC的效力高于AFP(截斷值為20 ng/ml)：CTC-PCR評分診斷HCC的敏感度為72.5%，特異度為95%，受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.88，而該隊列中AFP診斷HCC的敏感度為57%，特異度為90%，AUC為0.77。此外，該評分診斷早期HCC的表現(xiàn)同樣可觀：BCLC 0期對應的AUC為0.92，BCLC A期對應的AUC為0.86。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)CTCs聯(lián)合AFP可進一步提高診斷HCC的能力：AFP以400 ng/ml為截斷值區(qū)分慢性肝病和HCC的AUC為0.67，CTCs對應的AUC為0.77，而二者聯(lián)合之后的AUC被提高至0.82[6]。但總體而言，鑒于CTCs在患者外周血中的數(shù)量極少，且與原發(fā)腫瘤負荷呈正相關(guān)，CTCs在HCC早期篩查、早期診斷方面的應用存在較大挑戰(zhàn)，更多的研究支持CTCs用于HCC的預后預測及疾病進展、術(shù)后復發(fā)的動態(tài)監(jiān)測[8]。

二、ctDNA

談及ctDNA，不可避免地要先提到細胞游離DNA(cfDNA)。cfDNA長度約160～180 bp，主要源于循環(huán)中的淋巴細胞和其他死亡的良性宿主細胞。ctDNA則是特指源于壞死和凋亡的腫瘤細胞的DNA片段，在cfDNA中只占很小一部分[5]。目前的技術(shù)從cfDNA中分離ctDNA仍存在困難。ctDNA檢測技術(shù)可分為靶向(如PCR)和非靶向技術(shù)(如全基因組測序)，前者對已知的特定基因敏感度高，后者可提供更為全面、綜合的遺傳信息[9]。因ctDNA包含與原發(fā)腫瘤相同的遺傳學改變(包括DNA甲基化、突變和拷貝數(shù)量變異)，ctDNA檢測在HCC早期篩查、早期診斷方面展示出廣闊的應用前景。

DNA甲基化改變尤其是抑癌基因CpG島的甲基化改變，在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。已有大量研究表明多種不同基因的甲基化異常對HCC的診斷效力優(yōu)于AFP。Xu等[10]檢測HCC患者和健康對照者外周血ctDNA特定位點的甲基化水平，開發(fā)了一個基于10個甲基化基因的HCC診斷模型，其在驗證集中檢出HCC的敏感度和特異度分別為83.3%、90.5%，AUC達0.944。另一項由HOXA1、EMX1、ECE1、AK055957、PFKP和CLEC11A等6個異常甲基化基因構(gòu)成的診斷模型，經(jīng)不同臨床隊列多期驗證，被證明可實現(xiàn)極高的HCC診斷效力：敏感度為95%，特異度為92%，AUC為0.96[11]。此外，也有研究報道5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)檢測技術(shù)在早期HCC診斷中也有著不錯的表現(xiàn)。Cai等[12]通過基于cfDNA全基因組5-hmC檢測數(shù)據(jù)開發(fā)并驗證了一個HCC診斷模型，其區(qū)分慢性肝病和早期HCC的AUC為0.85，明顯優(yōu)于AFP(AUC為0.69)。

基因編碼區(qū)突變可致轉(zhuǎn)錄過程異常，最終可能引起蛋白質(zhì)序列改變及腫瘤發(fā)生，這為基因突變檢測用于HCC篩查提供了理論基礎(chǔ)[9]。但因腫瘤早期ctDNA入血含量低，且HCC驅(qū)動基因不明、異質(zhì)性高，使基于ctDNA突變檢測的方法篩查早期HCC的可行性面臨挑戰(zhàn)，故研究中一般將其與蛋白標志物聯(lián)合以提高診斷效能。2018年Cohen等[13]通過建立“CancerSEEK”的方法分析包括肝癌(HCC和肝內(nèi)膽管細胞癌)在內(nèi)的多種腫瘤的16個高頻突變基因，同時檢測了8種蛋白標志物，能夠有效地從對照組中識別腫瘤患者。CancerSEEK對其中44例肝癌的敏感度和特異度分別為97%和60%，對其中5例早期肝癌的敏感度為100%。2019年，一項基于社區(qū)人群的大型前瞻性研究通過聯(lián)合cfDNA的體細胞突變、HBV整合、cfDNA濃度及AFP、DCP與性別、年齡等多種因素開發(fā)了一個名為“HCCscreen”的液體活檢方法[14]。研究中將HBsAg陽性、AFP>20 ng/ml或(和)超聲檢測到肝臟可疑結(jié)節(jié)，但增強MRI/CT未診斷為HCC的人群定義為高危人群。在此類高危人群組成的訓練集中，HCCscreen顯示了良好的診斷效力(敏感度為85%，特異度為93%，AUC為0.93)。而在331例AFP正常、超聲未見可疑結(jié)節(jié)的HBsAg陽性患者組成的驗證集中，該模型成功識別出全部4例HCC患者，且4例均為腫瘤早期(結(jié)節(jié)直徑<3 cm)，診斷敏感度為100%，特異度為94%。

此外，全基因組測序/二代測序技術(shù)為我們提供了更加全面、綜合的cfDNA特征譜，可進一步提高HCC的檢出率。2022年，Zhang等[15]通過全基因組測序獲取外周血漿中cfDNA的片段大小分布特征，經(jīng)生物信息學處理構(gòu)建了肝惡性腫瘤的診斷模型。在189例肝惡性腫瘤(絕大部分為HCC)和164例非腫瘤對照組成的驗證集中，該模型識別出肝惡性腫瘤的敏感度為96.8%，特異度為98.8%，AUC高達0.995。其對早期HCC的診斷同樣出色，對應的敏感度為96.2%。除cfDNA片段大小分布，全基因組測序技術(shù)還可提供拷貝數(shù)變異、核小體印記、末端序列等更為豐富的特征參數(shù)，多種cfDNA特征參數(shù)的聯(lián)合及與cfDNA甲基化、蛋白標志物的聯(lián)合，也成為探索更精準的HCC診斷模型的新方向。Chen等[16]在一個來自中國11個省份13家醫(yī)院、合計3 204例受試者的大型隊列中，基于全基因組測序和5-hmC檢測技術(shù)構(gòu)建了多組學多維度的HIFI評分系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)包括5-hmC、末端序列、片段分布、核小體印記等多個參數(shù)，其區(qū)分HCC和非HCC的敏感度達95.42%，特異度達97.83%，AUC高達0.996。值得一提的是，對于AFP或DCP陰性的患者，HIFI的敏感度也高達90.9%～96.9%，可有效降低HCC的臨床漏診率；而對于極早期(BCLC 0期)和早期(BCLC A期)HCC，HIFI的檢出敏感度和特異度(88.9%、94.4%)均顯著優(yōu)于AFP(22.2%、16.7%)及DCP(55.6%、61.1%)。

三、cfRNA

微小RNAs(miRNAs，miR)是一類由約22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，可與靶基因結(jié)合，通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解mRNA調(diào)節(jié)基因表達，是近年來研究最廣泛的HCC生物標志物之一[4]。目前已有至少超過70多種miRNAs被報道可作為HCC潛在的標志物[17]。單一高水平表達的miRNAs中，似乎miR-21、miR-199和miR-122在HCC診斷中最有前景[18]，然而有研究也顯示單一的miRNA診斷HCC的效力較有限，包含多種不同miRNAs的聯(lián)合診斷模型能夠大大提高HCC的檢出率。早在2011年，Zhou等[19]就構(gòu)建了一個由7種miRNAs(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801)組成的綜合診斷模型，該模型可將HCC和健康對照、慢性乙型肝炎、肝硬化有效區(qū)分開，對應的AUC分別為0.941、0.842、0.884；其診斷效力不受HCC分期的影響，檢出BCLC 0期、A期、B期和C期對應的AUC分別為0.888、0.888、0.901和0.881。基于此結(jié)果，7種miRNAs檢測試劑盒已于2017年獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的三類器械認證，進入臨床實際應用。近年來包含不同miRNAs的綜合診斷模型不斷被不同的研究團隊開發(fā)、驗證，進一步確認了miRNAs在HCC篩查和診斷中的巨大價值。近期一項研究提出了8種miRNAs組成的新型HCC診斷模型，在HCC高危人群中識別HCC的敏感度為97.7%，特異度為94.7%，幾乎所有(98%)檢出的HCC患者均處于疾病早期[20]。

除miRNAs外，長鏈非編碼RNA(lncRNAs)和環(huán)狀RNAs(circRNAs)在HCC的早期篩查和診斷中也逐漸受到研究者的重視。lncRNA HULC是HCC領(lǐng)域內(nèi)研究最多的lncRNA之一，其在HCC組織內(nèi)和外周血漿中的表達水平明顯高于對照組，有望成為篩查和診斷HCC的新型潛在標志物[21]。lncRNA CTBP和其他RNA組成的聯(lián)合模型[22],LINC00152、XLOC014172、RP11-160H22.5和AFP組成的綜合模型[23]等，都能以相當高的準確性將HCC患者和慢性肝病/肝硬化、健康對照者區(qū)分開。Li等[24]發(fā)現(xiàn)circSMARCA5表達水平在HCC患者血漿中明顯下調(diào)，血漿circSMARCA5表達水平區(qū)分HCC和慢性肝炎、肝硬化的AUC分別為0.853、0.711，當與AFP聯(lián)合后，對應的AUC可提高至0.903、0.858。最新的研究中具有HCC潛在診斷價值的circRNAs還包括hsa_circ_0000437、hsa_circ_0006091、hsa_circ_0027089等[25-27]。

四、外泌體

外泌體是一種納米級大小的細胞外囊泡，其內(nèi)容物包含RNA、DNA和蛋白質(zhì)，主要負責細胞間的信息交流，在HCC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[5]。由于磷脂雙層膜的保護，外泌體的內(nèi)容物不易降解且較穩(wěn)定，使其在腫瘤診斷、預后評估等方面展現(xiàn)出獨特價值。然而相較于cfDNAs，外泌體在HCC早期篩查和診斷中的研究仍處于較為初級的階段，有待于更多數(shù)據(jù)的驗證。Cho等[28]的研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-10b-5p對早期HCC的診斷有較大潛力，其診斷敏感度為90.7%，特異度為75.0%，AUC為0.934。另一項研究基于機器學習，使用血漿中8種外泌體lncRNAs構(gòu)建了一個“HCC分類器”，在訓練集、驗證集、測試集中診斷HCC的AUC分別為0.953、0.983和0.963[29]。Sun等[30]研究顯示，外泌體hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123、hsa_circ_0075792可用于HCC的診斷,三者聯(lián)合后AUC可被提高至0.89，敏感度為90.5%，特異度為78.1%。除上述外泌體非編碼RNA(ncRNAs)，外泌體中的蛋白質(zhì)組分也是診斷HCC的潛在標志物之一，但目前相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少[31]。

五、挑戰(zhàn)和展望

盡管越來越多的研究證實液體活檢技術(shù)在HCC早期篩查中具有廣闊的應用前景，但現(xiàn)階段該技術(shù)距離真正進入臨床仍面臨諸多挑戰(zhàn)：(1)液體活檢包含的標志物種類眾多，必然涉及到多種不同的方法學問題。從樣本的采集、保存、運輸?shù)綐酥疚锏姆蛛x、檢測、分析等多個環(huán)節(jié)，在不同的研究團隊間尚未做到同質(zhì)化、標準化，使得研究結(jié)果的可比性、重復性存疑，因此針對某一類液體活檢標志物建立一個相對簡易、重復性好、標準化的操作流程，對推進液體活檢臨床應用的最終落地意義重大。(2)雖然AFP等傳統(tǒng)血清標志物在HCC早期篩查中的表現(xiàn)無法令人滿意，但其成熟的檢測方法、低廉的檢測成本及廣泛的可及性，仍然使其成為HCC早期篩查不可或缺的手段之一。目前液體活檢技術(shù)需要更為專業(yè)的技術(shù)人員，檢測的經(jīng)濟成本和時間成本明顯高于AFP，這大大限制了其在臨床的推廣普及，故檢測方法的簡化、檢測成本的大幅下降，也是液體活檢必須跨過的一道門檻。(3)現(xiàn)有液體活檢相關(guān)研究中報道的可用于HCC早期篩查的標志物或聯(lián)合診斷模型繁多，但多來自單中心、小樣本、回顧性研究，也缺少不同研究團隊對同一潛在標志物的交叉驗證。而某一新型診斷標志物在進入臨床前必須經(jīng)受住多中心、大樣本、前瞻性隊列研究的考驗，才有可能成為一個被廣泛接受的HCC早期篩查標志物。(4)HCC篩查的主要目的是發(fā)現(xiàn)早期HCC患者，使更多患者獲得根治機會，改善長期預后。所以液體活檢的研究應把重點放在盡可能地提高區(qū)分HCC和慢性肝炎/肝硬化等HCC高危人群的敏感度和特異度，尤其是對早期HCC(BCLC 0/A期)的鑒別能力方面。而先以aMAP、CAMD、PAGE-B等無創(chuàng)評分系統(tǒng)對慢性肝病患者進行HCC的風險分層，在中高風險人群中再以液體活檢篩查HCC，可能進一步提高液體活檢的陽性預測值，更加具有衛(wèi)生經(jīng)濟學價值。(5)某一個或某一類液體活檢標志物對HCC診斷的效能往往比較有限，多維度多組學的綜合診斷模型是進一步提高早期HCC檢出率的發(fā)展方向。液體活檢技術(shù)完全替代目前臨床常用的“AFP+腹部超聲”的篩查組合可能并不現(xiàn)實，如何將液體活檢與現(xiàn)行篩查手段進行有機整合，形成優(yōu)勢互補，是一個值得臨床研究者思考的問題。(6)明確特定液體活檢技術(shù)的適用人群是普適性的還是病因特異性的是液體活檢走向臨床實際應用前必須回答的另一個重要問題。

綜上所述，相對于組織學活檢，液體活檢具有無創(chuàng)、采樣簡單、易于重復采樣、便于實時動態(tài)監(jiān)測、診斷效力明顯高于傳統(tǒng)腫瘤血清學標志物及可獲得更多腫瘤生物學信息、克服HCC高度異質(zhì)性等優(yōu)勢。雖然目前液體活檢技術(shù)仍存在不少有待改進的地方，但毋庸置疑，隨著科學技術(shù)的進步、方法學的改進、費用的降低及更多高質(zhì)量前瞻性臨床研究的驗證，相信液體活檢將在不久的未來進入臨床實際應用階段，在HCC的早期篩查、早期診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，極大優(yōu)化我國HCC患者的臨床管理，為提高HCC早期診斷率和根治率、改善患者長期預后帶來福音。